用於治療龐貝氏症的方法

2023-04-22 17:42:36

專利名稱：用於治療龐貝氏症的方法
技術領域：
本發明涉及用於治療龐貝氏症(龐皮病，Pompe disease)的方法和組合物。更具體地，本發明涉及用於通過以非甘露糖-6-磷酸依賴型(mannose-6-phosphate-independent)方式將酸性α-葡糖苷酶靶向溶酶體來治療龐貝氏症的治療方法。

背景技術：
龐貝氏症是由溶酶體水解酶酸性α-葡糖苷酶(GAA)、糖原降解溶酶體酶缺乏或功能障礙引起的常染色體隱性遺傳病(基因紊亂，genetic disorder)。GAA的缺乏導致龐貝氏症患者許多組織內發生溶酶體糖原累積，伴隨心肌和骨骼肌組織遭受最嚴重影響。所有形式的龐貝氏症的合計發生率估計為1∶40,000，且該病症影響所有群體同時無種族傾向。據估計，將近三分之一患有龐貝氏症的人群具有迅速發展的致命性幼兒發病形式，而大多數患者表現為更緩慢發展的青少期或更晚的發作形式。
藥物治療策略、飲食控制和骨髓移植被採用作為治療龐貝氏症的手段，但是都沒有顯著成功的。近年來，酶替代療法(ERT)已經提供了治療龐貝氏症的新希望。例如，

一種重組GAA蛋白藥物，2006年在美國和歐洲正式批准用於患有龐貝氏症的患者。

依賴於用於向溶酶體遞送的GAA蛋白表面上的甘露糖-6-磷酸(M6P)。


發明內容
本發明提供了治療龐貝氏症的新型和改進的方法。具體而言，本發明提供用於以非甘露糖-6-磷酸依賴性方式將酸性α-葡糖苷酶(GAA)靶向溶酶體的方法和組合物。因此，本發明的方法更簡單、更有效、更具潛力和更具成本有效性。因而本發明顯著地推進了用於龐貝氏症的酶替代療法的進展。
在一個方面，本發明提供了一種通過向主體給予治療有效量的融合蛋白而治療主體的龐貝氏症的方法。該融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶體靶向結構域。該溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式連接人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
在一個實施方式中，溶酶體靶向結構域包含成熟人胰島素樣生長因子II(IGF-II)，或成熟人IGF-II的片段或序列變體(sequencevariant)。在一個實施方式中，溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸8-67。優選地，溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸1和8-67(即成熟人GAA的Δ2-7)。在另一實施方式中，融合蛋白包含人GAA的胺基酸70-952。
在一個實施方式中，相比於野生型人GAA，適用於本發明的融合蛋白在該蛋白表面上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。在另一實施方式中，適用於本發明的融合蛋白在該蛋白表面上不具有功能性M6P水平。
在另一實施方式中，治療有效量為在每千克主體體重約2.5～20毫克(mg/kg)的範圍內。
在一個實施方式中，融合蛋白經由靜脈內給藥。在其他實施方式中，融合蛋白以每兩月、每月、每三周、每兩周、每周、每天給藥或以變化的時間間隔給藥。如本文中所用的，術語「每兩月給藥」是指每兩個月給藥一次(即每兩個月一次)；術語「每月給藥」是指每一個月給藥一次；術語「每三周給藥」是指每三個星期給藥一次；術語「每兩周給藥」是指每兩個星期給藥一次；術語「每周給藥」是指每一個星期給藥一次；而術語「每天給藥」是指每天給藥一次。
在進一步的實施方式中，融合蛋白聯合免疫抑制劑進行給藥。免疫抑制劑可以在融合蛋白任何給藥之前進行給藥。在一些實施方式中，用於治療龐貝氏症的方法進一步包括使主體免疫耐受(tolerizing)的附加步驟。
本發明的另一方面提供了一種通過向主體給予治療有效量的融合蛋白而治療主體的龐貝氏症的方法。該融合蛋白包含成熟人胰島素樣生長因子II(IGF-II)的胺基酸1和8-67(即成熟人GAA的Δ2-7)和人酸性α葡糖苷酶(GAA)的胺基酸70-952。在一個優選的實施方式中，融合蛋白包含在人GAA的胺基酸和成熟人IGF-II的胺基酸之間的間隔序列Gly-Ala-Pro。
在一個實施方式中，相比於野生型人GAA，適用於本發明的融合蛋白在該蛋白表面上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。在另一實施方式中，適用於本發明這個方面的融合蛋白在該蛋白表面上不具有功能性M6P水平。
本發明的另一個方面提供了一種通過向患有龐貝氏症的主體給予治療有效量的融合蛋白而降低體內糖原水平的方法。該融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶體靶向結構域。該溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
在一個實施方式中，溶酶體靶向結構域包含成熟人胰島素樣生長因子II(IGF-II)，或成熟人IGF-II片段或序列變體。在一個實施方式中，溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸8-67。優選地，溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸1和8-67(即成熟人GAA的Δ2-7)。在另一優選實施方式中，融合蛋白包含人GAA的胺基酸70-952。
在一個實施方式中，相比於野生型人GAA，適用於本發明這方面的融合蛋白在該蛋白表面上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。在另一實施方式中，適用於本發明的融合蛋白在該蛋白表面上不具有功能性M6P水平。
在另一實施方式中，有效量為在每千克主體體重約2.5～20毫克(mg/kg)的範圍內。
在一些實施方式中，融合蛋白經由靜脈內給藥。在其他實施方式中，融合蛋白以每兩月給藥、每月給藥、每三周給藥、每兩周給藥、每周給藥、每天給藥或以變化的時間間隔給藥。
在另一個方面，本發明提供了一種通過向溶酶體靶向治療有效量的融合蛋白而降低哺乳動物溶酶體內糖原水平的方法。該融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶體靶向結構域。該溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
在一個實施方式中，溶酶體靶向結構域包含成熟人胰島素樣生長因子II(IGF-II)，或成熟人IGF-II片段或序列變體。在一個實施方式中，溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸8-67。優選地，溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸1和8-67(即成熟人GAA的Δ2-7)。在另一優選實施方式中，融合蛋白包含人GAA的胺基酸70-952。
在另一個方面，本發明提供了一種通過向肌肉組織遞送治療有效量的融合蛋白而降低患有龐貝氏症的主體的肌肉組織內糖原水平的方法。該融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶體靶向結構域。該溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。在一個實施方式中，肌肉組織是骨骼肌。
本發明的另一個方面提供了一種通過向主體給予治療有效量的融合蛋白而治療該主體內與龐貝氏症有關的心肌病(cardiomyopathy)的方法。該融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶體靶向結構域。該溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
在另一個方面，本發明提供了一種通過向主體給予治療有效量的融合蛋白而治療該主體內與龐貝氏症有關的肌病(myopathy)的方法。該融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶體靶向結構域。該溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
本發明的另一個方面提供了一種通過向主體給予融合蛋白而增加患有龐貝氏症的該主體內酸性α-葡糖苷酶活性的方法，該融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶體靶向結構域。該溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
本發明的另一方面提供了一種適用於治療龐貝氏症的藥物組合物。該藥物組合物包含治療有效量的融合蛋白，該融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)(或者人GAA的片段)和溶酶體靶向結構域。該溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
在一個實施方式中，溶酶體靶向結構域包含成熟人胰島素樣生長因子II(IGF-II)，或成熟人IGF-II片段或序列變體。在一個實施方式中，溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸8-67。優選地，溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸1和8-67(即成熟人GAA的Δ2-7)。在另一優選實施方式中，融合蛋白包含人GAA的胺基酸70-952。
在另一實施方式中，融合蛋白包含人GAA的胺基酸70-952和成熟人IGF-II的胺基酸1和8-67(即，成熟人GAA的Δ2-7)。在另一實施方式中，融合蛋白進一步包含在成熟人IGF-II的片段(胺基酸1和8-67)和人GAA片段(胺基酸70-952)之間的間隔序列Gly-Ala-Pro。
在一個實施方式中，相比於野生型人GAA，適用於本發明這個方面的融合蛋白在該蛋白表面上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。在另一實施方式中，適用於本發明這個方面的融合蛋白在該蛋白表面上不具有功能性M6P水平。
在另一實施方式中，該藥物組合物包含藥用載體。
如本申請中所用的，術語「人酸性α-葡糖苷酶(GAA)」是指人GAA的前體野生型形式、或者能夠降低哺乳動物溶酶體中糖原水平或可以挽救或減輕一種或多種龐貝氏症症狀的功能性變體。
如本申請中所用的，術語「約」和「大約」等同替換使用。在本申請中在有或沒有約或大約的情況下使用的任何數字都意指涵蓋相關領域技術人員所理解的任何正常波動範圍。
本發明的其他特徵、目的和優點在下文的詳細描述中將會變得很明顯。然而，應該理解，儘管指出了本發明的具體實施方式
，但是這些詳細說明僅僅是通過舉例說明的方式給出，而非進行限制。根據以下詳細描述，對於本領域技術人員來說，本發明範圍內的各種變化和修改將會變得顯而易見。



附圖僅僅是出於舉例說明的目的，而非限制性的。
圖1示出了GILT-標記的GAA ZC-701的示意圖。
圖2A-C示出了野生型未標記的GAA和GILT-標記的GAAZC-701的SDS-PAGE和蛋白質印跡。圖2A示出了銀染色之前的SDS-PAGE。圖2B示出了使用抗-GAA抗體的蛋白質印跡。圖2C示出了使用抗-IGF-II抗體的蛋白質印跡。
圖3A示出了p1288和p1355的示意圖，p1288和p1355是兩種分別含野生型CI-MPR結構域10-13和點突變變體的生物素化和His-標記的重組蛋白。
圖3B描述了通過銀染色的1288和1355的表達。
圖4A-B描述了GILT-標記的GAA ZC-701與CI-MPR相互作用的

分析的示例性結果。圖4A描述了IGF-II的示例性結合曲線。圖4B描述了GILT-標記的GAA ZC-701的示例性結合曲線。
圖5描述了將GILT-標記的GAA ZC-701的標記-依賴型攝取而進入大鼠L6成肌細胞的示例性結果。
圖6描述了純化GILT-標記的GAA ZC-701和野生型未標記GAA攝取進入大鼠L6成肌細胞的示例性飽和曲線。
圖7描述了反映GILT-標記的GAA ZC-701和野生型未標記GAA(ZC-635)在大鼠L6成肌細胞中的半衰期的示例性結果。
圖8A-B是顯示在攝取進入大鼠L6成肌細胞之後GILT-標記的GAA ZC-701的蛋白水解加工的示例性蛋白質印跡。圖8A是顯示在攝取後GILT標籤喪失的示例性蛋白質印跡。圖8B是顯示在攝取後野生型和GILT-標記的GAA進入各種肽物種中的加工的示例性蛋白質印跡。
圖9描述了反映在三個不同組織培養基中產生的GILT-標記的GAA ZC-701的野生型129小鼠中的血清半衰期的示例性結果。紅線對應於PF-CHO培養基，t1/2＝43min；橙線對應於CDM4培養基，t1/2＝38min；而綠線對應於CD17培養基，t1/2＝52min。
圖10A-D描述了野生型未標記的GAA(ZC-635)、GILT-標記的GAA ZC-701和GILT-標記的GAA ZC-1026的龐貝氏症小鼠的各種組織中的示例性衰變曲線。圖10A描述了在四頭肌組織中的示例性衰變曲線。圖10B描述了在心臟組織中的示例性衰變曲線。圖10C描述了在隔膜組織中的示例性衰變曲線。圖10D描述了在肝臟組織中的示例性衰變曲線。
圖11描述了GILT-標記的GAA和溶酶體標記物LAMP1的協同定位(co-localization)。
圖12描述了證實在取自用單注射GILT-標記的GAA蛋白ZC-701或未標記的GAA治療的龐貝氏症小鼠的心臟組織樣品中清除糖原的示例性結果。
圖13A-H是顯示在注射野生型未標記GAA或GILT-標記的GAA ZC-701之後，在龐貝氏症小鼠的各種肌肉組織中清除糖原的示例性曲線圖。
圖14示出了臨床研究程序的詳細流程圖。

具體實施例方式 本發明提供了基於非糖基化依賴型溶酶體靶向技術(GILT)的用於治療龐貝氏症的方法和組合物。具體地，本發明提供了通過以非甘露糖-6-磷酸-依賴型方式將酸性α-葡糖苷酶靶向溶酶體而用於治療龐貝氏症的方法和組合物。
本發明的各個方面將在以下部分詳細地進行描述。使用這些部分並不意味著限制本發明。每一部分都可以適用於本發明的任何方面。在本申請中，除非另外指出，使用的「或」都是指「和/或」之意。
龐貝氏症 龐貝氏症是一種稀有的遺傳性疾病，是由於酶中缺乏需要用於破壞糖原(用於能量的糖的一種儲存形式)的酸性α-葡糖苷酶(GAA)所引起的。龐貝氏症也稱為糖原貯積病II型(GSD II)，II型糖原貯積病，糖原病II型，酸性麥芽糖酶缺乏症，α-1，4-葡糖苷酶缺乏症，瀰漫性肝糖心肥大(cardiomegalia glycogenic diffusa)和全身性糖原病的心臟病形式。糖原的積聚引起整個身體的漸進性肌無力(肌病)並影響各個體組織，特別是心臟、骨骼肌、肝臟、呼吸和神經系統。
龐貝氏症呈現的臨床表現根據發病年齡和殘留GAA活性而廣泛變化。殘留GAA活性與糖原累積的數量和組織分布以及該疾病的嚴重度有關。幼發性龐貝氏症(低於正常GAA活性的1％)是最嚴重的形式，並且其特徵是張力過低、全身性肌無力和肥厚型心肌病，以及在心臟和其它肌肉組織中出現的大量糖原累積。由於心臟呼吸障礙，所以通常會在出生後1年內就發生死亡。Hirschhorn et al.(2001)″Glycogen Storage Disease Type IIAcid Alpha-glucosidase(Acid Maltase)Deficiency，″in Scriver et al.，eds.，The Metabolic andMolecular Basis of Inherited Disease.8th Ed.，New YorkMcGraw-Hill，3389-3420。青少期-發作性(正常GAA活性的1％～10％)和成年期-發作性(正常GAA活性的10％～40％)龐貝氏症是更加臨床多種類的，在發作年齡、臨床表現和疾病進展方面具有更大的變化。青少期發作性和成年期發作性龐貝氏症總體特徵是缺少嚴重心臟受累、更晚發病年齡和更慢的疾病進展，，但最終呼吸或肢肌受累導致顯著的發病率和死亡率。儘管預期壽命可以變化，但是死亡一般會由於呼吸衰竭而發生。Hirschhorn et al.(2001)「Glycogen StorageDisease Type IIAcid Alpha-glucosidase(Acid Maltase)Deficiency，」inScriver et al.，eds.，The Metabolic and Molecular Basis of InheritedDisease.8th Ed.，New YorkMcGraw-Hill，3389-3420。
酶替代療法 酶替代療法(ERT)是一種通過向血流中灌注缺少的酶而矯正酶缺乏的治療策略。作為血液灌注的患者組織，酶通過細胞攝取並運送到溶酶體，其中發揮作用而清除由於酶缺乏而在溶酶體中累積的物質。為了使溶酶體酶替代療法有效，治療用酶必須遞送到在其中表現儲存缺陷的組織的合適細胞中的溶酶體。傳統的溶酶體酶替代療法採用天然連接到蛋白的碳水化合物以配合靶細胞表面上的特定受體而進行遞送的。一種受體，非陽離子依賴型M6P受體(CI-MPR)，特別適用於靶向替代溶酶體酶，因為CI-MPR存在於大多數細胞型的表面上。
術語「非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體(CI-MPR)」、「M6P/IGF-II受體」和「CI-MPR/IGF-II受體」在本文中可以互換使用，是指結合M6P和IGF-II二者的細胞受體。
非糖基化依賴型溶酶體靶向 本發明開發了一種非糖基化作用依賴型溶酶體靶向(GILT)技術，用於將治療用酶靶向於溶酶體。具體而言，本發明採用了肽標籤代替M6P以配合用於溶酶體靶向的CI-MPR。典型地，GILT標籤是一種以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合CI-MPR的蛋白、肽或其他部分。有利的是，這種技術模擬了攝取溶酶體酶的標準生物學機制，也以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式進行。
優選的GILT標籤來源於人胰島素樣生長因子II(IGF-II)。人IGF-II是CI-MPR的高親和性配體，其也稱為IGF-II受體。GILT-標記的治療用酶與M6P/IGF-II受體的結合使得該蛋白經由胞吞途徑靶向溶酶體。這種方法相對於涉及糖基化的方法具有很多優點，包括簡單和成本有效性，因為一旦蛋白被分離，就不再需要做進一步的修飾。
GILT技術和GILT標籤的詳細描述能夠在美國公開No.20030082176、20040006008、20040005309和20050281805中找到，其全部內容結合於此作為參考。
GILT-標記的GAA 通過將編碼恰當GILT標籤的一個盒融合到GAA-編碼序列，本發明提供了一種GILT-標記的GAA，其可以以高親和力結合CI-MPR，而不依賴於該蛋白上的M6P含量。另外，本發明提供了一種GAA製劑，其中每一種酶分子具有用於CI-MPR的高親和力配體。正如在實施例部分所描述的，通過

分析，GILT-標記的GAA對CI-MPR具有高親和力，並且在體內從治療上講比傳統的溶酶體酶替代療法更有效。
GILT-標記的GAA的優異效能提供了許多臨床益處。增加的效能將會簡單地導致在相同或更低劑量下更有利的臨床預斷。GILT-標記的GAA能夠更有效地遞送到多個受疾病影響的組織。例如，GILT-標記的GAA可以具有向骨骼肌增加的遞送，尤其是在更低的劑量下。增加的效能也可以準許劑量足夠低從而最小化患者經常遭受的有害情形，以及減少針對患者體內藥物的抗體的產生。增加的效能也可以準許利用在灌輸之間增大的時間間隔的治療方案。
在一個優選的實施方式中，GILT-標記的GAA包括保持切割線性寡糖中的α1-4鍵接的能力的人GAA、或其片段或序列變體，以及以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人CI-MPR的溶酶體靶向結構域。合適的溶酶體靶向結構域包含成熟的人IGF-II、或其片段或序列變體。
IGF-II優選特異性地靶向CI-MPR。特別有用的是在IGF-II多肽中的突變，其導致產生以高親和力結合CI-MPR的蛋白，同時不再以明顯親和力結合其它IGF-II受體。IGF-II也能夠進行修飾以最小化與血清IGF-結合蛋白的結合(Baxter(2000)Am.L PhysiolEndocrinol Metab.278(6)967-76)，從而避免IGF-II/GILT構建體的螯合。許多研究都定位在對於與IGF結合蛋白必需的IGF-II中的殘基。在這些殘基處具有突變的構建體可以篩選保持對M6P/IGF-II受體的高親和力結合以及降低對IGF-結合蛋白的親和力。例如，據報導用Ser替代IGF-II的Phe 26能夠降低IGF-II對IGFBP-1和IGFBP-6的親和力，而不會影響對M6P/IGF-II受體的結合(Bach etal.(1993)J.Biol.Chem.268(13)9246-54)。其它替代，例如Lys替代Glu 9，也可以是有利的。利用IGF-II高度保守的IGF-I的區域中的類似突變，單獨的或者是組合的，導致IGF-BP結合的大大降低(Magee et al.(1999)Biochemistry 38(48)15863-70)。
一種替換方法是鑑定能夠以高親和力結合到M6P/IGF-II受體的IGF-II的最小區域。在結合到M6P/IGF-II受體的IGF-II中隱含的殘基大多數都在IGF-II的一個面上成簇(Terasawa et al.(1994)EMBO J.13(23)5590-7)。儘管IGF-II三級結構一般由三個分子內二硫鍵維持，但是整合在IGF-II的M6P/IGF-II受體結合表面上的胺基酸序列的肽可以設計成正確地摺疊並具有結合活性。這種最小結合肽是高度優選的溶酶體靶向結構域。例如，優選的溶酶體靶向結構域就是人IGF-II的胺基酸8-67。基於胺基酸48-55周圍的區域，所設計的結合M6P/IGF-II受體的肽也是所期望的溶酶體靶向結構域。可替代地，可以對肽的隨機文庫進行篩選，以篩選經由酵母兩次雜交測定或經由噬菌體顯示類型測定的結合M6P/IGF-II受體的能力。
GILT標籤可以融合到GAA多肽的N-端或C-端。GILT標籤能夠直接融合到GAA多肽或能夠通過連接區(linker)或間隔區(spacer)與GAA多肽分開。胺基酸連接區併入不同於在天然蛋白質的該位置出現的胺基酸序列，並通常設計成是柔性的或者在兩個蛋白部分之間插入一個結構，例如α-螺旋結構。連接區可以是相對較短的，例如序列Gly-Ala-Pro或Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Pro，或者可以是較長的，例如10～25個胺基酸的長度。融合接頭的部位應該認真選擇以促進融合伴侶的正確摺疊和活性，以及防止肽標籤與GAA多肽過早分離。在一個優選實施方式中，連接區序列是Gly-Ala-Pro。
能夠用於本發明方法和組合物中的GILT-標記的GAA蛋白的其它構建體在美國公開No.20050244400中詳細描述，其全部內容結合於此作為參考。
GILT-標記的GAA能夠在各種哺乳動物細胞系中表達，包括但不限於人胚腎(HEK)293、中國倉鼠卵巢(CHO)、猴腎(COS)、HT1080、C10、HeLa(海拉)、倉鼠嬰腎(BHK)、3T3、C127、CV-1、HaK、NS/O和L-929細胞。GILT-標記的GAA也能夠在各種非哺乳動物宿主細胞中表達，例如昆蟲(例如Sf-9、Sf-21、Hi5)、植物(例如，豆科植物(Leguminosa)、穀類植物或菸草類植物)、酵母(例如，釀酒酵母(S.cerivisae)、甲醇型酵母(P.pastoris))、原核生物(例如，大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和其它桿菌屬、假單胞菌屬、鏈黴菌屬)或真菌。
在一些實施方式中，GILT-標記的GAA可以利用促分泌信號肽產生，以有利於融合蛋白的分泌。例如，GILT-標記的GAA能夠利用IGF-II信號肽產生。一般而言，與野生型人GAA相比，利用IGF-II信號肽生產的GILT-標記的GAA在該蛋白表面上具有降低的甘露糖-6磷酸(M6P)水平。如實施例部分中所表明的，已經通過N-連接的寡糖分析和功能性攝取測定確認，在本發明的示例性治療用融合蛋白上不存在可檢測的M6P。
本發明的GILT-GAA通常具有的特異性酶活性在約150,000～600,000nmol/h/mg蛋白的範圍內，優選在約250,000～500,000nmol/h/mg蛋白的範圍內。在一個實施方式中，GAA具有的特異性酶活性至少為約150,000nmol/h/mg蛋白；優選地，特異性酶活性至少為約300,000nmol/h/mg蛋白；更優選地，特異性酶活性至少為約400,000nmol/h/mg蛋白；而甚至優選地，特異性酶活性至少為約600,000nmol/h/mg蛋白。GAA活性通過GAA4MU單位定義。
龐貝氏症的治療 本發明的方法在治療由幼發性、青少期發作性或成年期發作性龐貝氏症侵襲的個體方面是等效的。通常，本文中描述的治療方法和組合物在治療患有青少期發作性-或成年期發作性龐貝氏症的個體方面可能更為有效，因為這些個體具有更高的殘餘GAA活性水平(分別為1％～10％和10％～40％)，因此，可能對所給予GILT-標記的GAA更具免疫耐受性。不期望受到理論的束縛，這些患者一般對於內源性GAA呈交叉反應性免疫物質(CRIM)-陽性。因此，它們的免疫系統可能不會將GILT-標記的GAA的GAA部分識別成「外來」蛋白，並且不可能形成針對對GILT-標記的GAA的GAA部分的抗體。
如本文中所用的，術語「治療」或「處理」是指改善與該疾病相關的一種或多種症狀，預防或延遲該疾病一種或多種症狀的發作，和/或降低該疾病一種或多種症狀的嚴重度或頻率。例如，治療可以是指心臟狀態的改進(例如，舒張末期容積和/或收縮末期容積的增加，或者通常在龐貝氏症中發現的進展性心肌病的降低、改善或預防)或肺功能的改進(例如，啼哭肺活量比基線肺活量增加，和/或啼哭期間氧去飽和作用規範化)；在神經發育和/或運動技巧方面的改進(例如，在AIMS評分方面增加)；降低了由該病侵害的患者組織中的糖原水平；或者這些效果的任何組合。在一個優選的實施方式中，治療包括糖原清除的改進，尤其是降低或預防龐貝氏症相關的心肌病。如本文中所用的，術語「改進」、「增加」或「降低」是指相對於基線測量值的值，例如在本文中描述的治療開始之前的相同個體中的測定值，或者在沒有本文中所描述治療下的對照個體(或者多個對照個體)中的測定值。「對照個體」是與所治療個體患有相同形式的龐貝氏症(幼發性的、青少期發作性的或成年期發作性)的個體，其與所治療個體年齡大致相同(以確保在所治療個體和對照個體中的疾病階段是相當的)。
所治療的個體(也稱為「患者」或者「主體」)是患有龐貝氏症(即幼發性的、青少期發作性的或成年期發作性龐貝氏症)或者具有發展成為龐貝氏症可能的個體(胎兒、嬰兒、小孩、青少年或成人)。個體能夠具有殘餘的內源GAA活性，或者沒有可測量的活性。例如，患有龐貝氏症的個體可以具有的GAA活性，為低於約1％的正常GAA活性(即通常與幼發性龐貝氏症相關的GAA活性)，為正常GAA活性的約1％～10％(即通常與青少期發作性龐貝氏症相關的GAA活性)，或者為正常GAA活性的約10％～40％(即通常與成年期發作性龐貝氏症相關的GAA活性)。個體可以是對內源GAA呈CRIM-陽性或CRIM-陰性。在一個實施方式中，個體對內源GAA呈CRIM-陽性。在另一個實施方式中，個體是最近診斷患有該疾病的個體。早期治療(診斷之後就立即儘可能地開始治療)對於最小化疾病的影響和最大化治療效益是很重要的。
GILT-標記的GAA的給藥 在本發明的方法中，GILT-標記的GAA通常是單獨給予個體，或者以包含GILT-標記的GAA的組合物或藥劑給藥(例如在該疾病治療的藥劑生產中的)，如本文中所描述的。組合物能夠用生理學可接受的載體或賦形劑進行配製以製成藥物組合物。載體和組合物可以是無菌的。製劑應該適於給藥方式。
合適的藥用載體包括但不限於水、鹽溶液(例如NaCl)、鹽水、緩衝鹽水、醇、甘油、乙醇、阿拉伯樹膠、植物油、苄醇、聚乙二醇、明膠、碳水化合物如乳糖，直鏈澱粉或支鏈澱粉，糖如甘露糖，蔗糖或其它糖，葡萄糖、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、粘性石蠟、芳香油、脂肪酸酯、羥甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等，以及它們的組合。如果需要，藥物製劑能夠與助劑混合(例如潤滑劑、防腐劑、穩定劑、潤溼劑、乳化劑、影響滲透壓的鹽、緩衝劑、著色劑、芳香和/或香味物質等)，助劑不會有害地與活性化合物反應或者幹擾其活性。在一個優選的實施方式中，採用了適用於靜脈內給藥的水溶性載體。
如果需要，組合物或藥劑也可以含有少量的潤溼劑或乳化劑，或者pH緩衝劑。組合物可以是液體溶液、懸浮液、乳液、片劑、丸劑、膠囊、緩釋製劑或粉末。組合物也可以用傳統的粘結劑和載體如甘油三酸酯配製成栓劑。口服製劑可以包含標準載體如藥物級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、聚乙烯基吡咯烷酮、糖精酸鈉、纖維素、碳酸鎂等。
組合物或藥劑可以根據常規程序配製成適用於向人類給藥的藥物組合物。例如，在一個優選實施方式，用於靜脈內給藥的組合物通常是在無菌等滲含水緩衝液中的溶液。如果需要，組合物也可以包含增溶劑和局部麻醉劑，以緩解注射部位的疼痛。一般而言，各個組分可以以單位劑型單獨提供或混合在一起，例如，作為在氣密性密封容器如指示活性劑的量的安瓿瓶或sachette中的乾燥凍乾粉末或無水濃縮物。如果需要通過灌注給藥組合物，其可以用含有無菌藥物級水、鹽水或葡萄糖/水的灌注瓶加以分散。如果需要通過注射給藥組合物，可以提供用於注射的無菌水或鹽水的安瓿瓶，以使各個組分可以在給藥之前進行混合。
GILT-標記的GAA可以配製成中性或鹽形式。藥用鹽包括那些與游離氨基形成的鹽，例如衍生於鹽酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等，和那些與游離羧基形成的鹽，例如衍生於氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣、氫氧化鐵，異丙胺，三乙胺，2-乙基氨基乙醇，組氨酸，普魯卡因等。
GILT-標記的GAA(或者含有GILT-標記的GAA的組合物或藥劑)通過任何合適的路徑給藥。在一個優選的實施方式中，GILT-標記的GAA經由靜脈內給藥。在其他實施方式中，GILT-標記的GAA直接給藥至靶組織，例如心臟或肌肉(例如肌內)或者神經系統(例如直接注入大腦；心室內；鞘內)。可替代地，GILT-標記的GAA(或含有GILT-標記的GAA的組合物或藥劑)可以經由非腸胃給藥、經皮給藥或跨黏膜給藥(例如，口服或者鼻道)。如果需要，可以同時採用多種路徑。
GILT-標記的GAA(或含有GILT-標記的GAA的組合物或藥劑)可以單獨給藥，或者聯合其它試劑，如抗組胺劑(例如苯海拉明(diphenhydramine))或免疫抑制劑或其它對抗抗-GILT-標記的GAA抗體的免疫治療劑。術語「聯合」是指試劑在GILT-標記的GAA(或含有GILT-標記的GAA的組合物或藥劑)給藥之前、給藥的同時或給藥之後進行給藥。例如，試劑可以混合到含有GILT-標記的GAA的組合物中，由此與GILT-標記GAA同時給藥；可替代地，試劑可以不進行混合而同時給藥(例如，通過在靜脈內路線上的試劑的「借道」遞送，通過這種方式也給藥GILT-標記的GAA，或者反之亦然)。在另一實施方式中，試劑可以分開給藥(例如，不用摻混)，但是是在GILT-標記的GAA給藥的短時限內(例如24h內)。在一個優選的實施方式中，如果個體對內源GAA呈CRIM-陰性，則GILT-標記的GAA(或含有GILT-標記的GAA的組合物或藥劑)與設計用於降低抗-GILT-標記的GAA抗體數量、或阻止其產生的免疫抑制方案或免疫治療方案聯合而進行給藥。例如，類似於用於血友病患者的方案(Nilsson et al(1988)N.Engl.J.Med.，318947-50)可以用於降低抗-GILT-標記的GAA抗體。這種方案也可以用於對內源GAA呈陽性但是具有抗-GILT-標記的GAA抗體或存在具有抗-GILT-標記的GAA抗體危險的個體。在一個特別優選的實施方式中，免疫抑制方案或免疫治療方案在GILT-標記的GAA首次給藥之前開始，以便最小化產生抗-GILT-標記的GAA抗體的可能性。
GILT-標記的GAA(或含有GILT-標記的GAA的組合物或藥劑)以治療有效劑量(即當以規律時間間隔給藥時，足以治療該疾病的劑量，例如通過改善與該疾病相關的症狀，預防或延遲該疾病的發作，和/或也降低該疾病的嚴重度或頻率，如上所述)進行給藥。用於治療該疾病的治療有效的劑量將取決於該疾病影響的性質和程度，並且可以通過標準臨床技術確定。另外，體內或體外測定可以可選地採用以有助於確定最佳的劑量範圍，例如以下所給的示例性劑量。要採用的精確劑量也取決於給藥路徑，和疾病的嚴重性，並且應該根據醫師判斷和每個患者的病況進行確定。有效劑量可以由體外或動物模型試驗系統衍生的劑量響應曲線推斷出。治療有效劑量可以例如為約0.1～1mg/kg，約1～5mg/kg，約5～20mg/kg，約20-50mg/kg或20～100mg/kg。對於特定個體的有效劑量可以隨時間進行變化(例如，增加或降低)，這根據個體的需要而定。例如，在身體疾病或應激的時間內，或者如果抗-GILT-標記的GAA抗體開始出現或增加，或者如果疾病症狀惡化，則劑量可以增加。
GILT-標記的GAA(或含有GILT-標記的GAA的組合物或藥劑)的治療有效量以規律時間間隔給藥，這取決於疾病影響的性質和程度，以及取決於正在發生的基礎。如本文中所用的，以一定「時間間隔」給藥是指周期性地給予治療有效量(這有別於一次性劑量給藥)。時間間隔可以通過標準臨床技術確定。在優選的實施方式中，GILT-標記的GAA可以每兩月給藥、每月給藥、每月兩次給藥、每三周給藥、每兩周給藥、每周給藥、每周兩次給藥、每周三次給藥或每天給藥。對於單個個體的給藥時間間隔不必是固定的時間間隔，而是可以隨時間進行變化，這取決於個體所需。例如，在身體疾病或應激的時間內，如果抗-GILT-標記的GAA抗體開始產生或增加，或者如果疾病症狀惡化，則劑量之間的時間間隔就可能減少。
如本文中所用的，術語「每兩月給藥」是指每兩個月給藥一次(即每兩月1次)；術語「每月給藥」是指每月給藥一次；術語「每三周給藥」是指每三個星期給藥一次(即每三個周1次)；術語「每兩周給藥」是指每兩個星期給藥一次(即每兩個周1次)；術語「每周給藥」是指每一個星期給藥一次；而術語「每天給藥」是指每天給藥一次。
本發明另外涉及一種在帶有標籤的容器(例如藥水瓶，玻璃瓶，用於靜脈內給藥的袋，注射器等)中的如本文所述的藥物組合物，容器裝有用於該組合物的給藥(例如通過本文所述的方法)以治療龐貝氏症的說明書。
本發明將通過以下實施例進一步且更具體地進行描述。然而，實施例只是出於舉例說明的目的，而非對本發明的限制。
實施例 實施例1重組野生型GAA和GILT-標記的GAA的生產 質粒 分離編碼全長的野生型人GAA的DNA並插入到用於生產重組人GAA的表達載體中。編碼完全人GAA胺基酸1-952的DNA盒(下文稱為「盒635」)來源於IMAGE克隆體4374238(OpenBiosystems)，其中利用以下PCR引物衍生 GAA135』-GGAATTCCAACCATGGGAGTGAGGCACCCGCCC(SEQ ID NO1)和 GAA275』-GCTCTAGACTAACACCAGCTGACGAGAAACTGC(SEQ ID NO2)。
盒635利用EcoRI和XbaI消化，通過用克倫諾(Klenow)DNA聚合酶處理而鈍化，然後綁紮到表達媒介物pCEP4(Invitrogen)的克倫諾處理後的HindIII位點，從而產生質粒p635。下文中，ZC-635是指野生型未標記的GAA蛋白。
用於生產重組GILT-標記的GAA ZC-701的DNA盒(下文稱為「盒701」)類似於盒635進行製備，只是以下N-端序列，其接合對應於胺基酸A70的GAA序列的上遊 GAATTCACACCAATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTCTGTGCGGCGGGGAGCTGGTGGACACCCTCCAGTTCGTCTGTGGGGACCGCGGCTTCTACTTCAGCAGGCCCGCAAGCCGTGTGAGCCGTCGCAGCCGTGGCATCGTTGAGGAGTGCTGTTTCCGCAGCTGTGACCTGGCCCTCCTGGAGACGTACTGTGCTACCCCCGCCAAGTCCGAGGGCGCGCCG(SEQ ID NO3)。
盒701利用EcoRI和XbaI消化，通過用克倫諾DNA聚合酶處理而鈍化，然後綁紮到表達載體pCEP4的克倫諾處理後的HindIII位點，從而產生質粒p701。下文中，ZC-701是指由p701質粒編碼的GILT標記的GAA蛋白。圖1示出了GILT-標記的GAA ZC-701的圖示，包括在分泌時喪失的IGF-II信號肽。因此，以分泌的形式(即，由於其將會被給藥到主體)，ZC-701包含人IGF-II的胺基酸1和8-67(即成熟人IGF-II的Δ2-7)、間隔序列Gly-Ala-Pro和人GAA的胺基酸70-952。以下示出了全長的胺基酸序列。間隔序列加有下劃線。間隔序列的序列N-末端反映人IGF-II的胺基酸1和8-67(箭頭指向胺基酸1)而間隔序列的序列C-末端反映人GAA的胺基酸70-952。
↓ MGIPMGKSMLVLLTFLAFASCCIAALCGGELVDTLQFVCGDRGFYFSRPASRVSRRSRGIVEECCFRSCDLALLETYCATPAKSEGAPAHPGRPRAVPTQCDVPPNSRFDCAPDKAITQEQCEARGCCYIPAKQGLQGAQMGQPWCFFPPSYPSYKLENLSSSEMGYTATLTRTTPTFFPKDILTLRLDVMMETENRLHFTIKDPANRRYEVPLETPRVHSRAPSPLYSVEFSEEPFGVIVHRQLDGRVLLNTTVAPLFFADQFLQLSTSLPSQYITGLAEHLSPLMLSTSWTRITLWNRDLAPTPGANLYGSHPFYLALEDGGSAHGVFLLNSNAMDVVLQPSPALSWRSTGGILDVYIFLGPEPKSVVQQYLDVVGYPFMPPYWGLGFHLCRWGYSSTAITRQVVENMTRAHFPLDVQWNDLDYMDSRRDFTFNKDGFRDFPAMVQELHQGGRRYMMIVDPAISSSGPAGSYRPYDEGLRRGVFITNETGQPLIGKVWPGSTAFPDFTNPTALAWWEDMVAEFHDQVPFDGMWIDMNEPSNFIRGSEDGCPNNELENPPYVPGVVGGTLQAATICASSHQFLSTHYNLHNLYGLTEAIASHRALVKARGTRPFVISRSTFAGHGRYAGHWTGDVWSSWEQLASSVPEILQFNLLGVPLVGADVCGFLGNTSEELCVRWTQLGAFYPFMRNHNSLLSLPQEPYSFSEPAQQAMRKALTLRYALLPHLYTLFHQAHVAGETVARPLFLEFPKDSSTWTVDHQLLWGEALLITPVLQAGKAEVTGYFPLGTWYDLQTVPIEALGSLPPPPAAPREPAIHSEGQWVTLPAPLDTINVHLRAGYIIPLQGPGLTTTESRQQPMALAVALTKGGEARGELFWDDGESLEVLERGAYTQVIFLARNNTIVNELVRVTSEGAGLQLQKVTVLGVATAPQQVLSNGVPVSNFTYSPDTKVLDICVSLLMGEQFLVSWC(SEQ ID NO4) 第二GILT-標記的GAA盒(ZC-1026)類似地進行構建。ZC-1026包含人IGF-II的胺基酸1和8-67、間隔序列Thr-Gly和人GAA的胺基酸70-952。
這些質粒用於瞬時轉染用於生產重組蛋白的懸浮HEK293細胞。按照製造商(Invitrogen)的描述將質粒轉染到懸浮FreeStyleTM293-F細胞中。簡而言之，細胞在聚碳酸酯振蕩瓶中的Opti-

I介質(Invitrogen)中放置於定軌搖床於37℃和8％的CO2下進行生長。細胞濃度調節到1×106個細胞/mL，然後按照製造商(Invitrogen)的描述用比率為1∶1∶1的ml細胞∶μg DNA∶μl 293fectinTM進行轉染。培養物在轉染5～10天後進行收穫，並通過離心和0.2μm瓶頂過濾器過濾而除去細胞。上清液於-80℃下儲存。
可替代地，盒701引入(整合)到

逆轉錄病毒載體(retrovector)表達系統(Cardinal Health)。該方法描述於美國專利No.6,852,510中，其公開內容結合於此作為參考。含有盒701的

逆轉錄病毒載體表達系統用來形成用於生產重組GILT-標記的GAA的穩定CHO細胞系。盒701也可以引入到

逆轉錄病毒載體表達系統並用來形成用於生產重組GILT-標記的GAA的穩定HEK293細胞系。
GILT-標記的GAA的純化 起始原料是哺乳動物細胞培養物上清液，如上所描述的，從-80℃的儲存下進行解凍。加入乙酸鈉(pH 4.6)以使最終濃度達到100mM，並加入硫酸銨以使最終濃度達到0.75M。物料離心以除去沉澱並用0.8/0.2μm AcroPakTM 500莢膜(Pall，目錄號#12991)進行過濾。
過濾後的物料加載到用HIC加載緩衝液(50mM NaAc pH 4.6，0.75M AmSO4)製備的Phenyl-SepharoseTM 6 Low-Sub Fast-Flow(GEHealthcare)柱。用10柱體積的HIC衝洗緩衝液(50mM NaAc pH5.3，0.75M AmSO4)衝洗柱子，並用5柱體積的HIC洗脫緩衝液(50mM NaAc pH 5.3，20mM AmSO4)洗脫。
合併的餾分廣泛透析到QXL加載緩衝液(20mM組氨酸pH 6.5，50mM NaCl)中，然後加載到Q SepharoseTM XL柱(GE Healthcare)上。用10柱體積的QXL平衡緩衝液衝洗，並用10柱體積的QXL洗脫緩衝液(20mM組氨酸pH 6.5，150mM NaCl)洗脫。在某些情況下，來自QXL柱的合併餾分濃縮至蛋白濃度為30～40mg/mL，然後加載到在PBS pH 6.2中平衡的2.6×90cm Ultrogel AcA 44柱上。加載體積為5～7.5mL(柱體積的1％～1.5％)。在PBS pH 6.2中以0.4mL/min的速度走柱，並收集4mL餾分。
純化的未標記GAA和GILT-標記的GAA在圖2A～C示出。圖2A示出了銀染色之前的SDS-PAGE。圖2B示出了利用抗-GAA抗體的蛋白質印跡。圖2C示出了利用抗-IGF-II抗體的蛋白質印跡。
實施例2GILT-標記的GAA對CI-MPR的親和力 GILT-標記的GAA ZC-701對CI-MPR的結合親和力利用

表面等離子體諧振測定(surface plasmon resonance assay)加以確定。根據標準分子技術，分別形成兩個生物素化和His-標記的重組蛋白(含有野生型CI-MPR結構域10-13和一個點突變變體)。兩個重組蛋白的示意圖如圖3A所示。質粒p1288含有的IGF-II信號肽，緊接著有多聚His(poly-His)標籤；生物素AS結構域；以及編碼野生型CI-MPR結構域10-13的序列。質粒p1355含有IGF-II信號肽，緊接著有多聚His(poly-His)標籤；生物素AS結構域；以及編碼具有有效降低受體對IGF-II的親和力的點突變I1572T的CI-MPR結構域10-13的序列。以下示出了與這兩個重組蛋白相關的特異性DNA和胺基酸序列。
HIS-生物素-CI-MPR結構域10-13 ATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTGGCGCGCCGACCGGTCACCATCACCATCACCACGCGCCGGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGAACCTTTCGATCTGACTGAATGTTCATTCAAAGATGGGGCTGGCAACTCCTTCGACCTCTCGTCCCTGTCAAGGTACAGTGACAACTGGGAAGCCATCACTGGGACGGGGGACCCGGAGCACTACCTCATCAATGTCTGCAAGTCTCTGGCCCCGCAGGCTGGCACTGAGCCGTGCCCTCCAGAAGCAGCCGCGTGTCTGCTGGGTGGCTCCAAGCCCGTGAACCTCGGCAGGGTAAGGGACGGACCTCAGTGGAGAGATGGCATAATTGTCCTGAAATACGTTGATGGCGACTTATGTCCAGATGGGATTCGGAAAAAGTCAACCACCATCCGATTCACCTGCAGCGAGAGCCAAGTGAACTCCAGGCCCATGTTCATCAGCGCCGTGGAGGACTGTGAGTACACCTTTGCCTGGCCCACAGCCACAGCCTGTCCCATGAAGAGCAACGAGCATGATGACTGCCAGGTCACCAACCCAAGCACAGGACACCTGTTTGATCTGAGCTCCTTAAGTGGCAGGGCGGGATTCACAGCTGCTTACAGCGAGAAGGGGTTGGTTTACATGAGCATCTGTGGGGAGAATGAAAACTGCCCTCCTGGCGTGGGGGCCTGCTTTGGACAGACCAGGATTAGCGTGGGCAAGGCCAACAAGAGGCTGAGATACGTGGACCAGGTCCTGCAGCTGGTGTACAAGGATGGGTCCCCTTGTCCCTCCAAATCCGGCCTGAGCTATAAGAGTGTGATCAGTTTCGTGTGCAGGCCTGAGGCCGGGCCAACCAATAGGCCCATGCTCATCTCCCTGGACAAGCAGACATGCACTCTCTTCTTCTCCTGGCACACGCCGCTGGCCTGCGAGCAAGCGACCGAATGTTCCGTGAGGAATGGAAGCTCTATTGTTGACTTGTCTCCCCTTATTCATCGCACTGGTGGTTATGAGGCTTATGATGAGAGTGAGGATGATGCCTCCGATACCAACCCTGATTTCTACATCAATATTTGTCAGCCACTAAATCCCATGCACGGAGTGCCCTGTCCTGCCGGAGCCGCTGTGTGCAAAGTTCCTATTGATGGTCCCCCCATAGATATCGGCCGGGTAGCAGGACCACCAATACTCAATCCAATAGCAAATGAGATTTACTTGAATTTTGAAAGCAGTACTCCTTGCTTAGCGGACAAGCATTTCAACTACACCTCGCTCATCGCGTTTCACTGTAAGAGAGGTGTGAGCATGGGAACGCCTAAGCTGTTAAGGACCAGCGAGTGCGACTTTGTGTTCGAATGGGAGACTCCTGTCGTCTGTCCTGATGAAGTGAGGATGGATGGCTGTACCCTGACAGATGAGCAGCTCCTCTACAGCTTCAACTTGTCCAGCCTTTCCACGAGCACCTTTAAGGTGACTCGCGACTCGCGCACCTACAGCGTTGGGGTGTGCACCTTTGCAGTCGGGCCAGAACAAGGAGGCTGTAAGGACGGAGGAGTCTGTCTGCTCTCAGGCACCAAGGGGGCATCCTTTGGACGGCTGCAATCAATGAAACTGGATTACAGGCACCAGGATGAAGCGGTCGTTTTAAGTTACGTGAATGGTGATCGTTGCCCTCCAGAAACCGATGACGGCGTCCCCTGTGTCTTCCCCTTCATATTCAATGGGAAGAGCTACGAGGAGTGCATCATAGAGAGCAGGGCGAAGCTGTGGTGTAGCACAACTGCGGACTACGACAGAGACCACGAGTGGGGCTTCTGCAGACACTCAAACAGCTACCGGACATCCAGCATCATATTTAAGTGTGATGAAGATGAGGACATTGGGAGGCCACAAGTCTTCAGTGAAGTGCGTGGGTGTGATGTGACATTTGAGTGGAAAACAAAAGTTGTCTGCCCTTGA(SEQ ID NO5) HIS-生物素-CI-MPR結構域10-13蛋白質序列 MGIPMGKSMLVLLTFLAFASCCIAAGAPTGHHHHHHAPGLNDIFEAQKIEWHEPFDLTECSFKDGAGNSFDLSSLSRYSDNWEAITGTGDPEHYLINVCKSLAPQAGTEPCPPEAAACLLGGSKPVNLGRVRDGPQWRDGIIVLKYVDGDLCPDGIRKKSTTIRFTCSESQVNSRPMFISAVEDCEYTFAWPTATACPMKSNEHDDCQVTNPSTGHLFDLSSLSGRAGFTAAYSEKGLVYMSICGENENCPPGVGACFGQTRISVGKANKRLRYVDQVLQLVYKDGSPCPSKSGLSYKSVISFVCRPEAGPTNRPMLISLDKQTCTLFFSWHTPLACEQATECSVRNGSSIVDLSPLIHRTGGYEAYDESEDDASDTNPDFYINICQPLNPMHGVPCPAGAAVCKVPIDGPPIDIGRVAGPPILNPIANEIYLNFESSTPCLADKHFNYTSLIAFHCKRGVSMGTPKLLRTSECDFVFEWETPVVCPDEVRMDGCTLTDEQLLYSFNLSSLSTSTFKVTRDSRTYSVGVCTFAVGPEQGGCKDGGVCLLSGTKGASFGRLQSMKLDYRHQDEAVVLSYVNGDRCPPETDDGVPCVFPFIFNGKSYEECIIESRAKLWCSTTADYDRDHEWGFCRHSNSYRTSSIIEKCDEDEDIGRPQVFSEVRGCDVTFEWKTKVVCP(SEQ ID NO6)。
HIS-生物素-CI-MPR結構域10-13 I1572T(下劃線的序列變化導致點突變I1572T和形成診斷SpeI位點的沉默突變) ATGGGAATCCCAATGGGGAAGTCGATGCTGGTGCTTCTCACCTTCTTGGCCTTCGCCTCGTGCTGCATTGCTGCTGGCGCGCCGACCGGTCACCATCACCATCACCACGCGCCGGGCCTGAACGACATCTTCGAGGCCCAGAAGATCGAGTGGCACGAACCTTTCGATCTGACTGAATGTTCATTCAAAGATGGGGCTGGCAACTCCTTCGACCTCTCGTCCCTGTCAAGGTACAGTGACAACTGGGAAGCCATCACTGGGACGGGGGACCCGGAGCACTACCTCATCAATGTCTGCAAGTCTCTGGCCCCGCAGGCTGGCACTGAGCCGTGCCCTCCAGAAGCAGCCGCGTGTCTGCTGGGTGGCTCCAAGCCCGTGAACCTCGGCAGGGTAAGGGACGGACCTCAGTGGAGAGATGGCATAATTGTCCTGAAATACGTTGATGGCGACTTATGTCCAGATGGGATTCGGAAAAAGTCAACCACCATCCGATTCACCTGCAGCGAGAGCCAAGTGAACTCCAGGCCCATGTTCATCAGCGCCGTGGAGGACTGTGAGTACACCTTTGCCTGGCCCACAGCCACAGCCTGTCCCATGAAGAGCAACGAGCATGATGACTGCCAGGTCACCAACCCAAGCACAGGACACCTGTTTGATCTGAGCTCCTTAAGTGGCAGGGCGGGATTCACAGCTGCTTACAGCGAGAAGGGGTTGGTTTACATGAGCATCTGTGGGGAGAATGAAAACTGCCCTCCTGGCGTGGGGGCCTGCTTTGGACAGACCAGGACTAGTGTGGGCAAGGCCAACAAGAGGCTGAGATACGTGGACCAGGTCCTGCAGCTGGTGTACAAGGATGGGTCCCCTTGTCCCTCCAAATCCGGCCTGAGCTATAAGAGTGTGATCAGTTTCGTGTGCAGGCCTGAGGCCGGGCCAACCAATAGGCCCATGCTCATCTCCCTGGACAAGCAGACATGCACTCTCTTCTTCTCCTGGCACACGCCGCTGGCCTGCGAGCAAGCGACCGAATGTTCCGTGAGGAATGGAAGCTCTATTGTTGACTTGTCTCCCCTTATTCATCGCACTGGTGGTTATGAGGCTTATGATGAGAGTGAGGATGATGCCTCCGATACCAACCCTGATTTCTACATCAATATTTGTCAGCCACTAAATCCCATGCACGGAGTGCCCTGTCCTGCCGGAGCCGCTGTGTGCAAAGTTCCTATTGATGGTCCCCCCATAGATATCGGCCGGGTAGCAGGACCACCAATACTCAATCCAATAGCAAATGAGATTTACTTGAATTTTGAAAGCAGTACTCCTTGCTTAGCGGACAAGCATTTCAACTACACCTCGCTCATCGCGTTTCACTGTAAGAGAGGTGTGAGCATGGGAACGCCTAAGCTGTTAAGGACCAGCGAGTGCGACTTTGTGTTCGAATGGGAGACTCCTGTCGTCTGTCCTGATGAAGTGAGGATGGATGGCTGTACCCTGACAGATGAGCAGCTCCTCTACAGCTTCAACTTGTCCAGCCTTTCCACGAGCACCTTTAAGGTGACTCGCGACTCGCGCACCTACAGCGTTGGGGTGTGCACCTTTGCAGTCGGGCCAGAACAAGGAGGCTGTAAGGACGGAGGAGTCTGTCTGCTCTCAGGCACCAAGGGGGCATCCTTTGGACGGCTGCAATCAATGAAACTGGATTACAGGCACCAGGATGAAGCGGTCGTTTTAAGTTACGTGAATGGTGATCGTTGCCCTCCAGAAACCGATGACGGCGTCCCCTGTGTCTTCCCCTTCATATTCAATGGGAAGAGCTACGAGGAGTGCATCATAGAGAGCAGGGCGAAGCTGTGGTGTAGCACAACTGCGGACTACGACAGAGACCACGAGTGGGGCTTCTGCAGACACTCAAACAGCTACCGGACATCCAGCATCATATTTAAGTGTGATGAAGATGAGGACATTGGGAGGCCACAAGTCTTCAGTGAAGTGCGTGGGTGTGATGTGACATTTGAGTGGAAAACAAAAGTTGTCTGCCCTTGA(SEQ ID NO7) HIS-生物素-CI-MPR結構域10-13 I1572T蛋白質序列(I1572T突變加了下劃線) MGIPMGKSMLVLLTFLAFASCCIAAGAPTGHHHHHHAPGLNDIFEAQKIEWHEPFDLTECSFKDGAGNSFDLSSLSRYSDNWEAITGTGDPEHYLINVCKSLAPQAGTEPCPPEAAACLLGGSKPVNLGRVRDGPQWRDGIIVLKYVDGDLCPDGIRKKSTTIRFTCSESQVNSRPMFISAVEDCEYTFAWPTATACPMKSNEHDDCQVTNPSTGHLFDLSSLSGRAGFTAAYSEKGLVYMSICGENENCPPGVGACFGQTRTSVGKANKRLRYVDQVLQLVYKDGSPCPSKSGLSYKSVISFVCRPEAGPTNRPMLISLDKQTCTLFFSWHTPLACEQATECSVRNGSSIVDLSPLIHRTGGYEAYDESEDDASDTNPDFYINICQPLNPMHGVPCPAGAAVCKVPIDGPPIDIGRVAGPPILNPIANEIYLNFESSTPCLADKHFNYTSLIAFHCKRGVSMGTPKLLRTSECDFVFEWETPVVCPDEVRMDGCTLTDEQLLYSFNLSSLSTSTFKVTRDSRTYSVGVCTFAVGPEQGGCKDGGVCLLSGTKGASFGRLQSMKLDYRHQDEAVVLSYVNGDRCPPETDDGVPCVFPFIFNGKSYEECIIESRAKLWCSTTADYDRDHEWGFCRHSNSYRTSSIIFKCDEDEDIGRPQVFSEVRGCDVTFEWKTKVVCP(SEQ ID NO8) 重組蛋白在懸浮HEK293細胞中瞬時表達(參見圖3B)。蛋白質從培養物上清液中收集，並通過鎳瓊脂糖純化，然後進行生物素化。具體而言，來自用質粒p1288和p1355轉染的細胞的上清液按照製造商指導施加到1mL His GravitrapTM柱(GE Healthcare)中，用於純化His6-標記的受體結構域蛋白。濃縮洗脫液並交換到10mMTris pH8和25mM NaCl緩衝液中，然後按照製造商(Avidity)的描述，在含有70μg在具有25μL BiomixA、25μL BiomixB和4μLBirA酶的總體積為205μL的溶液中的受體的反應體系中，用BirA酶生物素化該蛋白。BirA酶處理在30℃下進行1.5h。然後反應體系稀釋20倍到His GravitrapTM結合緩衝液(GE Healthcare)，並在施加至His GravitrapTM柱，以除去BirA酶和游離生物素。洗脫液在4℃下儲存。
表面等離子體諧振分析 所有表面等離子體諧振檢測都在25℃下採用

3000儀器進行。SA傳感器晶片和表面活性劑P20從Biacore(Piscataway，NJ)獲得。所有的緩衝劑利用

過濾單元(0.2μm)過濾，平衡至室溫，並在使用之前立即脫氣。蛋白樣品在13,000×g下離心15min以除去任何可能在樣品中存在的粒子。
純化後的生物素化的野生型(1288FS)或突變型(1355FS)重組CI-MPR結構域10-13(Dom 10-13)蛋白固定到

抗生蛋白鏈菌素(SA)晶片上，其含有抗生蛋白鏈菌素共價連接至其的葡聚糖基質。在SA傳感器晶片進行對接後，用去離子水對SA晶片衝洗兩次。通過以20mL/min的流速注入60mL含有50mM NaOH/1M NaCl的緩衝液調節待偶聯的流動細胞。如上所述用水衝洗晶片。然後晶片如上所述用偶聯緩衝液(10mM HEPES pH 7.4/100mM NaCl)衝洗。生物素化的Dom 10-13蛋白1355FS和1288FS在偶聯緩衝液中稀釋至20ng/mL和4ng/mL。流動細胞(FC)1和2以高於FC 3和4的密度偶聯。FC 1和FC 3用突變Dom 10-13構建體固定，並用作參照表面(即，從FC 2減去由FC 1獲得的響應；從FC 4減去由FC 3獲得的響應)。FC 2和FC 4用野生型Dom 10-13構建體固定。FC 1通過以10mL/min的流速注入50mL的1355FS(20ng/ml)進行偶聯，而FC 2通過以10mL/min的流速注入50mL的1288FS(20ng/ml)進行偶聯，以達到最終約5,000諧振單位(RU)的偶聯水平。FC 3通過以10mL/min的流速注入50mL的1355FS(4ng/ml)進行偶聯，而FC 2通過以10mL/min的流速注入50mL的1288FS(4ng/ml)進行偶聯，以達到最終約1,000RU的偶聯水平。這些偶聯水平給出了對於IGF-II的800RU(FC2-1)或160RU(FC4-3)的理論Rmax和對於GAA-GILT的10,000RU(FC2-1)或2,000RU(FC4-3)的理論Rmax。在注入50ml含Dom 10-13構建體的偶聯緩衝液之後，晶片單獨用偶聯緩衝液衝洗(以10mL/min的流速注入10mL)。剩餘未結合的抗生蛋白鏈菌素結合位點用生物素通過以10μL/min的流速連續注入兩個10mL生物素(10mM)進行飽和。
偶聯之後，流動細胞在電泳緩衝液(10mM HEPES pH 7.0，150mM NaCl和0.005％(v/v)表面活性劑P20)中平衡。固定的Dom10-13構建體的活性通過單獨檢測受體對IGF-II的親和力加以確定。IGF-II(134mM)首先在電泳緩衝液中稀釋成1、5、10、25、50、75、100、250和500nM的最終濃度。將每個濃度的IGF-II以40mL/min的流速在2min內注入到晶片上(即，締合相)，接著單獨進行2min的電泳緩衝液的的注入(流速＝40mL/min)(即，解離相)。表面用10mM HCl以10mL/min的流速注入10mL進行再生。再生之後，流速增加到40mL/min，而晶片在開始下一注入之前容許平衡1min。
類似地，GILT-標記的GAA構建體701對其與Dom 10-13重組受體的結合親和力進行分析。該結構在電泳緩衝液中稀釋成1、5、10、25、50、75、100、250和500nM的最終濃度，並按照以上對IGF-II的描述進行注入。在GILT-標記的GAA構建體之後運行IGF-II濃度曲線以測試固定的Dom 10-13表面的完整性。
對於每一個分析物濃度，確定處於平衡的響應平均值，所得的平衡諧振單元對濃度描點作圖。利用BIAevaluationTM軟體(版本4.1)將數據擬合到穩態親和力模型。解離常數也利用1∶1的結合等溫模型確定。所有的響應數據按照Myszka(2000)Methods Enzymo.323325-3401中的描述進行雙重基準化(double-referenced)，其中用於對本體折射率貢獻變化的對照(即單獨注射電泳緩衝液)與利用突變Dom 10-13固定化的流動細胞平行進行並從所有結合傳感譜(sensorgram)減去。圖4A-B是顯示結合到CI-MPR的IGF-II和GILT-標記的GAA ZC-701的

分析的示例性濃度曲線。圖4A示出了IGF-II的結合曲線。圖4B示出了GILT-標記的GAAZC-701的結合曲線。兩種流動細胞對(即，FC2-1和FC4-3)的結果進行比較(圖4B)。
這些實驗結果表明，GILT-標記的GAA ZC-701對於CI-MPR具有親和力，是IGF-II的約0.8(表1)。這些數據表明，與IGF-II對CI-MPR的親和力相比，GILT-標記的GAA對於CI-MPR具有高親和力。儘管所測得的IGF-II對CI-MPR親和力的絕對值為27nM，但是據先前的文獻中報導，IGF-II結合到受體的結構域10-13的親和力比結合到天然受體的親和力低約10倍。Linnell et al.(2001)JBiol Chem.Jun 29；276(26)23986-91。因此，GILT-標記的GAA對天然受體的結合親和力也預期高10倍。
表1 實施例3N-連接的寡糖分析表明ZC-701缺乏M6P 利用PNG酶脫糖基化，接著用具有螢光檢測的HPLC分析的組合(Blue Stream Laboratories)，實施N-連接的寡糖分析以確定ZC-701的寡糖分布外形。
利用每個樣品的約100μg蛋白，通過N-聚糖酶以1∶100(酶對底物)的比率實施從糖蛋白樣品切割N-連接的糖(碳水化合物)。一旦釋放，就利用冷乙醇提取聚糖並通過離心實現乾燥。回收的寡糖在酸性條件下於氰基硼氫化鈉存在下用2-氨基苯甲醯胺(2-AB)標記。在衍生化步驟之後，通過

S樣品過濾導管(Prozyme)除去樣品中剩餘的過量染料和其他反應試劑。
通過HPLC-FLD進行的N-連接寡糖分析使用以下條件流動相A65％乙腈/35％的流動相B；流動相B250mM甲酸銨，pH4.4；檢測螢光(Ex330nm，Em420nm)；和HPLC梯度。
色譜峰進行積分，並基於峰保留時間進行比較。結果報導為每個總峰面積的每個糖型的面積％。根據這些分析，確定了在ZC-701上存在的主要寡糖結構是高甘露糖結構和一些複雜的觸角結構。然而，沒有檢測到甘露糖-6-磷酸結構。
實施例4攝取測定證實了在ZC-701表面上缺乏功能性M6P 重組GAA攝取到哺乳動物細胞中是通過與CI-MPR的相互作用介導的，CI-MPR存在於大多數哺乳動物細胞型的表面上。攝取取決於蛋白質表面的寡糖上存在M6P。
相反，由於在蛋白的N-端存在IGF-II來源的標籤，所以ZC-701對CI-MPR具有高親和力。在許多實驗中已經證實，ZC-701顯示沒有明顯的M6P-依賴型攝取入哺乳動物細胞中，這證實了在ZC-701表面上M6P的功能性缺乏。
實施細胞基攝取測定，以證實GILT-標記的或未標記的GAA進入靶細胞的能力。大鼠L6成肌細胞在攝取之前24h在24-孔板以每孔1×105個細胞的密度鋪放。在實驗開始時，從細胞除去介質，並用0.5mL攝取介質代替，該攝取介質包含濃度範圍為2～500nM的標記的或未標記的GAA。為了證實攝取的特異性，一些孔另外含有競爭劑M6P(5mM最終濃度)和/或IGF-II(18μg/mL的最終濃度)。18h之後，介質從細胞吸出，而細胞用PBS衝洗4次。然後，細胞用200μL CelLytic MTM細胞溶解緩衝液溶解，細胞溶解物利用4MU底物按照以下描述的分析GAA活性。蛋白採用PierceBCATM蛋白測定試劑盒進行確定。
在CHO細胞中產生的ZC-701典型攝取實驗結果如圖5所示。正如所觀察到的，ZC-701攝取到大鼠L6成肌細胞中實際上並未受到加入大摩爾過量的M6P的影響，而攝取完全被過量的IGF-II消除。相反，wtGAA(ZC-635)的攝取完全被加入過量的M6P消除，但實際上並未受到IGF-II競爭的影響。CHO-細胞產生的ZC-701攝取到哺乳動物細胞對過量M6P的抑制的不敏感性，表明CHO細胞中產生的ZC-701表面上M6P的功能性缺乏。
實施例5GILT-標記的GAA表明比未標記的GAA更有效的攝取 圖6示出了純化的GILT-標記的GAA(ZC-701)和野生型的未標記GAA(ZC-635)攝取進入L6成肌細胞的飽和曲線。在示例的實驗中，GILT-標記的GAA具有的K攝取＝7nM，而wt GAA具有的K攝取＝354nM。這說明，GILT-標記的GAA顯示出比未標記的GAA更有效的攝取，因為與未標記的GAA相比，需要顯著更低水平的GILT-標記的GAA以實現經由CI-MPR的最大攝取進入成肌細胞。
這也證明，GILT標籤不會干擾GAA的酶活性。
GAA PNP測定 GAA酶在50μL含100mM乙酸鈉pH 4.2和10mM對硝基苯酚(PNP)α-葡糖苷底物(Sigma N1377)的反應混合物中孵育。反應在37℃孵育20min，並用300μL 100mM碳酸鈉停止。在96-孔微滴定孔板上於405nm下測定吸收率，並與由對硝基苯酚(Sigma N7660)建立的標準曲線對照。1GAA PNP單位定義為水解的1nmolPNP/h。
GAA 4MU測定 GAA酶在20μL含有123mM乙酸鈉pH 4.0和10mM 4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferyl)α-D-葡糖苷酶底物(Sigma，目錄號#M-9766)的反應混合物中孵育。反應在37℃孵育1h，並用200μL含267mM碳酸鈉、427mM甘氨酸的緩衝液pH 10.7停止。在96-孔微滴定孔板上用355nm激發和460nm濾光器測定螢光，並與由4-甲基傘形酮(Sigma，目錄#M1381)建立的標準曲線對照。1GAA4MU單位定義為水解的1nmol 4-甲基傘形酮/h。
示例性GILT-標記的GAA和野生型未標記GAA的特定活性如表2所示。GILT-標記的GAA的酶活性堪與未標記的GAA相當。
表2GILT-標記的GAA ZC-701和野生型未標記的GAA的特定活性和Km *對於3個製劑確定的平均值 **對於兩個製劑確定的平均值 實施例6GAA在大鼠L6成肌細胞中的半衰期 按照以上的描述(參見實施例4)，利用在大鼠L6成肌細胞中的GILT-標記GAA和未標記的GAA進行攝取實驗。18h之後，含有酶的介質從細胞吸出，並用PBS衝洗細胞4次。此時，雙重孔(duplicate well)進行細胞溶解(時間0)，並且細胞溶解物在-80℃下冷凍。此後每天，進行雙重孔細胞溶解，並儲存用於分析。14天後，所有的細胞溶解物進行GAA活性分析。數據根據1級衰變方程ln Ct＝-kt+ln Co進行作圖，其中C是化合物濃度，t是以小時計的時間，而k是1級速率常數。圖7就是示出了GILT-標記的GAA和未標記的GAA(ZC-635)在大鼠L6成肌細胞中的半衰期的示例性圖示。圖7中示出的結果表明，標記和未標記的蛋白具有非常類似的半衰期，分別為6.5和6.7天。這表明，一旦在細胞內，GILT-標記的酶繼續保持與未標記的GAA具有類似的動力學。
實施例7攝取之後的GAA處理或加工 按照文獻Moreland et al.(2005)J.Biol.Chem..2806780-6791及其所包含的參考文獻的描述，哺乳動物GAA通常在溶酶體中經歷連續的蛋白水解處理。處理後的蛋白產生70kDa、20kDa、10kDa的肽和一些更小的肽的譜圖。為了確定GILT-標記的GAA是否與未標記的GAA類似被處理，來自上述攝取實驗的細胞溶解物的等分試樣通過蛋白質印跡進行分析。圖8A～B是顯示GILT-標記的GAA攝取到大鼠L6成肌細胞之後的蛋白水解處理的蛋白質印跡。圖8A是顯示通過單克隆抗體(識別具有IGF-II標籤的70kDa IGF-II肽和更大中間體)鑑定的肽譜圖的蛋白質印跡。在圖8A中所示的結果表明，攝取後就立即失去GILT標籤。圖8B是顯示通過單克隆抗體(識別70kDa肽和更大中間體)鑑定的在攝取後進入76kDa和70kDa物種的野生型和GILT-標記的GAA處理的蛋白質印跡。在該實驗中鑑定的多肽譜圖實際上對於標記和未標記的酶是相同的。這表明一旦進入細胞，GILT標籤就失去，而GILT-標記的GAA類似於未標記的GAA被處理。因此，有可能的是，一旦進入細胞內，GILT標籤對GAA的行為具有很少或沒有影響。
實施例8藥代動力學 在不同培養條件下生產的GILT-標記的GAA的藥代動力學在野生型129小鼠中進行檢測。GILT-標記的GAA ZC-701在三種不同培養條件下產生。三組三隻129小鼠用單劑量的10mg/kg ZC-701注入頸靜脈，該ZC-701從在3種替換介質中生長的細胞的培養物上清液純化得到。分別在注射前以及注射後15min、30min、45min、60min、90min、120min、4h和8h時進行血清取樣。然後殺死該動物。血清樣品通過定量蛋白質印跡進行分析。數據根據1級衰變方程ln Ct＝-kt+ln Co進行作圖，其中C是化合物濃度，t是以小時計的時間，而k是1級速率常數。半衰期從圖9所示的對數曲線(log圖)的線性部分獲得。GILT-標記的GAA蛋白的半衰期是紅線，PF-CHO，t1/2＝43min；橙線，CDM4，t1/2＝38min；綠線，CD17，t1/2＝52min。基於這些結果，在CDl 7介質中產生的蛋白具有最為有利的半衰期。這些結果表明，GILT-標記的GAA從循環系統中並沒有迅速地過度清除。
實施例9GAA的組織半衰期 該實驗的目的是確定一旦酶到達其靶組織時GILT-標記的GAA活性損失的速率。在龐貝氏症小鼠模型中，

看起來在各種肌肉組織中具有約6～7天的組織半衰期(申請號125141/0，屬於藥物評價和研究中心以及生物學評價中心，藥物學綜述(the Center forDrug Evaluation and Research and Center for Biologies Evaluation andResearch，Pharmacology Reviews))。
龐貝氏症小鼠(按照Raben(1998)JBC.27319086-19092描述的龐貝氏症鼠模型6neo/6neo，其公開內容結合於此作為參考)，用10mg/kg的未標記GAA(ZC-635)或GILT-標記的GAA ZC-701或GILT-標記的GAA ZC-1026注入頸靜脈。然後在注射後1、5、10和15天殺死小鼠。組織樣品均質化並根據標準程序檢測GAA活性。GILT-標記的GAA ZC-701和ZC-1026以及未標記的GAA ZC-635的組織半衰期根據在不同組織中的衰變曲線進行計算(圖10A，四頭肌組織；圖10B，心臟組織；圖10C，隔膜組織；以及圖10D，肝臟組織)。計算的半衰期值，總結在表3中。
未標記的蛋白質(ZC-635)的組織半衰期在不同組織中為9.1～3.9天，而GILT-標記的GAA ZC-701的半衰期在不同組織中為8.5～7.4天(表3)。這些範圍可能由於相對小的樣本量(3個動物/點)反映的是統計偏差，而不是顯著差異。
為了比較，根據圖9中所示的衰變曲線計算的在大鼠L6成肌細胞中ZC-701和未標記的野生型GAA(ZC-635)的半衰期分別為6.5天和6.7天。
表3在各種組織中標記和未標記的GAA的組織半衰期 這些數據表明，一旦進入龐貝氏症小鼠的細胞內，GILT-標記的GAA看起來保持與未標記的GAA類似的動力學。而且，對GILT-標記的GAA衰變動力學的認知可以有助於設計合適的給藥時間間隔。
實施例10GILT-標記的GAA攝取到C2C12小鼠成肌細胞的溶酶體中 C2C12小鼠成肌細胞在聚賴氨酸塗敷的載玻片(BDBiosciences)上生長並在存在(面板A)或不存在(面板B)100nMGILT-標記的GAA下於37℃和5％CO2下孵育18h。然後將細胞在生長介質中孵育1h，接著用D-PBS衝洗4次後，於室溫下用甲醇固定15min。接下來的孵育都在室溫下進行，每一次孵育由三次用D-BPS衝洗分隔開。除非明確指出，孵育進行1h。載玻片用0.1％triton X-100滲透15min，接著用封閉緩衝液(10％熱失活化馬血清(Invitrogen)的D-PBS溶液)封閉。載玻片用初次鼠單克隆抗-GAA抗體3A6-1F2(1∶5,000，在封閉緩衝液中)進行孵育，接著用二次兔抗-鼠IgG AF594結合抗體(Invitrogen A1 1032，1∶200，在封閉緩衝液中)進行孵育。然後，孵育FITC-結合大鼠抗-小鼠LAMP-1(BDPharmingen 553793，1∶50，在封閉緩衝液中)。載玻片用含DAPI的封固溶液(mounting solution)(Invitrogen)封固，並用裝配有異硫氰酸螢光素、德克薩斯紅(texas red)和DAPI過濾器的NikonEclipse 80i顯微鏡(Chroma Technology)觀察。採用通過MetaMorph軟體(UniversalImaging)控制的光度計級聯相機捕獲圖像。圖像採用Photoshop軟體(Adobe)合併。圖11示出了通過抗-GAA抗體所檢測信號的協同定位，該抗-GAA抗體具有由針對溶酶體標記物LAMP1的抗體所檢測信號。因此，該結果證實了GILT-標記的GAA被遞送至溶酶體。
實施例11體內糖原的清除 本實驗的目的是確定在向龐貝氏症小鼠單次IV注射GILT-標記的GAA或wt GAA之後，糖原從心臟組織清除的速率。
龐貝氏症小鼠(龐貝氏症小鼠模型6neo/6neo，在文獻Raben(1998)JBC.27319086-19092中描述，其公開內容結合於此作為參考)，用10mg/kg未標記的GAA(ZC-635)或GILT-標記的GAA(ZC-701)注入頸靜脈。然後在注射後1、5、10和15天的時間殺死小鼠。每一個數據點表示來自三隻鼠的平均值。根據標準程序進行心臟組織樣品的均質化，並分析糖原含量。基本採用按照Zhu et al.(2005)BiochemJ.，389619-628中描述的黑麴黴(A.niger)澱粉葡糖苷酶和

Red Glucose測定試劑盒(Invitrogen)檢測這些組織勻漿混合物中的糖原含量。圖12中所示的結果表明，來自用ZC-701處理的小鼠心臟組織顯示出糖原近乎完全清除，而用wt GAA處理的小鼠顯示出糖原含量僅僅發生細小變化。
實施例12龐貝氏症病理學的反轉 已經證實，本發明的治療用融合蛋白在體內比wt GAA在治療上更為有效。執行了一個研究以比較ZC-701和wt GAA從龐貝氏症小鼠的骨骼肌組織清除糖原的能力，使用龐貝氏症小鼠模型6neo/6neo動物(Raben(1998)JBC 27319086-19092)。龐貝氏症小鼠(5隻/組)接受每周4次的IV注射兩個劑量wt GAA或ZC-701(5mg/kg或20mg/kg)或載體中的一個。五隻未處理的動物用作對照，並接受每周4次注射鹽水溶液。動物在第2、3和4次注射之前1h接受口服苯海拉明(5mg/kg)。在本研究中，當動物不到48h齡時，為了使它們耐受，將龐貝氏症敲除小鼠經由皮下在頸部後頸注射25μgZC-701。在第4次注射後1周殺死這些小鼠，並收穫各種組織(膈、心臟、肺、肝、比目魚肌、四頭肌、腓腸肌、TA、EDL、舌)用於組織和生化分析。在這些組織勻漿物中的糖原含量採用黑麴黴澱粉葡糖苷酶和Amplex Red Glucose測定試劑盒檢測。研究設計總結在表4中。
表4 在不同組織勻漿物中的GAA酶水平採用標準程序測定，並且結果總結在表5中。
表5組織中的GAA水平 在這些組織中的糖原含量採用黑麴黴澱粉葡糖苷酶和AmplexRed Glucose測定試劑盒(Invitrogen)基本按照Zhu et al.(2005)Biochem J.，389619-628的描述進行檢測。糖原數據描述在圖13A-H中。正如圖13A-H所使用的，GAA 5是指在5mg/kg劑量的未標記GAA；GAA 20是指在20mg/kg劑量的未標記GAA；701 5是指在5mg/kg劑量的GILT-標記的GAA ZC-701；701 20是指在20mg/kg劑量的GILT-標記的GAA ZC-701。PBS用作對照。這些結果表明，GILT-標記的GAA(ZC-701)與未標記的GAA(ZC-635)相比，在其從各種肌肉組織清除糖原的能力方面具有明顯的優勢。具體而言，ZC-701在其從多種骨骼肌組織清除糖原的能力方面顯著地比wtGAA更為有效。接受兩種劑量任意之一的wt GAA的龐貝氏症小鼠所具有的糖原水平不同於PBS處理的動物糖原水平。相反，接受ZC-701的動物表現出顯著較低的糖原水平。
實施例13劑量、給藥時間間隔和主體年齡的優化 劑量 在之前的實驗中，5mg/kg的劑量在許多組織中在清除糖原上與20mg/kg的劑量一樣有效。劑量滴定實驗用於確定可以足以治療人類患者的最小有效劑量。每組5～7隻耐受性龐貝氏症敲除小鼠每周注射不同劑量的GILT-標記的GAA。例如，耐受性龐貝氏症小鼠以1.0、1.5、2、2.5、5、10、20mg/kg劑量進行注射。
龐貝氏症敲除小鼠注射8周，然後殺死。從不同組織取樣，並按照實施例11和12的描述確定糖原水平。糖原和酶分布的組織化學也根據標準程序進行測定。另外，生理學檢測如肌肉力量檢測和響應高碳酸血症的通氣可以按照文獻Mah et al.(2007)MolecularTherapy(在線公開)的描述在小鼠中使用氣壓計的全身體積描記法確定。
時間間隔 另外，評估了治療時間間隔並且對於給定劑量確定了產生臨床作用的最大時間間隔。，劑量滴定如上所述採用不同治療時間間隔例如每2、3或4周進行注射而進行。在骨骼肌組織例如比目魚肌或四頭肌中的糖原清除一般用作用於確定小鼠模型中劑量和治療時間間隔之間的最佳平衡的指示。如上所述的其他臨床相關檢測也可以使用。
例如，一個實驗設計用於考察GILT-標記的GAA給藥時間間隔在龐貝氏症小鼠模型中對其效能的影響。2～3月齡的龐貝氏症小鼠(Raben JBC 1998 27319086-19092)分成多個8隻動物的組。一組接受每周PBS注射(對照組)，一組接受每周5mg/kg GILT-標記的GAA注射，一組接受每隔一周的10mg/kg GILT-標記的GAA注射，一組接受每三周15mg/kg GILT-標記的GAA注射，而一組接受每四周20mg/kg GILT-標記的GAA注射。經過12周注射後的一周，所有動物都被宰殺。取樣進行分析的組織樣品包括心臟、比目魚肌、腓腸肌、EDL、TA、四頭肌、腰肌、膈、腦、舌。
分析包括生化糖原分析、糖原的組織化學染色、所選組織上的EM、所選組織上的免疫染色、通過ELISA的抗體血清樣品分析、在比目魚肌上的體外力-頻檢測(force-frequency measurement)、在有生命的研究部分期間尿中的葡萄四糖分析、治療方案之前和之後糖原含量的13C NMR譜確定。
其中劑量和時間間隔變化的條件的矩陣可以生成以形成對這些參數之間的關係的理解。
可以預測，以較高劑量用藥之間的更長時間間隔可以證實是有效的，由此為患有龐貝氏症的人提供較低負擔治療方案的解釋。例如，基於圖13A-H中所示的糖原數據，可以預測，5mg/kg的劑量每周給藥將會產生與每兩周10mg/kg或每三周20mg/kg的劑量給藥類似的效果。因此，預期每三或四周一次代替每兩周一次的GILT-標記的GAA灌注，在人龐貝氏症患者中將會足以實現療效。治療時間間隔越長是高度有利的，因為至少這將會降低患者的負擔和不便。
主體的年齡 確定了治療方法開始之時鼠齡對治療結果的影響。據報導，在龐貝氏症小鼠II型肌纖維中，自體吞噬液泡將隨時間而生成，這會幹涉正常的運輸途徑，包括外源酶向溶酶體的遞送。參見Fukuda etal(2006)Mol.Therapy，14(6)831-839；Fukuda et al.(2006)Ann.Neurol.，59(4)700-708；Fukuda et al.(2006)Autophagy.2(4)318-320。科學家已經證實，neo-rhGAA，其是具有高達6個化學偶聯合成的每個含2個M6P的寡糖的重組GAA，可以完全從13個月齡的龐貝氏症敲除鼠中清除糖原。Zhu et al，(2005)Biochem J.，389619-628。這表明如果採用對CI-MPR具有高親和力的酶，則Fukuda等報導的細胞病理學可以是可逆的。假定GILT-標記的GAA對於CI-MPR具有高親和力並且其向肌肉細胞的遞送比未標記的GAA更有效，則可以設想，足夠的GILT-標記的GAA酶可以遞送至溶酶體，從而清除糖原並隨後逆轉自體吞噬作用的建立。這在12～13月齡的龐貝氏症小鼠中直接進行試驗。這些小鼠接受每周20或40mg/kg GILT-標記的GAA的4次注射，並在最後的注射之後1周進行宰殺。基本按照Zhu et al.(2005)的描述，採用黑麴黴澱粉葡糖苷酶和AmplexRed Glucose測定試劑盒(Invitrogen)來評估糖原含量。按照Lynch etal，(2005)J.Histochem.Cytochem.，5363-73的描述通過組織化學染色也對糖原進行評價。
另外，實施測定以分析GILT-標記的GAA攝取進入具有從體吞噬作用的動物的獨立完整肌纖維中，，以如Fukuda等描述的與未標記的GAA相比，直接比較在這些條件下GILT-標記的GAA靶向溶酶體的能力。預期GILT-標記GAA靶向具有自體吞噬作用的肌纖維比未標記的酶更有效。
實驗14人類臨床研究 基於成功的動物治療，設計了GILT-標記的GAA在兒科龐貝氏症患者中的6個月I/II期劑量範圍研究。該臨床試驗是開放標籤概念驗證性人研究，實施以評價GILT-標記的GAA在患有幼發性龐貝氏症的患者中的安全性、耐受性、效能和藥代動力學。在該研究中，總體治療時間間隔是每兩周一次(每兩周地)。另外一方面期望增加的是其中以特定劑量進行治療的時間間隔是每3或4周1次。
該臨床試驗的主要目的包括確定在患有幼發性龐貝氏症的患者治療中，GILT-標記的GAA通過每兩周靜脈內灌注的4個劑量水平，即2.5、5、10和20mg/kg的效能。次要目的包括(1)評價在患有幼發性龐貝氏症的患者中通過每兩周靜脈內灌注給藥的4個不同劑量水平的GILT-標記的GAA的安全性和藥代動力學；(2)確定在患有幼發性龐貝氏症的患者中通過每兩周靜脈內灌注給藥的4個劑量水平的GILT-GAA的藥代動力學；以及(3)確定通過每兩周靜脈內灌注給藥的4個劑量水平的GILT-GAA的每一個對患有幼發性龐貝氏症的患者中的肌肉糖原存在的影響。該臨床試驗的詳細方案概要如表6所示。
表6人臨床試驗


圖14示出了臨床研究程序的詳細流程圖。
另外，期望包括一個使患者耐受或者免疫抑制患者的步驟。在其它溶酶體酶替代療法的臨床試驗中，觀察到許多患者產生針對GAA的高效價抗體。例如，這個現象在採用

的高雪氏病(Gaucher)患者中已經觀察到。在那種情況下，大多數患者自然地變成耐受性的並停止產生響應於治療方案的抗體。不期望受到理論的束縛，認為抗-GAA抗體將幹擾酶靶向CI-MPR，由此改變了酶的生物分布。一種耐受化策略是在GILT-標記的GAA治療之前或期間，用

(一種抗CD20的單克隆抗體)治療龐貝氏症患者。在龐貝氏症患者上所用的

劑量類似於在Sperr et al.(2007)Haematologica.Jan；92(1)66-71中教導的治療一些自身免疫性疾病中所用的劑量，該文獻的教導內容結合於此作為參考。這種化合物也聯合其他免疫抑制劑如類固醇一起使用。
基於活組織檢查材料的組織化學染色，用GILT-標記的GAA治療的龐貝氏症患者預期將證實在10～12周之後顯著清除糖原。Thurberg等設計了基於超微結構損傷的連續性將龐貝氏症分類成5階段細胞病理學。Thurberg et al.(2006)Lab.Invest.，861208-1220。例如，早期疾病階段1細胞含有在完整肌原纖維之間的少量糖原填充的溶酶體。階段3細胞含有許多糖原填充的溶酶體，其中由於溶酶體膜破裂所以許多糖原洩漏到細胞質中。這些階段看起來與Fukada等描述的自體吞噬累積相關。在治療開始之初對本研究中的患者進行細胞病理學分析，預期將會指示出臨床結果。響應的患者一般具有低百分數的存在更嚴重形式的細胞病理學的肌細胞。尤其是，具有超過50％階段2肌細胞的患者具有更好的臨床結果。這也可以設想，更小的患者一般會具有更佳的臨床結果，而具有更高百分比的I型肌肉纖維的患者也具有更好的臨床結果。
調節細胞病理學嚴重度的因素包括由於患者GAA等位基因的性質在患者中的殘餘GAA活性的存在；在治療開始之時患者的年齡；以及患者的免疫響應。例如，對GILT-標記的GAA的抗體響應在CRIM-陰性患者中更嚴重。
基於來自初始動物試驗的結果，GILT-標記的GAA預期將比未標記的GAA在人類患者治療中更為有效。可以預測，給予類似的劑量，具有給定細胞病理學水平的更高比例的患者，在酶替代療法開始時將會有利地響應於GILT-標記的GAA療法。例如，在對於

的關鍵臨床試驗中，18位患者中的12位在52周時肌肉中糖原降低超過20％。然而，僅僅18位中僅僅3位患者出現糖原含量降低50％或更高。Kishnani et al.(2007)Neurology，6899-109。基於動物試驗數據和Zhu等的工作，預期GILT-標記的GAA將會導致在大多數患者中糖原含量下降80％。用GILT-標記的GAA治療的更大比例的患者預期將會顯示在生理參數如運動功能、呼吸作用方面得到改進和提高，並且更多的患者預期將會在療法開始後存活1、2和5年。
具有更晚期的肌細胞細胞病理學開始酶替代療法的患者，例如大於6個月齡才開始療法的患者，在GILT-標記的GAA酶替代療法上也預期會在肌肉糖原上發生顯著降低，在呼吸容量、運動功能和更好的長期療效方面得以改進和提高。
參考文獻的併入
在本申請中引述的所有出版物和專利文獻都以其全文結合，如同將其每一單個出版物或專利文獻的內容結合到本文中的程度一樣。
序列表
齊斯特治療公司(ZYSTOR THERAPEUTICS，INC.)
用於治療龐貝氏症的方法
P25884BAY
PCT/US2007/023881
2007-11-13
8
PatentIn version 3.2
1
33
DNA
人工序列

PCR引物
1
ggaattccaa ccatgggagt gaggcacccg ccc 33
2
33
DNA
人工序列

PCR引物
2
gctctagact aacaccagct gacgagaaac tgc 33
3
276
DNA
人工序列

用於生產重組GILT標記的GAA ZC-701的DNA盒
3
gaattcacac caatgggaat cccaatgggg aagtcgatgc tggtgcttct caccttcttg 60
gccttcgcct cgtgctgcat tgctgctctg tgcggcgggg agctggtgga caccctccag120
ttcgtctgtg gggaccgcgg cttctacttc agcaggcccg caagccgtgt gagccgtcgc180
agccgtggca tcgttgagga gtgctgtttc cgcagctgtg acctggccct cctggagacg240
tactgtgcta cccccgccaa gtccgagggc gcgccg 276
4
971
PRT
人工序列

盒701用EcoRI和XbaI消化，通過用克倫諾DNA聚合酶處理鈍化
4
Met Gly Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val Leu Leu Thr Phe Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ala Ser Cys Cys Ile Ala Ala Leu Cys Gly Gly Glu Leu Val
20 25 30
Asp Thr Leu Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Ser Arg
35 40 45
Pro Ala Ser Arg Val Ser Arg Arg Ser Arg Gly Ile Val Glu Glu Cys
50 55 60
Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Ala Leu Leu Glu Thr Tyr Cys Ala Thr
65 70 75 80
Pro Ala Lys Ser Glu Gly Ala Pro Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala
85 90 95
Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala
100 105 110
Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys
115 120 125
Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro
130 135 140
Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu
145 150 155 160
Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro
165 170 175
Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met
180 185 190
Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg
195 200 205
Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro
210 215 220
Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile
225 230 235 240
Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala
245 250 255
Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro
260 265 270
Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu
275 280 285
Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro
290 295 300
Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu
305 310 315 320
Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala
325 330 335
Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr
340 345 350
Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser
355 360 365
Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro
370 375 380
Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr
385 390 395 400
Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro
405 410 415
Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp
420 425 430
Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln
435 440 445
Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala
450 455 460
Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly
465 470 475 480
Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile
485 490 495
Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro
500 505 510
Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln
515 520 525
Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe
530 535 540
Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro
545 550 555 560
Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile
565 570 575
Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn
580 585 590
Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys
595 600 605
Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly
610 615 620
His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp
625 630 635 640
Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu
645 650 655
Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr
660 665 670
Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro
675 680 685
Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr
690 695 700
Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu
705 710 715 720
Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His
725 730 735
Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys
740 745 750
Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala
755 760 765
Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly
770 775 780
Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu
785 790 795 800
Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala
805 810 815
Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr
820 825 830
Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro
835 840 845
Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val
850 855 860
Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp
865 870 875 880
Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile
885 890 895
Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr
900 905 910
Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val
915 920 925
Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn
930 935 940
Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu
945 950 955 960
Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys
965 970
5
2040
DNA
人工序列

His-生物素-Ci-Mpr結構域10-13
5
atgggaatcc caatggggaa gtcgatgctg gtgcttctca ccttcttggc cttcgcctcg 60
tgctgcattg ctgctggcgc gccgaccggt caccatcacc atcaccacgc gccgggcctg120
aacgacatct tcgaggccca gaagatcgag tggcacgaac ctttcgatct gactgaatgt180
tcattcaaag atggggctgg caactccttc gacctctcgt ccctgtcaag gtacagtgac240
aactgggaag ccatcactgg gacgggggac ccggagcact acctcatcaa tgtctgcaag300
tctctggccc cgcaggctgg cactgagccg tgccctccag aagcagccgc gtgtctgctg360
ggtggctcca agcccgtgaa cctcggcagg gtaagggacg gacctcagtg gagagatggc420
ataattgtcc tgaaatacgt tgatggcgac ttatgtccag atgggattcg gaaaaagtca480
accaccatcc gattcacctg cagcgagagc caagtgaact ccaggcccat gttcatcagc540
gccgtggagg actgtgagta cacctttgcc tggcccacag ccacagcctg tcccatgaag600
agcaacgagc atgatgactg ccaggtcacc aacccaagca caggacacct gtttgatctg660
agctccttaa gtggcagggc gggattcaca gctgcttaca gcgagaaggg gttggtttac720
atgagcatct gtggggagaa tgaaaactgc cctcctggcg tgggggcctg ctttggacag780
accaggatta gcgtgggcaa ggccaacaag aggctgagat acgtggacca ggtcctgcag840
ctggtgtaca aggatgggtc cccttgtccc tccaaatccg gcctgagcta taagagtgtg900
atcagtttcg tgtgcaggcc tgaggccggg ccaaccaata ggcccatgct catctccctg960
gacaagcaga catgcactct cttcttctcc tggcacacgc cgctggcctg cgagcaagcg 1020
accgaatgtt ccgtgaggaa tggaagctct attgttgact tgtctcccct tattcatcgc 1080
actggtggtt atgaggctta tgatgagagt gaggatgatg cctccgatac caaccctgat 1140
ttctacatca atatttgtca gccactaaat cccatgcacg gagtgccctg tcctgccgga 1200
gccgctgtgt gcaaagttcc tattgatggt ccccccatag atatcggccg ggtagcagga 1260
ccaccaatac tcaatccaat agcaaatgag atttacttga attttgaaag cagtactcct 1320
tgcttagcgg acaagcattt caactacacc tcgctcatcg cgtttcactg taagagaggt 1380
gtgagcatgg gaacgcctaa gctgttaagg accagcgagt gcgactttgt gttcgaatgg 1440
gagactcctg tcgtctgtcc tgatgaagtg aggatggatg gctgtaccct gacagatgag 1500
cagctcctct acagcttcaa cttgtccagc ctttccacga gcacctttaa ggtgactcgc 1560
gactcgcgca cctacagcgt tggggtgtgc acctttgcag tcgggccaga acaaggaggc 1620
tgtaaggacg gaggagtctg tctgctctca ggcaccaagg gggcatcctt tggacggctg1680
caatcaatga aactggatta caggcaccag gatgaagcgg tcgttttaag ttacgtgaat1740
ggtgatcgtt gccctccaga aaccgatgac ggcgtcccct gtgtcttccc cttcatattc1800
aatgggaaga gctacgagga gtgcatcata gagagcaggg cgaagctgtg gtgtagcaca1860
actgcggact acgacagaga ccacgagtgg ggcttctgca gacactcaaa cagctaccgg1920
acatccagca tcatatttaa gtgtgatgaa gatgaggaca ttgggaggcc acaagtcttc1980
agtgaagtgc gtgggtgtga tgtgacattt gagtggaaaa caaaagttgt ctgcccttga2040
6
679
PRT
人工序列

His-生物素-Ci-Mpr結構域10-13蛋白質序列
6
Met Gly Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val Leu Leu Thr Phe Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ala Ser Cys Cys Ile Ala Ala Gly Ala Pro Thr Gly His His
20 25 30
His His His His Ala Pro Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Ile Glu Trp His Glu Pro Phe Asp Leu Thr Glu Cys Ser Phe Lys Asp
50 55 60
Gly Ala Gly Asn Ser Phe Asp Leu Ser Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Asp
65 70 75 80
Asn Trp Glu Ala Ile Thr Gly Thr Gly Asp Pro Glu His Tyr Leu Ile
85 90 95
Asn Val Cys Lys Ser Leu Ala Pro Gln Ala Gly Thr Glu Pro Cys Pro
100 105 110
Pro Glu Ala Ala Ala Cys Leu Leu Gly Gly Ser Lys Pro Val Asn Leu
115 120 125
Gly Arg Val Arg Asp Gly Pro Gln Trp Arg Asp Gly Ile Ile Val Leu
130 135 140
Lys Tyr Val Asp Gly Asp Leu Cys Pro Asp Gly Ile Arg Lys Lys Ser
145 150 155 160
Thr Thr Ile Arg Phe Thr Cys Ser Glu Ser Gln Val Asn Ser Arg Pro
165 170 175
Met Phe Ile Ser Ala Val Glu Asp Cys Glu Tyr Thr Phe Ala Trp Pro
180 185 190
Thr Ala Thr Ala Cys Pro Met Lys Ser Asn Glu His Asp Asp Cys Gln
195 200 205
Val Thr Asn Pro Ser Thr Gly His Leu Phe Asp Leu Ser Ser Leu Ser
210 215 220
Gly Arg Ala Gly Phe Thr Ala Ala Tyr Ser Glu Lys Gly Leu Val Tyr
225 230 235 240
Met Ser Ile Cys Gly Glu Asn Glu Asn Cys Pro Pro Gly Val Gly Ala
245 250 255
Cys Phe Gly Gln Thr Arg Ile Ser Val Gly Lys Ala Asn Lys Arg Leu
260 265 270
Arg Tyr Val Asp Gln Val Leu Gln Leu Val Tyr Lys Asp Gly Ser Pro
275 280 285
Cys Pro Ser Lys Ser Gly Leu Ser Tyr Lys Ser Val Ile Ser Phe Val
290 295 300
Cys Arg Pro Glu Ala Gly Pro Thr Asn Arg Pro Met Leu Ile Ser Leu
305 310 315 320
Asp Lys Gln Thr Cys Thr Leu Phe Phe Ser Trp His Thr Pro Leu Ala
325 330 335
Cys Glu Gln Ala Thr Glu Cys Ser Val Arg Asn Gly Ser Ser Ile Val
340 345 350
Asp Leu Ser Pro Leu Ile His Arg Thr Gly Gly Tyr Glu Ala Tyr Asp
355 360 365
Glu Ser Glu Asp Asp Ala Ser Asp Thr Asn Pro Asp Phe Tyr Ile Asn
370 375 380
Ile Cys Gln Pro Leu Asn Pro Met His Gly Val Pro Cys Pro Ala Gly
385 390 395 400
Ala Ala Val Cys Lys Val Pro Ile Asp Gly Pro Pro Ile Asp Ile Gly
405 410 415
Arg Val Ala Gly Pro Pro Ile Leu Asn Pro Ile Ala Asn Glu Ile Tyr
420 425 430
Leu Asn Phe Glu Ser Ser Thr Pro Cys Leu Ala Asp Lys His Phe Asn
435 440 445
Tyr Thr Ser Leu Ile Ala Phe His Cys Lys Arg Gly Val Ser Met Gly
450 455 460
Thr Pro Lys Leu Leu Arg Thr Ser Glu Cys Asp Phe Val Phe Glu Trp
465 470 475 480
Glu Thr Pro Val Val Cys Pro Asp Glu Val Arg Met Asp Gly Cys Thr
485 490 495
Leu Thr Asp Glu Gln Leu Leu Tyr Ser Phe Asn Leu Ser Ser Leu Ser
500 505 510
Thr Ser Thr Phe Lys Val Thr Arg Asp Ser Arg Thr Tyr Ser Val Gly
515 520 525
Val Cys Thr Phe Ala Val Gly Pro Glu Gln Gly Gly Cys Lys Asp Gly
530 535 540
Gly Val Cys Leu Leu Ser Gly Thr Lys Gly Ala Ser Phe Gly Arg Leu
545 550 555 560
Gln Ser Met Lys Leu Asp Tyr Arg His Gln Asp Glu Ala Val Val Leu
565 570 575
Ser Tyr Val Asn Gly Asp Arg Cys Pro Pro Glu Thr Asp Asp Gly Val
580 585 590
Pro Cys Val Phe Pro Phe Ile Phe Asn Gly Lys Ser Tyr Glu Glu Cys
595 600 605
Ile Ile Glu Ser Arg Ala Lys Leu Trp Cys Ser Thr Thr Ala Asp Tyr
610 615 620
Asp Arg Asp His Glu Trp Gly Phe Cys Arg His Ser Asn Ser Tyr Arg
625 630 635 640
Thr Ser Ser Ile Ile Phe Lys Cys Asp Glu Asp Glu Asp Ile Gly Arg
645 650 655
Pro Gln Val Phe Ser Glu Val Arg Gly Cys Asp Val Thr Phe Glu Trp
660 665 670
Lys Thr Lys Val Val Cys Pro
675
7
2040
DNA
人工序列

His-生物素-Ci-Mpr結構域10-13 I1572T。下劃線序列變化導致點突變I1572T和生成診斷SpeI位點的沉默突變S1573。
7
atgggaatcc caatggggaa gtcgatgctg gtgcttctca ccttcttggc cttcgcctcg 60
tgctgcattg ctgctggcgc gccgaccggt caccatcacc atcaccacgc gccgggcctg120
aacgacatct tcgaggccca gaagatcgag tggcacgaac ctttcgatct gactgaatgt180
tcattcaaag atggggctgg caactccttc gacctctcgt ccctgtcaag gtacagtgac240
aactgggaag ccatcactgg gacgggggac ccggagcact acctcatcaa tgtctgcaag300
tctctggccc cgcaggctgg cactgagccg tgccctccag aagcagccgc gtgtctgctg360
ggtggctcca agcccgtgaa cctcggcagg gtaagggacg gacctcagtg gagagatggc420
ataattgtcc tgaaatacgt tgatggcgac ttatgtccag atgggattcg gaaaaagtca480
accaccatcc gattcacctg cagcgagagc caagtgaact ccaggcccat gttcatcagc540
gccgtggagg actgtgagta cacctttgcc tggcccacag ccacagcctg tcccatgaag600
agcaacgagc atgatgactg ccaggtcacc aacccaagca caggacacct gtttgatctg660
agctccttaa gtggcagggc gggattcaca gctgcttaca gcgagaaggg gttggtttac720
atgagcatct gtggggagaa tgaaaactgc cctcctggcg tgggggcctg ctttggacag780
accaggacta gtgtgggcaa ggccaacaag aggctgagat acgtggacca ggtcctgcag840
ctggtgtaca aggatgggtc cccttgtccc tccaaatccg gcctgagcta taagagtgtg900
atcagtttcg tgtgcaggcc tgaggccggg ccaaccaata ggcccatgct catctccctg960
gacaagcaga catgcactct cttcttctcc tggcacacgc cgctggcctg cgagcaagcg 1020
accgaatgtt ccgtgaggaa tggaagctct attgttgact tgtctcccct tattcatcgc 1080
actggtggtt atgaggctta tgatgagagt gaggatgatg cctccgatac caaccctgat 1140
ttctacatca atatttgtca gccactaaat cccatgcacg gagtgccctg tcctgccgga 1200
gccgctgtgt gcaaagttcc tattgatggt ccccccatag atatcggccg ggtagcagga 1260
ccaccaatac tcaatccaat agcaaatgag atttacttga attttgaaag cagtactcct 1320
tgcttagcgg acaagcattt caactacacc tcgctcatcg cgtttcactg taagagaggt 1380
gtgagcatgg gaacgcctaa gctgttaagg accagcgagt gcgactttgt gttcgaatgg 1440
gagactcctg tcgtctgtcc tgatgaagtg aggatggatg gctgtaccct gacagatgag 1500
cagctcctct acagcttcaa cttgtccagc ctttccacga gcacctttaa ggtgactcgc 1560
gactcgcgca cctacagcgt tggggtgtgc acctttgcag tcgggccaga acaaggaggc 1620
tgtaaggacg gaggagtctg tctgctctca ggcaccaagg gggcatcctt tggacggctg 1680
caatcaatga aactggatta caggcaccag gatgaagcgg tcgttttaag ttacgtgaat 1740
ggtgatcgtt gccctccaga aaccgatgac ggcgtcccct gtgtcttccc cttcatattc 1800
aatgggaaga gctacgagga gtgcatcata gagagcaggg cgaagctgtg gtgtagcaca 1860
actgcggact acgacagaga ccacgagtgg ggcttctgca gacactcaaa cagctaccgg 1920
acatccagca tcatatttaa gtgtgatgaa gatgaggaca ttgggaggcc acaagtcttc 1980
agtgaagtgc gtgggtgtga tgtgacattt gagtggaaaa caaaagttgt ctgcccttga 2040
8
679
PRT
人工序列

His-生物素-Ci-Mpr結構域10-13 I1572T蛋白質序列。I1572T突變加了下劃線。
8
Met Gly Ile Pro Met Gly Lys Ser Met Leu Val Leu Leu Thr Phe Leu
1 5 10 15
Ala Phe Ala Ser Cys Cys Ile Ala Ala Gly Ala Pro Thr Gly His His
20 25 30
His His His His Ala Pro Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys
35 40 45
Ile Glu Trp His Glu Pro Phe Asp Leu Thr Glu Cys Ser Phe Lys Asp
50 55 60
Gly Ala Gly Asn Ser Phe Asp Leu Ser Ser Leu Ser Arg Tyr Ser Asp
65 70 75 80
Asn Trp Glu Ala Ile Thr Gly Thr Gly Asp Pro Glu His Tyr Leu Ile
85 90 95
Asn Val Cys Lys Ser Leu Ala Pro Gln Ala Gly Thr Glu Pro Cys Pro
100 105 110
Pro Glu Ala Ala Ala Cys Leu Leu Gly Gly Ser Lys Pro Val Asn Leu
115 120 125
Gly Arg Val Arg Asp Gly Pro Gln Trp Arg Asp Gly Ile Ile Val Leu
130 135 140
Lys Tyr Val Asp Gly Asp Leu Cys Pro Asp Gly Ile Arg Lys Lys Ser
145 150 155 160
Thr Thr Ile Arg Phe Thr Cys Ser Glu Ser Gln Val Asn Ser Arg Pro
165 170 175
Met Phe Ile Ser Ala Val Glu Asp Cys Glu Tyr Thr Phe Ala Trp Pro
180 185 190
Thr Ala Thr Ala Cys Pro Met Lys Ser Asn Glu His Asp Asp Cys Gln
195 200 205
Val Thr Asn Pro Ser Thr Gly His Leu Phe Asp Leu Ser Ser Leu Ser
210 215 220
Gly Arg Ala Gly Phe Thr Ala Ala Tyr Ser Glu Lys Gly Leu Val Tyr
225 230 235 240
Met Ser Ile Cys Gly Glu Asn Glu Asn Cys Pro Pro Gly Val Gly Ala
245 250 255
Cys Phe Gly Gln Thr Arg Thr Ser Val Gly Lys Ala Asn Lys Arg Leu
260 265 270
Arg Tyr Val Asp Gln Val Leu Gln Leu Val Tyr Lys Asp Gly Ser Pro
275 280 285
Cys Pro Ser Lys Ser Gly Leu Ser Tyr Lys Ser Val Ile Ser Phe Val
290 295 300
Cys Arg Pro Glu Ala Gly Pro Thr Asn Arg Pro Met Leu Ile Ser Leu
305 310 315 320
Asp Lys Gln Thr Cys Thr Leu Phe Phe Ser Trp His Thr Pro Leu Ala
325 330 335
Cys Glu Gln Ala Thr Glu Cys Ser Val Arg Asn Gly Ser Ser Ile Val
340 345 350
Asp Leu Ser Pro Leu Ile His Arg Thr Gly Gly Tyr Glu Ala Tyr Asp
355 360 365
Glu Ser Glu Asp Asp Ala Ser Asp Thr Asn Pro Asp Phe Tyr Ile Asn
370 375 380
Ile Cys Gln Pro Leu Asn Pro Met His Gly Val Pro Cys Pro Ala Gly
385 390 395 400
Ala Ala Val Cys Lys Val Pro Ile Asp Gly Pro Pro Ile Asp Ile Gly
405 410 415
Arg Val Ala Gly Pro Pro Ile Leu Asn Pro Ile Ala Asn Glu Ile Tyr
420 425 430
Leu Asn Phe Glu Ser Ser Thr Pro Cys Leu Ala Asp Lys His Phe Asn
435 440 445
Tyr Thr Ser Leu Ile Ala Phe His Cys Lys Arg Gly Val Ser Met Gly
450 455 460
Thr Pro Lys Leu Leu Arg Thr Ser Glu Cys Asp Phe Val Phe Glu Trp
465 470 475 480
Glu Thr Pro Val Val Cys Pro Asp Glu Val Arg Met Asp Gly Cys Thr
485 490 495
Leu Thr Asp Glu Gln Leu Leu Tyr Ser Phe Asn Leu Ser Ser Leu Ser
500 505 510
Thr Ser Thr Phe Lys Val Thr Arg Asp Ser Arg Thr Tyr Ser Val Gly
515 520 525
Val Cys Thr Phe Ala Val Gly Pro Glu Gln Gly Gly Cys Lys Asp Gly
530 535 540
Gly Val Cys Leu Leu Ser Gly Thr Lys Gly Ala Ser Phe Gly Arg Leu
545 550 555 560
Gln Ser Met Lys Leu Asp Tyr Arg His Gln Asp Glu Ala Val Val Leu
565 570 575
Ser Tyr Val Asn Gly Asp Arg Cys Pro Pro Glu Thr Asp Asp Gly Val
580 585 590
Pro Cys Val Phe Pro Phe Ile Phe Asn Gly Lys Ser Tyr Glu Glu Cys
595 600 605
Ile Ile Glu Ser Arg Ala Lys Leu Trp Cys Ser Thr Thr Ala Asp Tyr
610 615 620
Asp Arg Asp His Glu Trp Gly Phe Cys Arg His Ser Asn Ser Tyr Arg
625 630 635 640
Thr Ser Ser Ile Ile Phe Lys Cys Asp Glu Asp Glu Asp Ile Gly Arg
645 650 655
Pro Gln Val Phe Ser Glu Val Arg Gly Cys Asp Val Thr Phe Glu Trp
660 665 670
Lys Thr Lys Val Val Cys Pro
67權利要求
1.一種用於治療主體的龐貝氏症的方法，包括向所述主體給予治療有效量的一種融合蛋白，所述融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)或其片段，以及溶酶體靶向結構域，其中，所述溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述溶酶體靶向結構域包含成熟人胰島素樣生長因子II(IGF-II)、或者其片段或序列變體。
3.根據權利要求2的方法，其中，所述溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸1和8-67。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，所述融合蛋白包含人GAA的胺基酸70-952。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，與野生型人GAA相比，所述融合蛋白上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，所述融合蛋白上不具有功能性M6P水平。
7.根據權利要求1所述的方法，其中，所述治療有效量為在2.5～20mg/kg所述主體體重的範圍內。
8.根據權利要求1所述的方法，其中，所述融合蛋白經由靜脈內給藥。
9.根據權利要求1所述的方法，其中，所述融合蛋白以每兩月、每月、每三周、每兩周、每周、每天給藥或以變化的時間間隔給藥。
10.一種用於治療主體的龐貝氏症的方法，包括向所述主體給予治療有效量的一種融合蛋白，所述融合蛋白包含成熟人胰島素樣生長因子II(IGF-II)的胺基酸1和8-67以及人酸性α-葡糖苷酶(GAA)的胺基酸70-952。
11.根據權利要求10所述的方法，其中，所述融合蛋白進一步包含在所述成熟人IGF-II的胺基酸和所述人GAA的胺基酸之間的間隔序列Gly-Ala-Pro。
12.根據權利要求10所述的方法，其中，與野生型人GAA相比，所述融合蛋白上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。
13.根據權利要求10所述的方法，其中，所述融合蛋白上不具有功能性M6P水平。
14.一種用於降低體內糖原水平的方法，包括向患有龐貝氏症的主體給予有效量的一種融合蛋白，所述融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)或其片段，以及溶酶體靶向結構域，其中，所述溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
15.根據權利要求14所述的方法，其中，所述溶酶體靶向結構域包含成熟人胰島素樣生長因子II(IGF-II)、或者其片段或序列變體。
16.根據權利要求15所述的方法，其中，所述溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸1和8-67。
17.根據權利要求14所述的方法，其中，所述融合蛋白包含人GAA的胺基酸70-952。
18.根據權利要求14所述的方法，其中，與野生型人GAA相比，所述融合蛋白上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。
19.根據權利要求14所述的方法，其中，所述融合蛋白上不具有功能性M6P水平。
20.根據權利要求14所述的方法，其中，所述治療有效量為在2.5～20mg/kg所述主體體重的範圍內。
21.根據權利要求14所述的方法，其中，所述融合蛋白經由靜脈內給藥。
22.根據權利要求14所述的方法，其中，所述融合蛋白以每兩月、每月、每三周、每兩周、每周、每天給藥或以變化的時間間隔給藥。
23.一種用於降低哺乳動物溶酶體中的糖原水平的方法，包括使有效量的一種融合蛋白靶向所述溶酶體，所述融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)或其片段，以及溶酶體靶向結構域，其中，所述溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
24.根據權利要求23所述的方法，其中，所述溶酶體靶向結構域包含成熟人胰島素樣生長因子II(IGF-II)、或者其片段或序列變體。
25.根據權利要求23所述的方法，其中，所述溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸1和8-67。
26.根據權利要求23所述的方法，其中，所述融合蛋白包含人GAA的胺基酸70-952。
27.一種用於降低患有龐貝氏症的主體的肌肉組織中的糖原水平的方法，包括向所述肌肉組織遞送有效量的一種融合蛋白，所述融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)或其片段，以及溶酶體靶向結構域，其中，所述溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
28.根據權利要求27所述的方法，其中，所述肌肉組織是骨骼肌。
29.一種用於治療主體與龐貝氏症有關的心肌病的方法，包括向所述主體給予有效量的一種融合蛋白，所述融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)或其片段，以及溶酶體靶向結構域，其中，所述溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
30.一種用於治療主體與龐貝氏症有關的肌病的方法，包括向所述主體給予有效量的一種融合蛋白，所述融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)或其片段，以及溶酶體靶向結構域，其中，所述溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
31.一種用於增加患有龐貝氏症的主體內酸性α-葡糖苷酶(GAA)活性的方法，包括向所述主體給予一種融合蛋白，所述融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)或其片段，以及溶酶體靶向結構域，其中，所述溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
32.一種適用於治療龐貝氏症的藥物組合物，包含治療有效量的一種融合蛋白，所述融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)或其片段，以及溶酶體靶向結構域，其中，所述溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
33.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中，所述溶酶體靶向結構域包含成熟人胰島素樣生長因子II(IGF-II)、或者其片段或序列變體。
34.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中，所述溶酶體靶向結構域包含成熟人IGF-II的胺基酸1和8-67。
35.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中，所述融合蛋白包含人GAA的胺基酸70-952。
36.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中，所述融合蛋白包含人GAA的胺基酸70-952以及成熟人IGF-II的胺基酸1和8-67。
37.根據權利要求36所述的藥物組合物，其中，所述融合蛋白包含在所述人GAA的胺基酸和所述成熟人IGF-II的胺基酸之間的間隔序列Gly-Ala-Pro。
38.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中，與野生型人GAA相比，所述融合蛋白上具有降低的甘露糖-6-磷酸(M6P)水平。
39.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中，所述融合蛋白上不具有功能性M6P水平。
40.根據權利要求32所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物進一步包含藥用載體。
全文摘要
本發明提供了用於通過向主體給予治療有效量的一種融合蛋白來治療該主體的龐貝氏症的方法，其中該融合蛋白包含人酸性α-葡糖苷酶(GAA)或其片段，以及溶酶體靶向結構域。該溶酶體靶向結構域以非甘露糖-6-磷酸依賴型方式結合人非陽離子依賴型甘露糖-6-磷酸受體。
文檔編號A61P3/00GK101636200SQ200780046965
公開日2010年1月27日 申請日期2007年11月13日 優先權日2006年11月13日
發明者喬納森·勒博茨, 約翰·馬加 申請人:齊斯特治療公司