一種產紫杉醇的青黴BP6T3及其應用的製作方法

2023-04-23 06:15:41

本發明屬於微生物
技術領域：
，具體涉及一種從巴山榧樹中分離出的青黴bp6t3，該菌株具有高產紫杉醇的特性，還涉及青黴bp6t3在治療腫瘤細胞中的應用。
背景技術：
：根據內共生理論，內生真菌可能產生與宿主相同或相似的次生代謝產物，而藥用植物是中藥的重要來源，因此藥用植物的內生真菌可能產生與中藥相同或相似的化合物。根據這一觀點，藥用植物內生真菌一直是近年來篩選一些重要醫用藥物的理想途徑，特別是生產成本高、價格昂貴或其它途徑不易得到的藥物。近年來在植物內生真菌中發現的有益次生代謝產物的結構類型主要有：萜類、黃酮類、異香豆素類、生物鹼類、苯並呋喃類、多肽類、甾體化合物等。植物與其內生菌構成了穩定的共生關係。植物莖和葉的化石提供的證據表明，植物與其內生菌之間的內生關係早在高等植物出現在地球上的時候就已存在，在植物與內生菌長期的協同進化，建立了獨特的遺傳與代謝關係[王梅霞，陳雙林，閆淑珍，霍娟.一株產黃酮銀杏內生真菌的分離鑑定與培養介質的初步研究[j].南京師大學報(自然科學版)，2003，26(1)：106-110.]。由於植物與內生菌相互間基因交換的結果，使內生菌具有產生某些與植物相同或相似化合物的能力，因此，可作為天然活性物質的重要來源。目前已經發現了能夠產生抗腫瘤的多種植物內生菌，紅豆杉屬植物內生菌產生的抗癌物質紫杉醇是一個典型的例子。紫杉醇及其類似物是一種高效、低毒、廣譜、作用機制獨特的天然抗腫瘤藥物，屬於二萜生物鹼。它的相對分子質量為853.9，熔點213-216℃，為白色結晶粉末，具有高度親脂性，不溶於水，易溶於氯仿、丙酮、甲醇等有機溶劑(李媛，李振宇.天然抗癌藥物—紫杉醇[j].中山大學研究生學刊(自然科學、醫學版)，2006，27(4)：58～61.)，其化學結構式(wanimc,taylorhl,wallme,etal.plantantitumoragents.vi.theisolationandstructureoftaxol,anovelantileukemicandantitumoragentfromtaxusbrevifolia[j].jamchemsoc,1971,93:2325～2327.)如圖1。上世紀五十年代末，美國國家癌症研究所制定了一項從全美植物中篩選抗癌活性物質的龐大計劃。受該計劃資助，wall和wani於1963年從太平洋紅豆杉(taxusbrevifolia)樹皮中提取出紫杉醇粗提物，1966年，紫杉醇得到純化，並確定了它的結構。隨後幾年，證明其具有較高的抗b16黑色瘤活性。1979年，schiff和horwitz闡明了紫杉醇特異性結合於分裂中的細胞如癌細胞的維管束蛋白，尤其是β－微管蛋白。至1992年12月29日，美國食品藥品管理局(fda)批准bristol-myers-squibb(bms)公司將紫杉醇上市，商品名為taxol，主要用於治療卵巢癌和乳腺癌。隨著對紫杉醇的需求量日益增大(紫杉醇在紅豆杉屬植物樹皮中的含量僅約為0.003﹪-0.069﹪)，尋找紫杉醇的新來源已經成為當務之急。自第一株產紫杉醇植物內生真菌被發現以後，利用微生物發酵生產紫杉醇為解決紫杉醇藥源危機提供了一條新的途徑。目前發現的紫杉醇產生菌近30種。在發現的這麼多產生菌中，有的已經確定了能產紫杉醇，有的初步推斷有可能產紫杉醇的真菌，其中19個僅僅是通過tlc或hplc的色譜方法來檢測。strobel等(strobelg,yangxs,searsj,etal,taxolfrompestalotiopsismicrospora,anendophyticfungusoftaxuswalachiana[j].microbiology,1996,142:435～440.)在分離產紫杉醇真菌的方法中，綜合使用了色譜、質譜、光譜和核磁共振以及免疫化學，非常有效地確定了產紫杉醇的真菌，並經過發酵準確地測定了紫杉醇的含量，所分離的產紫杉醇的真菌中，產率最高的是1996年從西藏紅豆杉中分離的，其產率達到了60-70μg/l，產量極為有限。迄今為止，產紫杉醇內生真菌菌株主要從瀕危物種紅豆杉屬的植物中分離，卻忽略了紅豆杉科中其它屬植物。有研究表明，紅豆杉科榧屬植物中也發現有紫杉烷類化合物，但含量極低，紫杉醇含量低於0.003％，認為藥用開發價值不大(易官美，邱迎春.榧樹的研究現狀與發展[j].資源與環境，2013，29(8)：844-848.)。劉豔等從海南粗榧(cephalotaxushainanensisli)中分離到的產次生代謝產物的菌種，主要產生的抗腫瘤物質為三尖杉酯鹼類化合物(劉豔等.海南粗榧內生真菌ch1307鑑定及其抗腫瘤活性研究[d].海南大學,2012.蔣春潔.海南粗榧內生真菌抗腫瘤活性菌株篩選[d].海南大學,2014.)本發明的目的是從神農架國家地質森林公園巴山榧樹(紅豆杉科，榧屬)組織中分離內生真菌，通過抑菌試驗，篩選出具有抗菌活性植物的內生真菌；再通過高效液相色譜分析和抗腫瘤活性分析，篩選出產生紫杉醇或類似物次生代謝產物的菌種，並通過用液質聯用儀進行定性檢測，推測該菌株產生的紫杉烷類化合物為紫杉醇。技術實現要素：本發明的目的是在於提供了一種從巴山榧樹中分離出的內生菌青黴(penicilliumsp.)bp6t3，該菌株具有抗金黃色葡萄球菌(g+)和大腸桿菌(g-)活性，同時還具有高產紫杉醇的特性。本發明的另一個目的是在於提供了一種青黴bp6t3的培養方法，通過在培養基中添加前體物質l-苯丙氨酸，紫杉醇的產量可增長425.17％。本發明的再一個目的是在於提供了一種青黴bp6t3在製備治療腫瘤細胞藥物中的應用，經試驗證明，青黴bp6t3發酵液提取物對hela腫瘤細胞具有明顯的抑制作用。為了達到上述的目的，本發明通過下述技術方案實現：一種青黴(penicilliumsp.)bp6t3的分離篩選方法，其步驟是：1、將巴山榧樹的根、莖、葉、樹皮分別用無菌水衝洗後，無菌吸水紙吸乾，分別經75％(v/v)的酒精消毒5min和2％(v/v)次氯酸消毒8min，然後用無菌水衝洗，用無菌刀將採集到的根、莖和樹皮切成小段，取各部位的材料置於pda固體培養基平皿，於28℃恆溫箱中培養，待上述平皿中接種物切面邊緣長出細小菌絲，挑取菌絲轉接入新的pda固體平板上純化直至為純培養物；2、用菌絲尖端接種法將純化的真菌接種至pda平板上，28℃培養，記錄菌落大小、顏色、菌絲緻密程度、菌落邊緣是否整齊、菌落生長速度以及產色素情況；3、用瓊脂塊法測定內生真菌的抑菌活性：將待測供試細菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)用lb培養基活化後，分別塗布於lb固體培養基表面，每個平皿中接種帶有瓊脂培養基的內生菌，37℃培養1-2天，觀察瓊脂塊周圍的抑菌圈，獲得一株具有同時具有抗金黃色葡萄球菌(g+)和大腸桿菌(g-)活性的菌株，記為bp6t3；4、經過平皿培養，觀察該菌株菌落顏色呈綠色，菌落質地為絲絨狀，顯微鏡下菌絲為多細胞分枝，菌絲有橫隔；分生孢子梗亦有橫隔，基部無足細胞，頂端不形成膨大的頂囊，其分生孢子梗經過多次分枝，產生2輪不對稱的小梗，形如掃帚，分生孢子球形或橢圓形，光滑或粗糙；大部分孢子生長時呈藍綠色，菌絲發生直立的多細胞分生孢子梗，其上各生一串灰綠色分生孢子，由此可初步鑑定為青黴(penicilliumsp.)菌株bp6t3；5、將菌株bp6t3在pda液體培養基中，180rpm、28℃活化3天，作為種子液，將種子液以5％(v/v)的接種量，接入pda液體培養基中，180rpm，28℃培養7-10天收穫發酵液；6、發酵結束後，收集濾液，濾液中加入1/3體積的乙酸乙酯，逆流萃取3次，收集上層有機相，於旋轉蒸發儀中除去有機溶劑，獲得萃取物，萃取物的含量平均為105mg/l；7、高效液相色譜(hplc)測定，發現抽提物中含有與紫杉醇標準品保留時間基本一致的成分，測得保留時間為12.8min，與標準品保留時間相近，表明其含有紫杉醇或類似物；8、液質聯用儀測定代謝抽提物中紫杉醇類似物的結構，表明其母離子da為876.300，子離子da分別為307.900、591.200和531.200，源電壓均為150，碰撞能分別為36、36和40，與紫杉烷類化合物紫杉醇標準品完全一致，故判斷青黴bp6t3產生的紫杉醇或類似物為紫杉醇。所述的青黴(penicilliumsp.)bp6t3，保藏於中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏地址：中國.武漢.武漢大學，保藏日期：2016年6月8日，保藏編號：cctccno.m2016320，其特徵是具有抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活性，發酵液中紫杉醇的含量達到16.59mg/l。青黴bp6t3高產紫杉醇的培養方法：在pda培養基中添加前體物質l-苯丙氨酸可增加紫杉醇的產量，實驗表明添加3.0mg/l的l-苯丙氨酸可將青黴bp6t3的紫杉醇產量增長425.17％。青黴bp6t3在製備預防或治療腫瘤細胞藥物中的應用：通過cck-8法測定青黴bp6t3的發酵液提取物對hela細胞的抑制作用，結果表明隨著提取物濃度的升高，對細胞增殖的抑制作用增強，其中以10.57μg/ml濃度處理的抑制作用最強，抑制率為56.68％，再根據液質聯用測定結果，故推測青黴bp6t3產生的抗hela細胞物質為紫杉醇。與現有技術相比，本發明具有以下優點和有益效果：1、本發明是從巴山榧樹(紅豆杉科，榧屬)組織中分離的內生真菌，從紅豆杉屬以外的植物中分離到具有產生紫杉醇或類似物能力的植物內生真菌，大大擴大了獲取產生紫杉醇或類似物菌種的資源範圍，有利於更廣泛地利用微生物資源。2、該植物內生菌青黴bp6t3可以非常穩定地產生紫杉醇，其脂溶性提取物含量平均約為105mg/l，紫杉醇相對百分含量為15.8％，紫杉醇的產量為16.59mg/l，高於現有技術已公開的產量(strobelg,yangxs,searsj,etal.taxolfrompestalotiopsismicrospora,anendophyticfungusoftaxuswalachiana[j].microbiology,1996,142:435～440；邱德有等.一種雲南紅豆杉內生真菌的分離，《菌物學報》,1994(4):314-316；lij,etal.ambuicacid,ahighlyfunctionalizedcyclohexenonewithantifungalactivitypestalotiopsisspp.andmonochaetiaspphytochemistry,2001,56(5):463-468；周東坡，平文祥，孫劍秋等.紫杉醇產生菌分離的研究[j].微生物學雜誌，2001，2l(1)：18—20；趙凱，平文祥,馬璽等，紫杉醇高產菌株的原生質體誘變選育及其遺傳變異初探，微生物學報，2005，45(3)：355-358.)；以l-苯丙氨酸為前體，紫杉醇的產量可增長425.17％。3、經cck-8試劑法檢驗，青黴bp6t3發酵液提取物對hela腫瘤細胞具有顯著的抑制作用，抑制率最高達到56.68％，推測青黴bp6t3產生的抗hela細胞物質為紫杉醇。4、利用本發明的植物內生菌青黴bp6t3發酵生產紫杉醇，可以不受資源、環境、條件、設備等的各種限制，短時間、大規模進行生產。附圖說明圖1為紫杉醇的化學結構式圖2為青黴bp6t3的菌苔照片圖3為青黴bp6t3的顯微照片圖4為紫杉醇的標準品高效液相(hplc)色譜圖，箭頭所示峰為紫杉醇標準品圖5為青黴bp6t3代謝抽提物的高效液相(hplc)色譜圖，箭頭所示峰為紫杉醇/紫杉醇類似物具體實施方式實施例1：巴山榧樹植物內生菌的分離純化1、巴山榧樹材料的預處理於湖北省神農架國家地質森林公園採集巴山榧樹的根、莖、葉、樹皮，用無菌水衝洗後，吸乾；分別經75％(v/v)的酒精消毒5min和2％(v/v)次氯酸消毒8min，然後用無菌水衝洗3遍；再用無菌刀將採集到的根、莖和樹皮切成與葉片約2-3cm，葉片從中間切出剖面。2、巴山榧樹植物內生菌的分離取預處理的各部位的材料置於pda固體培養基平皿，在28℃培養；pda培養基組成：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，kh2po41.0g，mgso4·7h2o0.5g，水1000ml，加瓊脂(15％)為pda固體培養基。3、巴山榧樹植物內生菌的純化當平皿中接種物切面邊緣長出細小菌絲時，在無菌條件下用接種針挑取菌絲接入新配製pda固體平板上，在pda斜面培養基上反覆純化，直至得到純培養物。實施例2：內生真菌抑菌活性檢測1、將供試細菌(金黃色葡萄球菌、大腸桿菌)用lb液體培養基活化後，分別塗布於lb固體培養基表面；2、切下實施例1獲得的純化植物內生菌瓊脂培養基塊，分別放置接種於金黃色葡萄球菌和大腸桿菌平皿中，37℃培養1-2天，觀察瓊脂塊周圍的抑菌圈。通過上述方法，篩選獲得一株同時具有抗金黃色葡萄球菌(g+)和抗大腸桿菌(g-)活性的菌株，記為bp6t3。實施例3：內生真菌bp6t3的鑑定經過平皿培養特性觀察，該菌株菌落顏色呈綠色，菌落質地為絲絨狀(圖2)，顯微鏡下菌絲為多細胞分枝，菌絲有橫隔，分生孢子梗亦有橫隔，基部無足細胞，頂端不形成膨大的頂囊，其分生孢子梗經過多次分枝，產生2輪不對稱的小梗，形如掃帚，分生孢子球形或橢圓形，光滑或粗糙，大部分生長時呈藍綠色，菌絲發生直立的多細胞分生孢子梗，其上各生一串灰綠色分生孢子(圖3)，根據《中國真菌志(第35卷):青黴屬及其相關有性型屬》(孔華忠主編，中國真菌志(第三十五卷)青黴屬及其相關有性型屬[m].北京：科學出版社，2007，5～10.)可初步鑑定為青黴(penicilliumsp.)，記為bp6t3。實施例4：青黴bp6t3發酵液中脂溶性物質的提取1、將實施例2獲得的青黴bp6t3於pda液體培養基中活化(活化條件：28℃，180rpm，培養5-7天)，作為種子液；2、按照5％(v/v)的接種量接入pda液體培養基中，28℃，180rpm，培養7-10天；3、過濾收集濾液，濾液中加入1/3體積的乙酸乙酯，逆流萃取3次，收集上層有機相；4、於旋轉蒸發儀上35℃除去有機溶劑，用甲醇溶解粘在壁上的物質並揮發乾燥，通過重量法測定發酵液脂溶性提取物含量；測定青黴bp6t3發酵液中脂溶性提取物含量平均約為105mg/l。實施例5：高效液相色譜(hplc)定量檢測青黴bp6t3提取物紫杉醇類似物1、實施例4中獲得的脂溶性提取物及流動相處理：將實施例4中獲得的濃縮產物13200r/min離心2min，吸取上清液，經0.22μm孔徑濾膜過濾除去雜質，然後同配好的流動相(甲醇/水＝65/35，v/v)一起超聲波排氣，時間分別為3min、10～15min；2、色譜條件為：色譜柱，ods(c18)柱4.6×250mm,5nm；柱溫，常溫；樣品及流動相，甲醇/水＝65/35(v/v)；流速，1.0ml/min；樣品進樣量，20μl；紫外檢測波長，227nm；3、測得紫杉醇標準品(購自sigam)的rt(保留時間)為13～14min(圖4)；4、在實施例4製得的提取物樣品中發現與紫杉醇標準品保留時間基本一致的成分，出峰時間為12.8min(圖5)，可鑑定為紫杉醇類似物；5、使用hplc伍豐液相色譜工作站軟體根據色譜圖測算出青黴bp6t3代謝抽提物中紫杉醇類似物的相對峰面積為12887.11(圖5)，相對百分含量為15.8％。實施例6：青黴bp6t3發酵液提取物對hela腫瘤細胞的抑制作用1、取對數生長期的hela細胞(華聯科生物技術有限公司)鋪板，將細胞按100μl/孔(1～5×103個細胞/孔)接種於96孔板中，置於37℃，5％co2培養箱中培養24h；2、將實施例4中提取的和實施例5中初步鑑定為含紫杉醇類似物的的內生菌bp12±3發酵液提取物配置不同濃度(表1)，取10μl分別加入樣品孔中，37℃，5％co2培養箱中培養24h；3、取出培養板，吸去上清，每孔加入90μl新鮮培養液(含有10％胎牛血清的dmem培養液)和cck-810μl，同樣的條件下繼續培養4h；4、用酶標儀在450nm處讀取a450值，計算細胞生長抑制率，細胞生長抑制率計算：hela細胞抑制率(ir)＝(對照孔a值—樣品孔a值)/對照孔a值×100％(表1)。通過上述實驗，證明青黴bp6t3發酵液提取物對腫瘤細胞hela有明顯的抑制作用，並隨著提取物濃度的升高，對細胞增殖的抑制作用增強，當藥物濃度為0.1057μg/ml時，抑制率為24.14％，而當濃度增加到10.57μg/ml時，抑制率達到56.68％。表1cck-8法測定紫杉醇類化合物對hela細胞的抑制作用樣品濃度(μg/ml)a450值抑制率(％)空白對照1.100----0.10570.78324.14％1.0570.666635.47％10.570.44756.68％實施例7：液質聯用儀(hplc-ms)確定青黴bp6t3發酵液含有紫杉醇1、液相色譜儀器型號：島津lc-30auplc(1)樣品及流動相處理：將實施例4製備的青黴bp6t3發酵液的脂溶性提取物，13200r/min離心2min，吸取上清液，經0.22μm孔徑濾膜過濾除去雜質，然後同配好的流動相(乙腈/水＝65/35，v/v)一起超聲波排氣，時間分別為3min、10～15min；(2)色譜條件為：色譜柱，ods(c18)柱4.6x250mm,5nm；柱溫，常溫；樣品及流動相，甲醇/水＝65/35(v/v)；流速，1.0ml/min；樣品進樣量，20μl；紫外檢測波長，227nm；2、質譜儀器型號為absciex4500qqq(三重四級杆液質聯用儀)；經過液質聯用儀測定代謝抽提物中紫杉醇類似物的結構(表2)，表明其母離子da為876.300，子離子da分別為307.900、591.200和531.200，源電壓均為150，碰撞能分別為36、36和40，與紫杉烷類化合物紫杉醇標準品完全一致，可將青黴bp6t3發酵液中紫杉醇類似物定性為紫杉醇，故推測青黴bp6t3產生的抗hela細胞物質為紫杉醇。表2紫杉醇標準品與青黴bp6t3發酵液中紫杉醇類似物的質譜分析參數q1mass(da)q3mass(da)dpcedwell(msec)876.300307.9001503650876.300591.2001503650876.300531.2001504050實施例8：不同前體物質對青黴bp6t3產紫杉醇的影響1、配製苯甲酸鈉、乙酸鈉、l-苯丙氨酸3種前體溶液，在0.08mpa下滅菌20min；2、將青黴bp6t3接種於pda液體培養基，28℃，180rpm，發酵培養至第5天，將3種前體分別加入發酵培養基中，其中一瓶不加任何前體做為對照，前體添加量分別為l-苯丙氨酸溶液終濃度3.0mg/l，乙酸鈉溶液終濃度3.5g/l，苯甲酸鈉溶液終濃度32.0mg/l；3、每種發酵培養基中均補加蔗糖溶液，終濃度5.0g/l。培養至第10天，通過實施例4所述的方法提取青黴bp6t3脂溶性代謝產物並採用高效液相色譜(hplc)對代謝抽提物中紫杉醇進行定性和定量檢測，並計算紫杉醇的增長率，結果見表3。以l-苯丙氨酸為前體，紫杉醇的產量增加最多，增長率為425.17％，結果表明，l-苯丙氨酸能夠作為一種有效的前體物質，用於培養青黴bp6t3高效生產紫杉醇。表3不同前體對青黴bp6t3產紫杉醇的影響當前第1頁12