處理凝血因子的方法

2023-04-23 01:55:36

處理凝血因子的方法
【專利摘要】本申請涉及用於純化重組凝血因子蛋白，包括例如凝血素（因子II）的方法。在實施例中，這些方法提供了純化的凝血素，該純化的凝血素展示出增加的生物活性和降低的凝血酶水平的純化的凝血素，由此增加了凝血素的安全性。還提供了純化的重組凝血因子蛋白。
【專利說明】處理凝血因子的方法
[0001]發明背景發明領域
[0002]本申請涉及用於純化重組凝血因子蛋白(包括例如凝血素(因子II))的方法。在實施例中，這些方法提供了純化的凝血素，該純化的凝血素展示出增加的生物活性和降低的凝血酶水平，由此增加凝血素的安全性。還提供了純化的重組凝血因子蛋白。
發明背景
[0003]用於治療應用(例如，用於血友病以及其他血液障礙的治療)的凝血因子可以從人血漿中獲得，儘管純化可能是複雜的。即使伴隨血液衍生蛋白產品的大量的安全性測量和測試，但是不能排除感染性病毒或朊病毒的汙染。因此，高度令人希望的是從沒有動物衍生組分的培養基中生長的重組細胞中產生人類治療性蛋白質。因為許多蛋白質需要一個哺乳動物宿主來以全功能形式產生，即需要被正確地翻譯後修飾，所以這常常不是簡單的。
[0004]因子II (凝血素)是血液凝固所必需的一種凝血因子。在外部的(或組織因子)血液凝固通路中，組織因子觸發凝固級聯，其中在因子Xa、因子Va、磷脂、以及Ca2+離子的存在下，凝血素變為活化型因子IIa (凝血酶)。凝血酶通過多個通路發揮作用以通過將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白凝塊以及參與其他前凝固通路來阻止流血。
[0005]在重組凝血素蛋白的生產和純化過程中，凝血酶可以作為一種產物相關的雜質存在。游離凝血酶的水平大體上必須被保持在低水平以增加產品安全性。另外，重組凝血素在N端結構域中包含10個Y-羧基穀氨酸「Gla-殘基」。這些殘基被認為螯合Ca2+離子，這介導蛋白質與磷脂膜的結合，這是凝血素激活為凝血酶的先決條件。
[0006]本申請的諸位發明人已經認定了對於提供具有高水平的Y-羧化穀氨酸殘基和低凝血酶汙染的重組純化凝血素的純化方法的需要。
`[0007]優選實施方案概述
[0008]本申請提供了凝固蛋白的純化方法，以滿足以上認定的需要。
[0009]在實施例中，提供了用於純化重組凝血因子蛋白的方法。這些方法適合地包括提供一種混合物，該混合物包括該重組凝血因子蛋白。通過至少一個第一柱將該混合物進行過濾，以產生第一柱產物。通過聚(乙烯亞胺)(PEI)柱將該第一柱產物進行過濾，以產生PEI柱產物，並且回收純化的重組凝血因子。適合地，該純化的重組凝血因子蛋白包括小於約0.5/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點。在實施例中，該重組凝血因子蛋白是凝血素(因子 II)。
[0010]適合地，該混合物是一種來自生物反應器的過濾混合物。在示例性實施例中，該混合物的過濾包括通過一個第一陰離子交換柱的過濾，適合地是一種結合和洗脫過濾。在實施例中，可以通過一個第二陰離子交換柱將該第一柱產物進行過濾，適合地是一種流經過濾。
[0011]在實施例中，在通過聚(乙烯亞胺)柱進行過濾之前，用溶劑/洗滌劑滅活將該第一柱滅活。在實施例中，通過聚(乙烯亞胺)柱的過濾是一種結合和洗脫過濾。適合地，通過疏水作用柱(HIC)將該PEI柱產物進行過濾，例如以一種結合和洗脫過濾方式。在實施例中，在回收之前，這些方法可以包括納米過濾。
[0012]在適合的實施例中，該重組凝血素蛋白基本上不含凝血酶，並且包括小於約0.8/10,0.7/10,0.6/10,0.5/10或0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點。
[0013]在另外的實施例中，提供了用於純化重組凝血因子蛋白(例如，凝血素(因子II))的方法。這些方法適合地包括:提供一種包括該重組凝血因子蛋白的混合物，並且通過至少一個第一陰離子交換柱將該混合物進行過濾(例如，一種結合和洗脫過濾)，以產生第一陰離子交換柱產物。用溶劑/洗滌劑病毒滅活將該第一陰離子交換柱產物滅活，以產生滅活的混合物。適合地，通過聚(乙烯亞胺)(PEI)柱將該滅活的混合物進行過濾(例如，結合和洗脫過濾)，以產生PEI柱產物，並且通過疏水作用柱(HIC)將該PEI柱產物進行過濾，以產生HIC產物。在實施例中，然後將該HIC產物進行過濾(例如，納米過濾)並且回收純化的重組凝血因子蛋白。在實施例中，該純化的重組凝血因子蛋白包括小於約0.8/10,0.7/10、0.6/10、0.5/10或0.4/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點。在某些實施例中，在通過PEI柱進行過濾之前，通過一個第二陰離子交換柱將該第一陰離子交換柱產物進行過濾(例如，流經過濾)，以產生第二陰離子交換柱產物。然後，通過PEI柱將該第二陰離子交換柱產物進行過濾，以產生PEI柱產物。
[0014]適合地，該重組凝血素蛋白基本上不含凝血酶，並且適合地包括小於約0.8/10、0.7/10、0.6/10、0.5/10或0.4/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點。
[0015]在另外的實施例中，提供了用於純化重組凝血素(因子II)蛋白的方法。這些方法適合地包括:提供一種來自生物反應器、包括該重組凝血素蛋白的過濾混合物；通過一個第一陰離子交換柱將該混合物進行結合和洗脫過濾，以產生第一陰離子交換柱產物；通過一個第二陰離子交換柱將該第一陰離子交換柱產物進行流經過濾，以產生第二陰離子交換柱產物；用溶劑/洗滌劑病毒滅活將該第二陰離子交換柱產物滅活，以產生滅活的混合物；通過聚(乙烯亞胺)(PEI)柱該滅活的混合物進行結合和洗脫過濾，以產生PEI柱產物；通過疏水作用柱(HIC)將該PEI柱產物進行結合和洗脫過濾，以產生HIC產物；將該HIC產物進行納米過濾並且回收該純化的重組凝血素蛋白。
[0016]適合地，該純化的重組凝血素蛋白(因子II)包括小於約0.8/10,0.7/10,0.6/10、0.5/10或0.4/10的Y -羧化穀氨酸位點並且基本上不含凝血酶。
[0017]在另外的實施例中，提供了純化的重組凝血素蛋白(因子II)。適合地，這些蛋白質包括小於約0.8/10,0.7/10,0.6/10,0.5/10或0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點並且
基本上不含凝血酶。
[0018]在實施例中，該純化的重組凝血素在凝血測定中展示出大於約70%的生物活性和/或在自動校準凝血酶曲線(CAT)測定中展示出大於約70%的生物活性。適合地，該蛋白質包括小於約2ng/ml凝血酶。
[0019]參照附圖，下文詳細地描述了這些實施例的另外的實施例、特徵、和優點，連同不同實施例的結構和操作。
[0020]附圖簡要說明
[0021]圖1示出了在此披露的示例性純化方法的流程圖。[0022]圖2示出了凝血素的結構域構造，在N端Gla-結構域中示出了 10個Y -羧化穀氨酸(Gla)殘基。
[0023]圖3示出了在重組凝血素的凝血和CAT生物測定中，相對於相對效力(體外生物活性)的翻譯後羧化程度。
[0024]圖4示出了根據用聚(PEI)柱進行的過濾的CAT生物測定結果。
[0025]圖5A和圖5B示出了在重組因子II的片段Kl (5A)和K2 (5B)處的穀氨酸(Gla)的Y-羧化。
[0026]圖6示出了重組因子II的片段K13 (N373)的糖譜。
[0027]優選實施方案的詳細說明
[0028]應該領會的是在此展示和描述的這些具體的實現方式是實例，並且不旨在以任何方式在其他方面限制本申請的範圍。
[0029]在此提及的這些公開的專利、專利申請、網站、公司名稱、以及科學文獻特此以其全文形式通過引用而結合，達到如同每個被確切並單獨地表明而通過引用結合的相同程度。在此引用的任何參考文件與本說明書的具體傳授之間的任何衝突應以有利於後者的方式來解決。同樣，在單詞或短語的領域理解的定義與如在本說明書中確切傳授的該單詞或短語的定義之間的任何衝突應以有利於後者的方式來解決。
[0030]如在本說明書中所使用，單數形式「一個/種(a，an)」以及「該」具體地還涵蓋它們所提及的術語的複數形式，除非本內容清楚地另外指明。在此使用術語「約」以意指大約(approximately)、在…的附近(in the region of)、粗略地(roughly)、或左右(around)。當術語「約」與一個數值範圍結合使用時，它通過擴展列舉的數值的上限和下限將該範圍加以修飾。通常，在此使用術語「約」以將一個數值以高於和低於該規定值的20%的變化加以修飾。``
[0031]在此使用的技術術語和科學術語具有由本申請涉及的領域的普通技術人員通常理解的含義，除非另外定義。在此參考了本領域的普通技術人員已知的不同方法和材料。闡明重組DNA技術的一般原則的標準參考文獻包括薩姆布魯克(Sambrook)等人，「分子克隆:實驗室手冊(Molecular Cloning:A Laboratory Manual), 」第二版,冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),紐約(1989);考夫曼(Kaufman)等人，編著，「醫學生物學中的分子和細胞方法手冊(Handbook of Molecular and CellularMethods in Biology in Medicine), 」 CRC 出版社，博卡拉頓(Boca Raton) (1995);以及麥克弗森(McPherson),編著,「定向誘變:實用方法(Directed Mutagenesis: A PracticalApproach), 」 IRL出版社，牛津(1991 )，將其中每個的披露通過引用以其全文結合在此。
[0032]在實施例中，提供了用於純化重組凝血因子蛋白的方法。在適合的實施例中，這些方法包括提供一種混合物，該混合物包括該重組凝血因子蛋白。通過至少一個第一柱將該混合物進行過濾，以產生第一柱產物。然後，通過聚(乙烯亞胺)(PEI)柱將該第一柱產物進行過濾，以產生PEI柱產物。然後，從該PEI柱產物中回收純化的重組凝血因子蛋白。
[0033]在示例性實施例中，該純化的重組凝血因子蛋白是人類凝血素(因子II)。術語「凝血素」、「因子11」、「重組凝血素」和「重組因子II」貫穿全文可互換地使用。可以使用在此描述的這些方法純化其他重組凝血因子蛋白並且包括例如因子VI和因子IX。
[0034]如在此使用的，「一種或多種重組凝血因子蛋白」是指使用任何適合的表達系統(包括原核表達系統和真核表達系統兩者)、或使用噬菌體展示方法產生的凝血因子肽、多肽或蛋白質(參見，例如道爾(Dower)等人，W091/17271和麥卡弗蒂(McCafferty)等人，W092/01047 ;以及美國專利號5，969，108，將其通過引用以其全文結合在此)。應該理解的是術語「一種或多種蛋白(protein和proteins)」貫穿全文可互換地利用。
[0035]如在此使用，術語「肽」或「多肽」是指優選地由按照α -胺基酸、D-胺基酸、L-胺基酸及其組合的定義順序連接形成的聚合體。一個胺基酸殘基與下一個胺基酸殘基之間的鍵稱為醯胺鍵或肽鍵。蛋白質是具有多個多肽亞單元的多肽分子。區別是肽通常是短的而多肽/蛋白質通常比胺基酸鏈長。術語「蛋白質」旨在還涵蓋衍生的分子，例如糖蛋白和脂蛋白連同較低分子量的多肽。「胺基酸序列」以及類似術語(例如「多肽」或「蛋白質」)並不意在將表明的胺基酸序列限制在與引用的蛋白質分子相關的完整天然胺基酸序列。
[0036]使用不同的宿主細胞(例如細菌、植物、酵母菌、昆蟲以及哺乳動物細胞)生產重組凝血因子蛋白的方法是熟知的。例如，利用大腸桿菌(E.coli)、其他細菌宿主、酵母菌、以及不同的較高級的真核細胞(例如像C0S、CH0、HeLa以及骨髓瘤細胞系)的許多表達系統對於蛋白質的表達而言是可獲得的。
[0037]簡言之，通常通過將DNA或cDNA可操作地連接至一個啟動子(組成型或誘導型)，隨後併入表達盒中來實現編碼一種或多種所希望的凝血因子蛋白的天然的或合成的核酸的表達。這些盒可以適合用於在原核或真核細胞系中的複製和整合。典型的表達盒包含用於調節編碼該蛋白質的DNA的表達的轉錄終止子和翻譯終止子、起始序列、以及啟動子。為了獲得高水平表達的克隆基因，令人希望的是構建最低包含一個用於指導轉錄的強啟動子、一個用於翻譯起始的核糖體結合位點、以及一個轉錄/翻譯終止子的表達盒。對於大腸桿菌而言，這包括一個啟動子(例如T7、trp、lac、或λ啟動子)、一個核糖體結合位點以及一個轉錄終止信號。對於 真核細胞而言，控制序列可以包括一個啟動子和一個衍生自免疫球蛋白基因、SV40、巨細胞病毒的增強子、以及一個多腺苷酸化序列，並且可以包括剪接供體和受體序列。可以通過熟知的方法將這些盒轉移至選擇的宿主細胞中，例如對於大腸桿菌而言的氯化鈣轉化或電穿孔以及對哺乳動物細胞而言的磷酸鈣處理、或電穿孔或脂質轉染法。可以通過對由包含在這些盒中的基因(例如amp、gpt、neo以及hyg基因)賦予的抗生素抗性來對由這些盒轉化的細胞進行選擇。
[0038]在實施例中，該重組凝血因子蛋白是如例如在美國專利號7，842，477和7，989，193中生產的人類凝血素(因子II)，將其中每個的披露通過引用以其全文形式結合在此。美國專利號7，842，477和7，989，193披露了用於產生重組凝血素的核酸序列、質粒以及宿主細胞。
[0039]一種示例性純化方法示於圖1中並且在此更加詳細地描述。
[0040]如貫穿全文所使用，使用術語「純化(purify)'I1Mt(Purification)M或純化的「(purified)」來指代一種工藝,通過該工藝從其他蛋白質或不希望的產物或結構中除去一種或多種所希望的重組蛋白(或從所希望的蛋白質中除去不希望的產物或結構)，這樣使得一種或多種所希望的蛋白質至少約75%不含其他蛋白質、產物或結構，至少約80%不含其他蛋白質、產物或結構，至少約90%不含其他蛋白質、產物或結構，更適合地是至少約95%不含其他蛋白質、產物或結構，並且最適合地是至少約98%不含其他蛋白質、產物或結構。
[0041]貫穿全文描述的這些純化方法適合地從一種或多種最終的、所希望的重組蛋白中除去例如不想要的宿主細胞蛋白(HCP)結構以及其他結構(例如，DNA,RNA),連同不想要的、不希望的或非最優形式的重組凝血因子蛋白。
[0042]如在此使用，使用術語「過濾」來意指將一種包括一種或多種重組蛋白的混合物與過濾介質接觸放置，這樣使得通過過濾介質除去該溶液或混合物中的不希望的或不想要的組分。包括該重組蛋白的一種「混合物」通常還可以包括緩衝液或其他液體培養基中的不同HCP、核酸、其他蛋白質(包括該蛋白質的重組形式)等。
[0043]在實施例中，重組凝血因子蛋白的這些混合物是來自生物反應器的過濾混合物的產物，或可以是生物反應器或用來產生該重組凝血因子蛋白的其他方法的直接產物。
[0044]用於在此處披露的這些方法中使用的示例性過濾介質包括不同的濾紙、編織纖維、基於聚合體的柱過濾介質、瓊脂糖、右旋糖酐以及天然的過濾介質、連同本領域已知的其他介質。適合地，該過濾介質是基於聚合體的過濾介質，連同基於瓊脂糖或右旋糖酐的介質，包括例如SEPHAROSE?、SEPHADEX?以及聚(乙烯亞胺)過濾介質。
[0045]在示例性實施例中，通過一個第一陰離子交換柱(即，已經使用瓊脂糖過濾介質製備的色譜柱或過濾柱)將包括重組凝血因子的混合物進行過濾。適合的陰離子交換柱的實例包括Q SEPHAR0SETM柱，例如QSEPHAR0SE?快流柱(Q SEPHAROSE?Fast Flow column)，它包括具有在約45-165 μ m範圍內的珠粒大小的高度交聯4%瓊脂糖球形珠粒(GE醫療保健公司(GE Healthcare)，皮斯卡塔韋，新澤西州)。製備此類柱的方法，包括利用的介質的量、用於支持並製備這些柱的裝置，連同利用這些柱過濾混合物的方法是本領域普通技術人員熟知的。此類方法適合地包括向柱中加入預定體積的混合物，加入用於平衡或洗滌該柱的緩衝液或其他介質，並且以預定流速使緩衝液或洗滌介質流過該柱。
[0046]在實施例中，通過一個第一陰離子交換柱、隨後是一個第二陰離子交換柱將該混合物進行過濾。適合地，利用的第一和第二陰離子交換柱是QSEPHAR0SE?快流柱。在實施例中，還可以利用額外的陰離子交換柱。例如，可以通過兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個、十個等陰離子交換`柱將該混合物進行過濾。也可以使用額外類型的柱或過濾介質以將包括重組凝血因子蛋白的混合物進行初始過濾。
[0047]取決於用於過濾的柱的類型，產生的過濾產物在此被稱為「產物」、「柱產物」、「陰離子交換柱產物」或「PEI柱產物」。通過一個或多個陰離子交換柱的過濾可以是流經過濾或結合和洗脫過濾。如在此使用，「流經」過濾是指以下過濾，其中向柱中加入一種混合物，適合地隨後加入緩衝液或洗滌溶液,並且然後使該混合物通過該柱。產生的過濾產物(「一種柱產物」)是作為未結合產物而通過該柱的材料。任何不想要的或不希望的組分(例如，DNA、蛋白質、細胞產物等)留在該柱上。
[0048]如在此使用，「結合併洗脫」過濾(filtration或iltering)、或「結合併洗脫」是指以下柱過濾，其中向柱中加入該混合物，並且適合地隨後是洗滌或平衡緩衝液。所希望的材料最初被留在該柱上(即，與該柱介質結合或被它保留)，同時不想要的或不希望的組分通過該柱。然後，通過用適合的緩衝液洗脫將所希望的產物從該柱上洗脫(即，起初與該柱結合的產物)。在此類實施例中，柱產物是在除去通過該柱並且不被保留的該混合物中的不想要的或不希望的組分之後回收的材料。
[0049]在示例性實施例中，通過該第一陰離子交換柱(例如，SEPHAROSE?柱)將該混合物進行過濾包括結合和洗脫過濾，以產生陰離子交換柱產物。適合地，如果使用一個第二陰離子交換柱將該混合物進行過濾，那麼通過該第二陰離子交換柱(例如，SEPHAROSE?)的過濾包括流經過濾。如果希望的話，通過陰離子交換柱的任何額外的過濾可以包括結合和洗脫過濾或流經過濾。
[0050]在實施例中，這些方法進一步包括用溶劑/洗滌劑滅活使該第一柱產物(即，第一陰離子交換柱的產物或在利用兩個陰離子交換柱的情況下的第二陰離子交換柱的產物)滅活，以產生滅活的混合物。適合地，這種滅活發生在例如用聚(乙烯亞胺)柱的任何進一步過濾之前。適合地，滅活包括使用洗滌劑以中斷病毒脂質包衣中的分子之間的相互作用。適合地，使用創造以下環境的一種溶劑，該環境中脂質包衣與該洗滌劑之間的聚集反應迅速發生。示例性的洗滌劑和溶劑在本領域中是已知的，並且包括例如洗滌劑Triton-XlOO。
[0051]適合地，通過至少一個聚(乙烯亞胺)(PEI)柱將該無活性的混合物進行過濾，以產生PEI柱產物。在適合的實施例中，通過聚(乙烯亞胺)柱將滅活的混合物進行過濾包括結合和洗脫過濾。
[0052]用於在此處描述的這些方法中使用的聚(乙烯亞胺)柱的實例包括BAKERB0ND?XWP500Poly PE1-35 (聚(乙烯亞胺))柱(PolyPEI)。此類示例性柱包括結合在疏水聚合體(AVANT0R?，菲利普斯堡，新澤西州)上的聚(乙烯亞胺)(PEI )。
[0053]在實施例中，這些方法進一步包括通過一個或多個陰離子交換柱(適合地是苯基SEPHAROSE? 高效柱(Phenyl SEPHAR0SE?High Performance column))將 PEI 柱產物進行過濾。在實施例中，通過疏水作用柱將該PEI柱產物進行過濾包括結合和洗脫過濾。在PEI過濾之後，還可以使用其他柱過濾來在回收之前進一步純化該重組凝血因子蛋白。
[0054]在適合的實施例中，在回收該純化的重組凝固蛋白之前，將該混合物進行納米過濾。在實施例中，納米過濾可以發生在通過PEI柱的過濾之後(即，將PEI柱產物進行納米過濾)，並且在其他實施例中，納米過濾可以發生在通過疏水作用柱(HIC)或其他適合的柱將PEI柱產物進行過濾之後(即，將HIC產物進行納米過濾)。用於納米過濾的示例性方法和用於納米過濾的過濾介質在本領域中是熟知的，並且適合地利用具有近似約Inm的孔徑大小的膜。納濾膜適合地具有小於1`000原子質量單位(道爾頓)的分子量截留(MWC0)。
[0055]在此描述的這些方法適合地產生基本上不含凝血酶的重組凝固蛋白，適合地是凝血素(因子II)。如在此描述，從重組凝血素中除去凝血酶(或將存在的凝血酶的量降至適合的水平)增加最終蛋白產品的安全性。如在此使用，基於蛋白產物的總質量，使用基本上不含凝血酶來指示最終產品包括小於約20%凝血酶，適合地是小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約1%、小於約0.5%、小於約0.1%、小於約0.05%、小於約0.01%、小於約0.005%或小於約0.001%凝血酶。適合地，最終產品中的凝血酶的量小於約10ng/ml凝血酶，更適合地是小於約9ng/ml凝血酶、小於約8ng/ml凝血酶、小於約7ng/ml凝血酶、小於約6ng/ml凝血酶、小於約5ng/ml凝血酶、小於約4ng/ml凝血酶、小於約3ng/ml凝血酶、小於約2ng/ml凝血酶、或小於約lng/ml凝血酶。
[0056]獲得大量的全功能重組人類凝血因子的主要障礙之一在於存在於因子I1、因子VI1、因子IX、因子X和蛋白C中的Gla-結構域。這一結構域包含通過加入羧基來翻譯後修飾的穀氨酸殘基。這些因子的產生被以下事實阻礙，它們的過度表達產生低羧化的，並且因此無活性的蛋白質。Gla修飾是一種稱為Y-谷醯基羧化酶(GGCX)的維生素K依賴性酶的作用的結果(參見例如，W088/03926 ;武(胃11)等人《科學》(Science)254(5038):1634-1636, 1991)。
[0057]如圖2所示，重組凝血素在N端結構域包含10個「Gla-殘基」。這些是影響該蛋白質的生物活性的Y-羧化穀氨酸(Gla)殘基。這些殘基被認為螯合Ca2+離子，這介導蛋白質與磷脂膜的結合，這是凝血素激活為凝血酶的先決條件。
[0058]對於人類因子II (凝血素)而言，至少十分之八的Glu殘基必須被正確修飾，以獲得全功能凝血素(馬爾霍特拉(Malhotra)等人，《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.)260:279-287，1985 ;希格斯(Seegers)和瓦爾茨(Walz)
[0059]『凝血素和其他維生素K蛋白』('Prothrombin and other vitamin K proteins' ),CRC出版社，1986)。為了獲得高產量水平的rhFII，已經使用若干不同系統(例如CHO細胞、BHK細胞、293細胞以及牛痘病毒表達系統)進行了大量努力(喬根森(Jorgensen)等人，《生物化學雜誌》(J.Biol.Chem.) 262:6729-6734, 1987 ;拉索(Russo)等人，《生物技術和應用生物化學》(Biotechnol Appl Biochem)14 (2): 222-233，1991 ;費舍爾(Fischer)等人，《生物技術雜誌》(J Biotechnol) 38 (2): 129-136，1995 ;赫裡斯卡(Herlitschka )等人《蛋白表達與純化》(Protein Expr.Purif.) 8 (3): 358-364，1996 ;拉索(Russo)等人，《蛋白表達與純化》(Protein Expr.Purif.)10:214-225, 1997)。用於產生重組因子II的示例性方法例如披露於美國專利號7，842，477和7，989，193中，將其披露通過引用以其全文結合在此。
[0060]根據在此描述的這些方法純化的重組凝血因子蛋白(適合地是凝血素(因子II))適合地包括小於約十分之一(1/10)的丟失Y-羧化的穀氨酸(Gla)位點。也就是說，當考慮總蛋白樣品的平均值時，在該蛋白質中的10個穀氨酸位點中，適合地小於1/10的Gla位點是非Y-羧化的，即平均小於1/10的Y-羧化穀氨酸(Gla)位點丟失。在實施例中，在此描述的這些方法適合地提供了包括在樣品的平均值上，小於約0.9/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點，更適合地是小於約0.8/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.7/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.6/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.5/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.3/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小`於約0.2/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.2/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點、或沒有丟失Y-羧化穀氨酸位點的凝血素。
[0061]如在此描述，諸位發明人已經發現披露的方法產生基本上不含凝血酶以及還具有小於約0.5/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點的純化重組凝血因子蛋白，包括例如凝血素(因子II)。這些純化的重組凝固蛋白的生物活性測試證明丟失Y-羧化穀氨酸位點的數目的減少與生物活性的增加相關，如在凝血和CAT測定中所測量的(參見凝血和CAT生物活性測定的實例中的描述)。參見圖3。如在實例中所描述，當與通過測定表明可測量的100%生物活性的參照標準相比時，這一相關性提供了這些純化的蛋白質的大於約70%，適合地是大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%、大於約95%、或約100%生物活性的生物活性。
[0062]雖然不希望被關於活性增加的原因的任何理論所束縛，相信通過經由聚(PEI)柱的過濾的重組凝固蛋白的純化提供包括減少數目的丟失Y-羧化穀氨酸位點的重組凝血因子蛋白(即，小於0.5的丟失Y -羧化的穀氨酸位點)。
[0063]在另外的實施例中，提供了用於純化重組凝血因子的額外的方法。適合地，這些方法包括提供一種混合物，該混合物包括該重組凝血因子蛋白。通過至少一個第一陰離子交換柱將該混合物進行過濾，以產生第一陰離子交換柱產物。用溶劑/洗滌劑病毒滅活將該第一陰離子交換柱產物滅活，以產生滅活的混合物。通過聚(乙烯亞胺)(PEI)柱將該滅活的混合物進行過濾，以產生PEI柱產物。通過疏水作用柱(HIC)將該PEI柱產物進行過濾，以產生HIC產物。將HIC產物進一步過濾。然後回收純化的重組凝血因子蛋白。
[0064]適合地，儘管這些方法可以容易地延伸至其他重組凝血因子蛋白，但該重組凝血因子蛋白是凝血素(因子II)。
[0065]在示例性實施例中，包括重組凝血因子蛋白的起始混合物是一種來自生物反應器的過濾混合物。
[0066]在實施例中，通過至少一個第一陰離子交換柱進行過濾包括結合和洗脫過濾，並且可以進一步包括通過一個第二陰離子交換柱將該第一陰離子交換柱產物進行過濾。還可以利用額外的陰離子交換柱。適合地，通過一個第二陰離子交換柱進行過濾包括流經過濾。
[0067]在示例性實施例中，通過PEI過濾器將該陰離子交換柱產物進行過濾包括結合和洗脫過濾。PEI柱產物的進一步過濾還適合地包括疏水作用柱(HIC)。在實施例中，HIC產物的過濾包括納米過濾。
[0068]在回收重組因子II之後，在此描述的這些方法還可以包括額外的過濾，包括例如最終產物的超濾或滲濾。
[0069]如貫穿全文所描述，這些純化方法適合地產生基本上不含凝血酶的重組凝血素蛋白。另外，重組凝血因子蛋白適合地包括小於約1/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點，更適合地是小於約0.9/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點、小於約0.8/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點、小於約0.7/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點、小於約0.6/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點、小於約0.5/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.3/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點、小於約0.2/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點、小於約0.2`/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點、或沒有丟失Y-羧化穀氨酸位點。
[0070]在另外的實施例中，提供了用於純化重組凝血素(因子II)蛋白的額外的方法。圖1示出了一種示例性方法的流程圖100。適合地，提供了一種來自生物反應器、包括該重組凝血素蛋白的過濾混合物102。在實施例中，這一混合物可以是生物反應器收穫的深層過濾的產物。
[0071]通過一個第一陰離子交換柱(適合地是Q SEPHAROSE?快流柱)將該混合物進行過濾104，使用結合和洗脫過濾，以產生第一陰離子交換柱產物。通過一個第二陰離子交換柱(適合地是Q SEPHAROSE?快流柱)將該第一陰離子交換柱產物進行過濾106，適合地使用流經過濾，以產生第二陰離子交換柱產物。在108中，用溶劑/洗滌劑病毒滅活將第二陰離子交換柱產物滅活，以產生滅活的混合物。
[0072]然後，通過聚(乙烯亞胺)(PEI)柱將該滅活的混合物進行過濾110，適合地使用結合和洗脫過濾，以產生PEI柱產物。然後，通過疏水作用柱(例如苯基SEPHAROSE?高效柱)將該PEI柱產物進行過濾112，適合地使用結合和洗脫過濾，以產生HIC產物。然後，將該HIC產物進行納米過濾114，並且回收該純化的重組凝血素蛋白116。
[0073]如在此所描述，適合地，該純化的重組凝血素蛋白基本上不含凝血酶並且包括小於約0.5/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點，更適合地是小於約0.4/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點。[0074]在實施例中，在此描述的這些方法由引用步驟組成，這樣使得不允許超出引用的那些的額外插入步驟。在另外的實施例中，在此描述的這些方法基本上由引用步驟組成。在此類實施例中，加入改變重組蛋白的物理性質或化學性質的步驟被認為是此類方法的實質性變更並且因此從基本上由引用步驟組成的這些方法中排除。
[0075]應該理解的是在此描述的這些方法中的過濾順序和數目可以被修改，同時仍然取得具有所希望的生物活性、低水平的凝血酶、以及減少水平的丟失Y-羧化穀氨酸位點的所希望的純化重組凝血因子蛋白。
[0076]在另外的實施例中，提供了一種純化的重組凝血素蛋白(因子II)。適合地，該純化的重組因子II蛋白包括小於約1/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點並且基本不含凝血酶。
[0077]適合地，該純化的重組因子II蛋白包括小於約0.9/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點，更適合地是小於約0.8/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點、小於約0.7/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.6/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.5/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.3/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.2/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點、小於約0.1/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點、或沒有丟失Y-羧化穀氨酸位點。
[0078]如在此描述，基於蛋白產物的總質量，重組因子II蛋白適合地包括小於約20%的凝血酶，適合地是小於約15%、小於約10%、小於約5%、小於約1%、小於約0.5%、小於約0.1%、小於約0.05%、小於約0.01%、小於約0.005%或小於約0.001%的凝血酶。適合地，該純化的重組因子II蛋白包括小於約10ng/ml凝血酶,更適合地是小於約9ng/ml凝血酶、小於約8ng/ml凝血酶、小於約7ng/ml凝血酶、小於約6ng/ml凝血酶、小於約5ng/ml凝血酶、小於約4ng/ml凝血酶、小於約3ng/ml凝血酶、小於約2ng/ml凝血酶、或小於約lng/ml凝血酶。
[0079]在實施例中，與參照標準相比，該純化的重組凝血素蛋白在凝血測定(clot測定)中展示出大於約50%的生物活性。適合地，該純化的重組凝血素蛋白展示出凝血測定中的大於約60%的生物活性，更適合地是凝血測定中的大於約70%的生物活性、凝血測定中的大於約75%的生物活性、凝血測定中的大於約80%的生物活性、凝血測定中的大於約85%的生物活性、凝血測定中的大於約90%的生物活性、或凝血測定中的大於約95%的生物活性。
[0080]在示例性實施例中，與參照標準相比，該純化的重組凝血素蛋白在自動校準凝血酶曲線(CAT)測定中展示出大於約50%的生物活性。適合地，該純化的重組凝血素蛋白展示出CAT測定中的大於約60%的生物活性，更適合地是CAT測定中的大於約70%的生物活性、CAT測定中的大於約75%的生物活性、CAT測定中的大於約80%的生物活性、CAT測定中的大於約85%的生物活性、CAT測定中的大於約90%的生物活性、或CAT測定中的大於約95%的生物活性。
[0081]在另外的實施例中，該純化的因子II蛋白在凝血測定(clot測定)中展示出大於約50%的生物活性並且在自動校準凝血酶曲線(CAT)測定中展示出大於約50%的生物活性。
[0082]還提供了通過在此描述的任何工藝製備的純化的重組凝血素蛋白(因子II)。適合地，這些因子II蛋白包括小於約0.5/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點，並且基本不含凝血酶。
[0083]相關領域的普通技術人員容易清楚的將是在不背離任何這些實施例的範圍的情況下，可以對在此描述的這些方法和應用做出其他適合的修改和適配。以下這些實例僅僅出於說明的目的被特此包括並不旨在是限制性的。
[0084]實例
[0085]實例1:與柱色譜法相關的材料和方法
[0086]以下是與貫穿全文描述的柱色譜法相關的示例性材料和方法。
[0087]Q SEPHAROSE?快流結合和洗脫色譜法(Q B&E)
[0088]在加載之前，用25mM檸檬酸鹽、30mM氯化鈉(pH6.0)平衡Q SEPHAROSE?快流柱(GE醫療保健公司，皮斯卡塔韋，新澤西州)(QFF B&E)。將條件培養基的pH調節至pH6.0並且以200cm/h的線性速度在4-11克的產物/L的樹脂之間進行加載。然後，使該柱重新平衡並且用25mM檸檬酸鹽、173mM氯化鈉(pH6.0)進行洗滌。洗滌之後，將該柱用25mM檸檬酸鹽、308mM氯化鈉(pH6.0)進行一步洗脫。
[0089]Q SEPHAROSE? 快流流經色譜法(Q FT)
[0090]以流經模式操作Q SEPHAROSE?快流柱。將該柱在25mM檸檬酸鹽、400mM氯化鈉(pH6.0)中進行平衡並且然後以200cm/h的線性速度加載產物。加載量典型地是在2_6克蛋白質/L樹脂之間。加載之後，將該柱用平衡緩衝液進行洗滌，以收集未結合的產物。
[0091]BAKERB0ND?XWP500PolyPE1-35 結合和洗脫色譜法(PolyPEI)
[0092]將BAKERB0ND?XWP500Poly PE1-35 (聚(乙烯亞胺))柱(包括結合在疏水聚合體上的聚(乙烯亞胺)(PE I)的柱(PolyPEI)) (AVANT0R?，菲利普斯堡，新澤西州)用125mMHEPES、4% (w/w)檸檬酸鹽、0.5M氯化鈉(pH6.5)進行預平衡，並且然後用25mM HEPES、4%(w/w)檸檬酸鹽、0.5M氯化鈉(pH6.5)進行平衡。然後，以140cm/h用5_12克蛋白質/L樹脂加載該柱。將該柱用平衡緩衝液進行洗滌並且然後用25mM HEPES、4% (w/w)檸檬酸鹽、
1.04M氯化鈉(pH6.5)進行洗滌。然後，以從IM至1.6-2.1M氯化鈉的線性梯度洗脫產物。
[0093]苯基SEPHAROSE?高效結合和洗脫色譜法(苯基HP )
[0094]將該柱用25mM HEPES、4% (w/w)檸檬酸鹽、IM氯化鈉(pH6.5)進行平衡。將來自PEI柱的洗脫物調節至IM硫酸鈉並且以lOOcm/h在1-12克蛋白質/L樹脂之間進行加載。使該柱重新平衡並且然後用25mM HEPES、0.4% (w/w)檸檬酸鹽、0.75M硫酸鈉(pH6.5)進行洗滌。然後，以從0.75M至OM硫酸鈉的梯度洗脫該柱。
[0095]羥基磷灰石結合和洗脫色譜法(CHT )
[0096]將該柱用處於pH6.5、包含低水平的磷酸鈉(10_50mM)和變化水平的氯化鈉(0.1-1M NaCl)的緩衝液進行平衡。以lOOcm/h從5_10克蛋白質/L樹脂加載該柱。加載之後，將該柱用低磷酸鹽緩衝液和變化濃度的氯化鈉進行平衡。然後，將產物用處於PH6.5、遞增的線性梯度的磷酸鹽濃度、直到200-400mM磷酸鈉進行洗脫。
[0097]實例2:凝血素的純化
[0098]將重組人類凝血素(因子II) CrhFII)蛋白在CHO細胞中進行表達並且用適合地包括四個色譜法步驟、一個溶劑/洗滌劑病毒滅活步驟、一個納米過濾步驟、以及用於最終配製的超濾/滲濾步驟的工藝進行純化。圖1中的原理圖給出了一個示例性純化工藝的概觀。已經將圖1所示的rhFII純化方法從小試規模按比例進行了放大以純化50L生物反應器和500L生物反應器。
[0099]表1概述了來自一個代表性50L純化的相關柱和收率數據。由於被分析的不同樣品的複雜性質，利用三個濃縮方法來評估柱性能。在280nm處測量的吸光度的總蛋白濃度給出了一個樣品中的總蛋白的量度。它是最簡單的方法，並且因為這些樣品是相對純的(即具有低水平的HCP的無色樣品)，所以在Q SEPHAROSE?快流流經柱(Q FT)之後將其用於樣品。第二個更加費時的方法是RP-HPLC方法，可以使用該方法來測量任何過程中間樣品中的rhFII的濃度。主要針對粗樣品(來自前兩個柱的加載物和池)來選擇這一濃縮方法，因為它給出了被加載在早期的柱上的rhFII的質量的量度。用於測量rhFII純化工藝的性能而利用的終濃度測定是測量活性rhFII的濃度的凝血酶原酶測定。
[0100]表1:來自50L純化的柱性能概述
【權利要求】
1.一種用於純化一種重組凝血因子蛋白的方法，該方法包括: a)提供一種混合物，該混合物包括該重組凝血因子蛋白； b)通過至少一個第一柱將該混合物進行過濾，以產生一種第一柱產物； c)通過一個聚(乙烯亞胺)(PEI)柱將該第一柱產物進行過濾，以產生一種PEI柱產物；並且 d)回收該純化的重組凝血因子蛋白， 其中該純化的重組凝血因子蛋白包括小於約0.8/10,0.7/10,0.6/10,0.5/10或0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點。
2.如權利要求1所述的方法，其中該重組凝血因子蛋白是凝血素(因子II)。
3.如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中該混合物是一種來自生物反應器的過濾混合物。
4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中在b)中的過濾包括通過一個第一陰離子交換柱的過濾。
5.如權利要求4所述的方法，其中通過該第一陰離子交換柱的該過濾包括一種結合和洗脫過濾。
6.如權利要求4或 權利要求5所述的方法，其中在b)中的該過濾進一步包括通過一個第二陰離子交換柱將該第一陰離子交換柱產物進行過濾，以產生一種第二陰離子交換柱產物。
7.如權利要求6所述的方法，其中通過該第二陰離子交換柱的該過濾包括一種流經過濾。
8.如權利要求1-7中任一項所述的方法，在c)中的該過濾之前，進一步包括用溶劑/洗滌劑滅活將該第一柱產物和/或該第二柱產物滅活。
9.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中在c)中通過一個聚(乙烯亞胺)柱將該第一柱產物進行過濾包括一種結合和洗脫過濾。
10.如權利要求1-9中任一項所述的方法，進一步包括通過一個疏水作用柱(HIC)將該PEI柱產物進行過濾。
11.如權利要求10所述的方法，其中該PEI柱產物的該過濾包括一種結合和洗脫過濾。
12.如權利要求1-11中任一項所述的方法，在d)中的該回收之前，進一步包括納米過濾。
13.如權利要求2所述的方法，其中該重組凝血素蛋白基本上不含凝血酶。
14.如權利要求1-13中任一項所述的方法，其中該純化的重組凝血因子蛋白包括小於約0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點。
15.一種用於純化一種重組凝血因子蛋白的方法，該方法包括: a)提供一種混合物，該混合物包括該重組凝血因子蛋白； b)通過至少一個第一陰離子交換柱將該混合物進行過濾，以產生一種第一陰離子交換柱產物； c)用溶劑/洗滌劑病毒滅活將該第一陰離子交換柱產物滅活，以產生一種滅活的混合物； d)通過一個聚(乙烯亞胺)(PEI)柱將該滅活的混合物進行過濾，以產生一種PEI柱產物； e)通過一個疏水作用柱(HIC)將該PEI柱產物進行過濾，以產生一種疏水作用柱(HIC)產物； f)將該HIC產物進行過濾；並且 g)回收該純化的重組凝血因子蛋白， 其中該純化的重組凝血因子蛋白包括小於約0.8/10,0.7/10,0.6/10,0.5/10或.0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點。
16.如權利要求15所述的方法，其中該重組凝血因子蛋白是凝血素(因子II)。
17.如權利要求15或權利要求16所述的方法，其中該混合物是一種來自生物反應器的過濾混合物。
18.如權利要求15-17中任一項所述的方法，其中在b)中通過至少一個第一陰離子交換柱進行過濾包括一種結合和洗脫過濾。
19.如權利要求15-18中任一項所述的方法，其中在b)中的該過濾進一步包括通過一個第二陰離子交換柱將該第一陰離子交換柱產物進行過濾。
20.如權利要求19所述的方法，其中通過一個第二陰離子交換柱的該過濾包括一種流經過濾。
21.如權利要求15-20中任一項所述的方法，其中在d)中的該過濾包括一種結合和洗脫過濾。
22.如權利要求15-21中任一項所述的方法，其中在e)中的該過濾包括一種結合和洗脫過濾。
23.如權利要求15-22中任一項所述的方法，其中在f)中的該過濾包括納米過濾。
24.如權利要求16所述的方法，其中該重組凝血素蛋白基本上不含凝血酶。
25.如權利要求15-24中任一項所述的方法，其中該純化的重組凝血因子蛋白包括小於約0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點。
26.一種用於純化一種重組凝血素(因子II)蛋白的方法，該方法包括: a)提供一種來自生物反應器的過濾混合物，該混合物包括該重組凝血素蛋白； b)通過一個第一陰離子交換柱將該混合物進行結合和洗脫過濾，以產生一種第一陰離子交換柱產物； c)通過一個第二陰離子交換柱將該第一陰離子交換柱產物進行流經過濾，以產生一種第二陰離子交換柱產物； d)用溶劑/洗滌劑病毒滅活將該第二陰離子交換柱產物滅活，以產生一種滅活的混合物； e)通過一個聚(乙烯亞胺)(PEI)柱將該滅活的混合物進行結合和洗脫過濾，以產生一種PEI柱產物； f)通過一個疏水作用柱(HIC)將該PEI柱產物進行結合和洗脫過濾，以產生一種HIC產物； g)將該HIC產物進行納米過濾；並且 h)回收該純化的重組凝血素蛋白， 其中該純化的重組凝血素蛋白(因子II)包括小於約0.8/10,0.7/10,0.6/10,0.5/10或0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點。
27.如權利要求26所述的方法，其中該重組凝血素蛋白基本上不含凝血酶。
28.如權利要求26或權利要求27所述的方法，其中該純化的重組凝血因子包括小於約0.7/10,0.6/10,0.5/10或0.4/10的丟失Y -羧化的穀氨酸位點。
29.一種純化的重組凝血素蛋白(因子II)，包括小於約0.5/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點並且基本不含凝血酶。
30.如權利要求29所述的純化的重組凝血素蛋白，包括小於約0.4/10的丟失Y-羧化的穀氨酸位點。
31.如權利要求29或權利要求30所述的純化的重組凝血素蛋白，其中該蛋白在凝血測定中展示出大於約70%的生物活性。
32.如權利要求29-31中任一項所述的純化的重組凝血素蛋白，其中該蛋白在自動校準凝血酶曲線(CAT)測定中展示出大於約70%的生物活性。
33.如權利要求29-32中任一項所述的純化的重組凝血素蛋白，其中該蛋白包括小於約2ng/ml凝血酶。
34.根據權利要求1-28中任一項所述的方法製備的一種純化的重組凝血素蛋白(因子II)，包括小於約0.5/10的丟 失Y-羧化的穀氨酸位點並且基本不含凝血酶。
【文檔編號】C12P21/02GK103814137SQ201280043201
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2012年8月31日 優先權日:2011年9月6日
【發明者】A·亨德, 王向陽, T·派斯特, M·溫得勒, J·王, K·凱裡, R·斯特羅斯, J·瓦格斯 申請人:米迪繆尼有限公司