一種血管瘤病變型j亞群禽白血病突變體病毒株及其構建方法
2023-04-23 02:17:11
專利名稱：：一種血管瘤病變型j亞群禽白血病突變體病毒株及其構建方法
技術領域：
：本發明涉及微生物
技術領域：
，具體涉及血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒研究領域，尤其涉及一種E元件(XSR)缺失血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株及其構建方法。
背景技術：
：本發明人已經從血管瘤病變型禽白血病海蘭褐蛋雞中分離得到血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株，並獲得了血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的全長基因組序列，其核苷酸序列如SEQIDNO5所示。J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株與ALV-J原型株HPRS-103在LTR(長末端重複區)有相似的特點，即與其它亞群禽白血病病毒相比，在其3』LTR區域存在一個具有被稱作E元件的髮夾頸環結構，該元件以前僅存在於急性轉化型Rous肉瘤病毒src基因上遊或下遊，長約150bp。E元件的功能目前還不十分清楚，但它含有轉錄因子c/EBP的黏著位點且可發揮增強子的功能。在對於自然分離的重組嵌合病毒ALV-J/A研究中發現，E元件與致瘤性有關，但這個研究是以自然分離株為研究對象的，自然分離株存在著眾多的序列突變與缺失，而這些突變或缺失可能都會對病毒的致病性產生影響，從而影響了E元件在病毒致病性及其致病機理的研究。本發明人根據血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因序列，構建得到含有該基因序列的質粒pSK-ALV-HN，其構建步驟如下(1)根據血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因序列(其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示)設計六條特異性引物，其核苷酸序列如SEQIDNO:611所示；(2)利用核苷酸序列如SEQIDNO611所示的六條特異引物將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQIDNO5所示)分三段進行擴增，並分別克隆於PMD18-Tsimplevector載體，構建得到三個質粒，分別命名為pHN-A-T、pHN-B-T和pHN-C_T；以SEQIDNOl所示基因為模板，將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株病毒液接種雞胚成纖維細胞，7天後提取細胞總基因組DNA，做為模板，(3)將質粒ρΗΝ-Α-Τ、ρΗΝ_Β_Τ分別用Sail和EcoRI雙酶切消化，回收目的片段，經連接和轉化後，挑取單一菌落鑑定克隆，將獲得的重組質粒命名為pHN-(A+B)-T；(4)將pHN-(A+B)-T和pHN-C-T分別用KpnI和NotI雙酶消化，回收目的片段，經連接和轉化後，挑取單一菌落鑑定克隆，將最後獲得的重組質粒命名為PMD18-ALV-HN，並測序驗證，結果證明重組質粒PMD18-ALV-HN中含有血管瘤病變型ALV-JSCAU-HN06株前病毒全基因組序列；(5)將質粒PMD18-ALV-HN中含有血管瘤病變型ALV-JSCAU-HN06株前病毒全基因組序列亞克隆到pBlueskriptSK(-)載體，得到含有血管瘤病變型ALV-JSCAU-HN06株病毒基因的質粒，並命名為pSK-ALV-HN。
發明內容本發明的目的在於針對現有技術的不足，提供一株可用於E元件的病毒致病性及其致病機理研究的E元件缺失血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒株。本發明的另一個目的在於提供上述血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒株的構建方法。本發明的上述目的是通過如下方案予以實現的一種血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株，該病毒株為J亞群禽白血病感染性克隆化病毒rSCAU-HN06，已於2009年11月3日保藏於中國典型培養物保藏中心，其保藏編號為CCTCCNO:V200914。上述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株是採用感染型克隆技術，通過對血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQIDN0:5所示)進行E元件缺失，構建而得。上述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構建方法，具體包括如下步驟(1)特異性引物特異性引物一共四條，其核苷酸序列如SEQIDNO:14所示；(2)採用重疊PCR(OverlappingPCR)技術將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQIDNO5所示)CalI-NotI之間的E(XSR)序列缺失，並構建為質粒；將該質粒用Call，NotI雙酶切消化得到的片段與pSK-ALV-HN中的相應片段進行替換，得到pSK-ALV-HN-ΔE質粒；(3)將pSK-ALV-HN-ΔE質粒轉染病毒宿主細胞，經過培養後，收穫含有拯救病毒的細胞培養上清，並用該上清感染另一空白宿主細胞，盲傳9代後得到拯救的J亞群禽白血病感染性克隆化病毒rSCAU-HN06。上述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構建過程中，本發明人通過多次實驗設計以及對實驗結果的分析，確定選擇血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒上特異的單酶切位點CalI，以及作為載體的質粒pSK-ALV-HN上特異的單酶切位點NotI，可以很好地實現序列替換，從而構建並拯救出感染性克隆病毒。上述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構建過程中，將pSK-ALV-HN-ΔE質粒轉染病毒宿主細胞，因為ALV不感染哺乳動物細胞，所以這裡的病毒宿主細胞採用禽類細胞，採用本領域技術人員常用的禽類細胞均可實現本發明，如雞胚成纖維細胞(CEF)，或傳代成纖維細胞DF-I等。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果1.本發明以單一起源的感染性克隆化病毒rSCAU-HN06為基礎，進行E元件缺失，避免了自然分離毒序列中的突變與缺失對研究結果造成的幹擾；2.本發明設計特異引物，採用OverlappingPCR技術進行序列缺失，簡便易行3.本發明利用該病毒上特異的單酶切位點Call及載體上NotI位點進行序列替換，構建並拯救出感染性克隆病毒4.本發明採用低拷貝質粒pBlueskriptSK(-)為載體，使該質粒在菌體中能穩定的複製；5.本發明所構建的含有前病毒基因組的質粒以大腸桿菌為寄主，轉化率高。圖1為質粒pSK-ALV-HN-ΔE的構建流程圖；圖2為質粒pSK-ALV-HN-ΔE的酶切鑑定電泳圖；其中，M為Marker，1為質粒ρSK-ALV-HN-ΔE經SalI、NotI雙酶切產物，2為質粒pSK-ALV-HN經Sail、NotI雙酶切產物；圖3為RT-PCR驗證結果電泳圖；其中，M為Marker，1為E元件缺失片段，2為未缺失片段，3為無模板對照；圖4為感染性病毒驗證結果螢光顯微電鏡圖。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明做進一步地描述，但具體實施例並不對本發明做任何限定。實施例1特異性引物設計本實施例根據血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因序列(其核苷酸序列如SEQIDNO:5所示)，設計特異性引物，其核苷酸序列如SEQIDN0:14所示，引物由上海英駿生物技術限公司合成。實施例2血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株1.實驗材料雞胚成纖維細胞、ALV-J亞群特異性單抗JE9由揚州大學獸醫學院秦愛建教授惠贈；FITC-羊抗鼠IgG為R0CLAND公司產品；T4DNA連接酶為Promega公司產品；PrimeSTARHSDNAPolymerase為TaKaRa公司產品；限制性內切酶CalI、NotI為Fermentas公司產品；ALV-AgELISA試劑盒為IDEXX公司產品。2.血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構建首先是採用OverlappingPCR技術將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因(其核苷酸序列如SEQIDNO5所示)CalI-NotI之間的E(XSR)序列缺失，分別用SEQIDNO:1所示特異性引物和SEQIDNO:2所示特異性引物擴增E元件上遊序列，用SEQIDNO:3所示特異性引物和SEQIDNO:4所示特異性引物擴增E元件下遊序列，將上述兩擴增片段回收，按照等摩爾比混合作為模板，採用SEQIDNO:1所示特異性弓丨物和SEQIDNO:4所示特異性引物，利用融合PCR將兩片段融合，便得到E元件缺失片段，將該片段與PMD18-T載體連結，得到陽性質粒ρΔΕ-Τ。將ρΔE-T用Call，NotI雙酶切消化，得到的目的片段與pSK-ALV-HN經CalI-NotI雙酶切消化的載體片段連接，獲得含有缺失E元件的J亞群禽白血病病毒全長基因組質粒pSK-ALV-HN-ΔE(構建過程如圖1所示)。用SalI和NotI對質粒pSK-ALV-HN-ΔE和pSK-ALV-HN分別進行雙酶切鑑定。如圖2所示，pSK-ALV-HN-ΔE經酶切獲得前病毒基因組與載體兩條帶，分別為7496bp和2936bp；pSK-ALV-HN經酶切獲得前病毒基因組與載體兩條帶，分別為7642bp和2936bp。證明獲得pSK-ALV-HN-ΔE質粒。將pSK-ALV-HN-ΔE質粒轉染雞胚成纖維細胞，經過培養後，收穫含有拯救病毒的細胞培養上清，並用該上清感染另一空白宿主細胞，盲傳9代後提取細胞總RNA為模板，進行RT-PCR驗證。上述RT-PCR驗證也就是以SEQIDNO:1和SEQIDNO:4為引物進行擴增，可以得到特異性條帶，E元件缺失片段大小為875bp，而未缺失的片段大小為1022bp(如圖3所示)，同時測序結果表明拯救病毒可穩定傳代。上述試驗結果說明轉染後的細胞培養上清中包含有本發明的血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株，該毒株中E元件缺失。實施例3感染型病毒的驗證利用IDEXXALV-AgELISA試劑盒對轉染及感然的宿主細胞培養上清進行檢測，轉染及感染後細胞培養上清ELISA檢測結果(表1所示)均為陽性。表IELISA檢測結果tableseeoriginaldocumentpage6將感染的細胞用甲醇固定後，經PBS洗滌，滴加特異性ALV-J單抗JE9，37°C孵育30min，用PBS洗滌，然後加入羊抗小鼠IgG螢光標記抗體，37°C孵育30min，並經PBS洗滌，最後在螢光顯微鏡下觀察，感染細胞可觀察到明顯的綠色螢光，且為典型的細胞質染色，陰性對照無反應，如圖4所示，圖4中，A為感染的雞胚成纖維細胞，B為空白雞胚成纖維細胞。上述結果證明成功獲得感染性缺失病毒毒株。權利要求一種血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株，該病毒株為J亞群禽白血病感染性克隆化病毒rSCAU-HN06，已於2009年11月3日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNOV200914。2.權利要求1所述血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株的構建方法，其特徵在於該病毒株是採用核苷酸序列如SEQIDN0:14所示特異性引物，通過重疊PCR技術對J亞群禽白血病感染性病毒rSCAU-HN06進行E元件缺失，構建而得。3.根據權利要求2所述構建方法，其特徵在於該方法包括如下步驟(1)特異性引物特異性引物的核苷酸序列如SEQIDNO:14所示；(2)採用重疊PCR技術將血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因Call-NotI之間的E序列缺失，並構建為質粒，所述血管瘤病變型J亞群禽白血病病毒SCAU-HN06株的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO5所示；(3)將步驟(2)中所得質粒用Call，NotI雙酶切消化，所得片段與pSK-ALV-HN經Call-NotI雙酶切消化的載體片段連接，得到pSK-ALV-HN-AE質粒；(3)將pSK-ALV-HN-AE質粒轉染病毒宿主細胞，經過培養後，收穫細胞培養上清，用該上清感染雞胚成纖維細胞後進行盲傳，從而得到所需血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株。4.根據權利要求3所述構建方法，其特徵在於步驟(3)中所述病毒宿主細胞為禽類細胞。全文摘要本發明公開一種血管瘤病變型J亞群禽白血病突變體病毒株及其構建方法，該病毒株為J亞群禽白血病感染性克隆化病毒rSCAU-HN06，已於2009年11月3日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCCNoV200914。本發明以單一起源的感染性克隆化病毒rSCAU-HN06為基礎，進行E元件缺失，避免了自然分離毒序列中的突變與缺失對研究結果造成的幹擾。本發明的構建方法簡便易行，而且利用該病毒上特異的單酶切位點CalI及載體上NotI位點進行序列替換，構建並拯救出感染性克隆病毒，轉化率高，能穩定複製。文檔編號C12N7/08GK101831408SQ20101014019公開日2010年9月15日申請日期2010年3月30日優先權日2010年3月30日發明者廖明,張賀楠,徐成剛,曹偉勝,羅開健,賴漢漳,辛朝安申請人:華南農業大學