將黃色穎殼的水稻品種的穎殼顏色改為褐色的育種方法
2023-04-22 22:48:01
將黃色穎殼的水稻品種的穎殼顏色改為褐色的育種方法
【專利摘要】本發明提供了一種將黃色穎殼的水稻品種的穎殼顏色改為褐色的育種方法，包含以下步驟：在穎殼顏色決定基因OsCAD2外顯子區選取靶標片段並構建植物CRISPR/Cas9打靶重組載體，導入水稻細胞並再生成苗，在通過對再生株系基因組目標片段的測序，獲取攜帶兩個等位OsCAD2基因同時發生功能缺失突變的株系，經過表型鑑定，實現穎殼顏色的改變。實驗表明，本方法可快速改變水稻品種的穎殼顏色。
【專利說明】將黃色穎殼的水稻品種的穎殼顏色改為褐色的育種方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及水稻生物技術育種領域，具體涉及一種將現有黃色穎殼的水稻品種的穎殼顏色改良為褐色的育種方法。
【背景技術】
[0002]我國的雜交水稻制種技術經過30多年的研究發展，不僅制種技術成熟，而且，制種產量也成倍提高，為我國主要農作物產量的持續提高起到了關鍵作用。但是，雜交水稻制種技術仍然存在制種效率不高，勞動強度大，種子質量難以控制，種子產量不穩定等問題。解決這些問題的有效路徑是實現全程機械化的混播制種。由於混播制種中存在父母本和雜交親本的混收混種，需要適當的標記區分雜交種子和親本。目前，水稻穎殼的顏色被認為是最具實用化前景的區分標記之一，因此發展快速改造水稻品種穎殼顏色的育種技術將有效促進雜交水稻混播制種技術的發展。
[0003]水稻穎殼顏色的遺傳機理目前已部分明確。非常規水稻穎殼顏色主要包括深金黃色(褐色)和黑色，其表現的性狀受到不同的基因調節。0sCAD2是一種可單獨控制水稻穎殼顏色的基因。0sCAD2編碼一種肉桂醇脫氫酶，可催化裂解羥基肉桂醛，是木質素合成途徑中的關鍵步驟。已有報導表明，秈稻品種浙輻802的突變體gh2中，0sCAD2基因第四外顯子中第554位的G突變為A，造成0sCAD2蛋白中相應的甘氨酸變為天冬氨酸，引起肉桂醇脫氫酶活性的喪失，從而引起gh2突變體的穎殼顏色變褐；而在粳稻品種日本晴中，反轉座子Tosl7插入造成0sCAD2表達提前終止，也造成了同樣穎殼顏色加深的性狀。
[0004]現代作物育種中，存在針對單個性狀的改良需求。這個時候，已雜交-回交為基礎的傳統育種的聚焦能力略顯不足，且育種周期長、成本也很高。與之不同，分子生物學技術，特別是最近發展出的基因打靶技術可以快速準確的為單基因的變化提供有效解決方案。特別是2013年起發展出的CRISPR/Cas9技術，具有高通量、操作簡單等優良特點，將在分子設計育種中發揮重要作用。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種將黃色穎殼的水稻品種的穎殼顏色改為褐色的育種方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟:
[0006]步驟1、在水稻穎殼顏色決定基因0sCAD2外顯子區中選取以鹼基NGG結尾的DNA片段作為靶標片段，其中，N代表鹼基A、G、C、T中的任意一種，所述靶標片段位於所述0sCAD2基因外顯子上；
[0007]步驟2、利用所述靶標片段，構建用於水稻0sCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，其中所述重組載體中包含具有所述靶標片段的嚮導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框；
[0008]步驟3、將所述重組載體導入水稻細胞，誘導含有所述靶標片段的嚮導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達，在嚮導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框的共同作用下，剪切0sCAD2基因的雙鏈靶標片段，再通過水稻細胞自身的DNA修復功能，在靶標位點隨機插入或缺失鹼基，實現水稻細胞內OsCAD2基因的功能缺失突變；
[0009]步驟4、用導入所述重組載體的水稻細胞再生若干水稻植株；
[0010]步驟5、對再生的水稻植株中0sCAD2基因包含靶標片段的DNA區段測序；
[0011]步驟6、選擇兩個等位0sCAD2基因都出現功能缺失突變的再生株系，進行表型觀察，選取穎殼顏色變褐的株系。
[0012]在一種實現方式中，所述祀標片段中的一條鏈具有5』 _(N)x-NGG-3』結構，(N)x表示數目為X的一條鹼基序列(N1, N2……NJ，N1, N2……Nx中的每一個表示A、G、C、T中的任意一個。
[0013]在一種實現方式中，X為19或20。
[0014]進一步地，所述功能缺失突變為正常0sCAD2編碼序列在靶標位點出現終止子或閱讀框移位。
[0015]在一種實現方式中，所述重組載體包含能夠在水稻細胞內表達的嚮導RNA表達框，其核苷酸序列如Seq ID N0.1所示，所述重組載體還包含能夠在水稻細胞內表達的Cas9核酸酶表達框，其核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
[0016]在一種實現方式中，所述嚮導RNA表達框包括:水稻U6啟動子,其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示； 結構特徵為(N)x的靶標序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第267至350位所示；以及Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第351至358位所示。
[0017]在一種實現方式中，所述Cas9核酸酶表達框包括玉米ZmUBI啟動子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第I至2031位所示，植物偏好密碼子改造後的Cas9編碼序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS終止子，其核苷酸序列如Seq IDN0.2第6347至6599位所示。
[0018]在一種實現方式中，步驟2具體包括:按照靶標序列的核酸排列順序，構建用於水稻0sCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體。嚮導RNA表達框由CRISPR RNA(crRNA)和sgRNA組成(對於不同位點的基因打靶來說，SgRNA是固定不變的，而CrRNA是根據靶位點的不同變化的)。所述重組載體中CRISPR RNA(crRNA)序列為步驟I中所述靶標區段5』-(N)X-NGG-3』中的(N)x或與之互補的序列。
[0019]該方法中，將重組載體導入水稻細胞的方法為PEG介導的水稻原生質體瞬時轉化或農桿菌介導的水稻愈傷組織穩定轉化。
[0020]所述步驟5包括通過基因組PCR方法克隆再生植株中0sCAD2基因包含靶標片段的DNA區段，並對擴增產物測序。所述基因組PCR方法為，針對包含靶標片段的基因組區域，設計位點特異性引物，以再生植株的基因組DNA為模板，擴增所述包含靶標片段的基因組區域。所述擴增產物測序是指，對PCR產物中的目的條帶測序。
[0021]該方法中所述兩個等位0sCAD2基因都出現功能缺失突變是指測序結果在0sCAD2基因靶標位點出現兩種功能缺失突變序列，且沒有出現野生型序列；其中所述功能缺失突變指的是正常0sCAD2編碼序列在靶標位點出現終止子或閱讀框移位。
[0022]本發明能夠通過對特定基因的剪切，實現基因突變，進而改變穎殼顏色。本發明針對水稻的特性專門設計了嚮導RNA和Cas9核酸酶表達框，來實現本發明的目的。
[0023]本發明一種實現方式中所米用的嚮導RNA表達框的核苷酸序列為:[0024]
【權利要求】
1.一種將黃色穎殼的水稻品種的穎殼顏色改為褐色的育種方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟: 步驟1、在水稻穎殼顏色決定基因0SCAD2外顯子區中選取以鹼基NGG結尾的DNA片段作為靶標片段，其中，N代表鹼基A、G、C、T中的任意一種，所述靶標片段位於所述OsCAD2基因外顯子上； 步驟2、利用所述靶標片段，構建用於水稻OsCAD2基因打靶的CRISPR/Cas9重組載體，其中所述重組載體中包含具有所述靶標片段的嚮導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框； 步驟3、將所述重組載體導入水稻細胞，誘導含有所述靶標片段的嚮導RNA表達框和Cas9核酸酶表達框在水稻細胞中共同表達，剪切OsCAD2基因的雙鏈靶標片段，再通過水稻細胞自身的DNA修復功能，在靶標位點隨機插入或缺失鹼基，實現水稻細胞內OsCAD2基因的功能缺失突變； 步驟4、用導入所述重組載體的水稻細胞再生若干水稻植株； 步驟5、對再生的水稻植株中OsCAD2基因包含所述靶標片段的DNA區段測序； 步驟6、選擇兩個等位OsCAD2基因都出現功能缺失突變的再生株系，進行表型觀察，選取穎殼顏色變褐的株系。
2.根據權利要求1所述的育種方法，其特徵在於，所述靶標片段中的一條鏈具有5，- (N) x-NGG-3， 結構，(N) x表示數目為X的一條鹼基序列{N」 N2......Nj，N1, N2......Nx中的每一個表不A、G、C、T中的任意一個。
3.根據權利要求2所述的育種方法，其特徵在於，X為19或20。
4.根據權利要求1所述的育種方法，其特徵在於，所述功能缺失突變為正常OsCAD2編碼序列在靶標位點出現終止子或閱讀框移位。
5.根據權利要求1所述的育種方法，其特徵在於，所述重組載體包含能夠在水稻細胞內表達的嚮導RNA表達框,其核苷酸序列如Seq ID N0.1所示,所述重組載體還包含能夠在水稻細胞內表達的Cas9核酸酶表達框，其核苷酸序列如Seq ID N0.2所示。
6.根據權利要求5所述的育種方法，其特徵在於， 所述嚮導RNA表達框包括:水稻U6啟動子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第I至246位所示；結構特徵為(N)x的靶標序列和人工合成的SgRNA骨架序列，其核苷酸序列如SeqID N0.1第267至350位所示；以及Poly-T終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.1第351至358位所示。
7.根據權利要求5所述的育種方法，其特徵在於， 所述Cas9核酸酶表達框包括玉米ZmUBI啟動子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第I至2031位所示，植物偏好密碼子改造後的Cas9編碼序列，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第2034至6305位所示；以及tNOS終止子，其核苷酸序列如Seq ID N0.2第6347至6599位所示。
【文檔編號】C12N15/82GK103981212SQ201410210447
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月16日 優先權日:2014年5月16日
【發明者】魏鵬程, 楊劍波, 李莉, 宋豐順, 馬卉, 倪金龍, 秦瑞英, 李 浩, 陸徐忠, 楊亞春 申請人:安徽省農業科學院水稻研究所