脫髓鞘病或海綿狀病的診斷的製作方法
2023-04-22 17:26:26 1
專利名稱：脫髓鞘病或海綿狀病的診斷的製作方法
技術領域：
本發明涉及動物和人脫髓鞘疾病和海綿狀腦病的診斷，尤其涉及人BSE以及類似或相關疾病的診斷。
在我們共同申請待審的國際申請WO97/02667中，我們公開了一種新的哺乳動物海綿狀腦病和其它脫髓鞘病症的診斷實驗。公開於我們在先申請中的上述實驗基於一種適用於在人和其他動物中出現的多種形式的病理狀況的發生模型。對於牛海綿狀疾病，該模型提供了一種對基於形成蛋白感染素的目前理論的替換。簡單地說，該新模型基於分子模擬現象，按照該模型，哺乳動物接觸某些具有模擬髓磷脂肽序列的細菌後，會產生一種自動免疫反應。在涉及產生自動免疫反應的細菌中，最重要的是不動桿菌種，尤其是乙酸鈣不動桿菌。基於這種新模型的該診斷實驗開發了早期治療這類感染的可能性，例如，通過應用一種適當的抗生素防止進一步的自動-免疫攻擊動物自身髓磷脂。
在我們的國際申請WO99/47932種，我們已經確證在患多發性硬化(MS)和Creutzfeld-Jacob症(CJD)的患者血清中不動桿菌IgA抗體水平升高。
在我們的在先申請UK 9825948.4中，我們描述了進一步實驗，該實驗確證在死於BSE的牛血清中存在抗牛髓磷脂和抗牛髓磷脂神經微絲的抗體。這些抗體屬於IgA型。在患MS和CJD的患者血清中也得到相似結果。這些結果證實了上述模型的有效性，並可得出這樣的結論，即我們發現了在脊椎動物包括人和其它例如家畜飼養場中的家畜中發生或可能發生的相似疾病的起源的通用模型。我們的最近研究結果還提供了早期證實這些疾病，尤其是牛初始BSE的進一步實驗基礎。這些進一步的實驗可以是對基於檢測針對不動桿菌種，例如乙酸鈣不動桿菌的IgA抗體實驗的替代或補充。
本發明因此包括診斷脊椎動物海綿狀疾病或脫髓鞘疾病，包括BSE、MS和CJD的方法，其包括分析生物樣品中的抗體，尤其是IgA抗體，該抗體結合髓磷脂和/或髓磷脂神經微絲或其抗原(免疫原)部分，包括下文說明的肽成分。
本發明優選包括分析針對脊椎動物例如牛或人類髓磷脂和/或髓磷脂神經微絲的抗體。然而，可以選擇使用來自其它物種的、經評價與結合抗體的牛或人類的髓磷脂和髓磷脂神經微絲具有足夠同源性的那些髓磷脂和髓磷脂神經微絲。
在實施該方法中，陽性結果表示抗體水平在對照樣品的抗體水平之上至少約兩個標準偏差。
本發明還包括一種檢測脊椎動物海綿狀疾病或脫髓鞘疾病的診斷試劑盒，包括例如實驗抗原、髓磷脂或髓磷脂神經微絲或其抗原(免疫原)部分。
前面描述方法中使用的實驗抗原和診斷試劑盒可以是髓磷脂或髓磷脂神經微絲的肽成分，例如具有序列ID Nos1-8的下列序列之一，即，1.NEALEK2.LKKVHEE3.EALEKQL4.ELEDKQN5.EALEKQL 6.KKVHEE 7.EIRDLR 8.EQEIRDLR上述序列已經從蛋白質信息資源(Protein Information Resource)資料庫中提取出來，釋放號為44。
由於IgA抗體在免疫反應中的較高特異性，可以得出這樣的結論，即不動桿菌感染機制是經機體黏膜途徑，原始部位為腸道或鼻腔。可能鼻腔是感染部位，由於吸入由乾燥汙水或動物糞便形成的攜帶不動桿菌的灰塵導致。該機制提示有必要改善家畜飼養工作中的衛生狀況。實驗對前面提到的生物體的分析在前面提到的我們共同申請待審的申請中描述，因此其內容被參考插入本文。用髓磷脂蛋白或神經微絲作為實驗抗原進行的類似分析程序如下描述。ELISA實驗(1)吸取200ul抗原懸浮液A或B，置於96孔平底硬聚苯乙烯微滴板中在4℃下過夜。(抗原A是牛髓磷脂，來自Sigma Chemical Company，Fancy Road，Poole，Dorset，BH12 4XA，UK，濃度為5ug/ml，抗原B是牛神經微絲，同樣來自Sigma，濃度為5ug/ml)。(2)然後用含0.1％(v/v)Tween 20的磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)衝洗3次。(3)向各孔中加入300ul在PBS中的封閉液(0.2％w/v卵清蛋白，0.1％v/v Tween)，然後在37℃保溫1小時。(4)然後用PBS.Tween 20衝洗平板三次。(5)取200ul血清樣品(實驗或對照)用PBS以1/200的比例稀釋。加入Tween，然後在37℃保溫2小時。(6)然後用PBS.Tween 20衝洗平板三次。(7)取200ul結合兔抗-牛IgA(alpha鏈)的過氧化物酶用PBS以1/4000的比例稀釋。(8)然後用PBS.Tween 20衝洗平板三次。(9)每孔加入200ul 0.5mg/ml(2，2』-連氮雙(3-乙基苄-噻唑啉-6-磺酸)的含0.98mM過氧化氫的檸檬酸鹽/磷酸鹽緩衝液(pH4.1)，在室溫下保持20分鐘，形成比色分析的顏色。(10)然後用100ul 2mg/ml氟化鈉中止反應，用微量-ELISA平板讀數儀在波長630nm處測定光密度。(11)所有分析均在編號的情況下進行，以便實驗者清楚進行研究的血清的來源(實驗或對照)。(12)所有實驗進行兩次。
上述實驗程序可以應用人髓磷脂或髓磷脂神經微絲或來源於它們的肽以同樣方式進行。
該分析是診斷患牛海綿狀腦病的牛和患MS和CJD的人的新方法，其中描述了一個能夠測定牛或人血清中抗兩種腦抗原的抗體的實驗。任何比健康對照高出2個標準偏差的讀數表示為陽性反應。而且，實驗對於兩種抗原(A)牛髓磷脂蛋白和(B)牛神經微絲將都是陽性的(高2個標準偏差)。
這是描述測定BSE感染牛和患MS和CJD患者中，抗腦抗原的自動抗體的的首次分析。
對於BSE的結果在附
圖1和2中顯示。
對於MS和CJD的結果在附圖3中顯示。
在我們的前面提到的國際申請中描述的實驗可以與本發明的實驗組合起來。該組合實驗特別適用於檢測BSE的應用。該組合實驗也可以被稱為「MAN實驗」，其基於抗牛髓磷脂(腦白質)和抗牛神經微絲(腦灰質)的自動抗體以及抗腐生細菌乙酸鈣不動桿菌的特定抗體的分別測定。
抗牛髓磷脂和牛神經微絲的自動抗體和抗不動桿菌的抗體按照以前描述的方法，針對各實驗動物測定。然後按照下列運算法則，通過乘光密度得到MAN指數＝髓磷脂IgA自動抗體x不動桿菌抗體x神經微絲自動抗體，即M×A×N的乘積。
附圖4顯示了該實驗與健康「生物體」對照或患其他疾病的對照(CVL)(CVL＝中心脊椎動物實驗室(Central Veterinary Laboratory，UK，從那兒得到患其他疾病的動物血清)比較之後的結果。
MAN實驗針對「生物體」大田對照校準，所述對照是來自飼料僅由青草和乾草構成的大田動物。MAN實驗是一種經驗性實驗，如果僅實驗健康牛，得到非常低的MAN指數值。
當實驗懷疑有BSE的牛血清時，當MAN指數比對照值高3個標準偏差時，認定為陽性反應。
權利要求
1.一種診斷脊椎動物海綿狀病或脫髓鞘病，包括BSE，MS和CJD的方法，該方法包括分析生物樣品中結合髓磷脂和/或髓磷脂神經微絲或結合一種或多種髓磷脂和/或髓磷脂神經微絲的抗原(免疫原)部分的抗體。
2.按照權利要求1的方法，其中抗體是IgA抗體。
3.按照權利要求1或2的方法，其中分析是針對結合脊椎動物髓磷脂和/或髓磷脂神經微絲或其部分的抗體。
4.按照權利要求3的方法，其中脊椎動物是牛或人。
5.按照權利要求4的方法，其中實驗抗原是選自具有上文中說明的序列ID Nos.1-8的序列的一種肽。
6.按照權利要求1-5之一的方法，其中陽性結果表示抗體水平比對照樣品的抗體水平至少高約兩個標準偏差。
7.一種權利要求1-6之一的方法與分析抗不動桿菌種抗體的方法組合的方法。
8.一種檢測脊椎動物海綿狀病或脫髓鞘病的診斷試劑盒，包括作為實驗抗原的髓磷脂和/或髓磷脂神經微絲和/或一種或多種髓磷脂和/或髓磷脂神經微絲的一部分。
9.按照權利要求8的診斷試劑盒，其中實驗抗原是一種具有選自上文說明的序列ID Nos.1-8序列的肽。
10.按照權利要求8或9的診斷試劑盒，其中含有作為實驗抗原的髓磷脂、髓磷脂神經微絲、和乙酸鈣不動桿菌。
全文摘要
一種診斷脊椎動物海綿狀病或脫髓鞘病,包括BSE、MS和CJD的方法,該方法包括分析生物樣品中結合髓磷脂和/或神經微絲或結合一種或多種其抗原(免疫原)部分的抗體。
文檔編號C07K14/435GK1338053SQ9981369
公開日2002年2月27日 申請日期1999年11月25日 優先權日1998年11月26日
發明者艾倫·埃布林格 申請人:倫敦皇家學院