用來在螢光顯微術中對培養基進行自動聚焦的方法和設備的製作方法

2023-04-22 20:00:56

專利名稱：用來在螢光顯微術中對培養基進行自動聚焦的方法和設備的製作方法
技術領域：
本發明涉及用來對生物材料進行自動檢驗的方法以及設備，其包括顯微鏡，生物材料在該顯微鏡的十字工作檯上設置在載片或者分析板(Analyseplatte)與至少一個蓋片之間；至少一個用於對生物材料進行照明的光源以及攝影單元，該攝影單元拍攝至少一張藉助顯微鏡的物鏡放大的生物材料的圖片並且傳遞給分析處理單元。所介紹的技術方案設置有一個標記，該標記能夠由用來對生物材料進行自動聚焦的裝置識別，其中，能夠通過以對所述標記的識別為基礎使十字工作檯有針對性地運動來實施聚焦。
背景技術：
螢光顯微術在醫學診斷領域中是用來檢驗患者試樣的標準方法。在這種情況下，在這個領域中對這種技術的進一步開發的努力還在於提高自動化程度，以便因此最小化誤差概率並且改善顯微術的經濟性。為了實現對實驗室中自動化程度的提高，一方面可考慮進一步自動化對需檢驗的試樣的處理、特別是稀釋步驟以及培養步驟，或另一方面更有效地設計對經過處理的試樣的特別是視覺分析處理的過程。在下文中還將進一步闡述的本發明涉及到試樣分析處理或者診斷領域，其中，在螢光顯微術方面也基本上已知生成需檢驗的試樣的數碼圖像數據並且為了完成診斷而將這些圖像數據傳遞給其上安裝有專用實驗室軟體的數據處理單元而且進行計算機輔助的分析處理。在這種至少部分自動化的螢光顯微術中，特別是為了在完成化驗診斷時能夠保障高質量保持不變，生成和選擇高質量的圖片具有突出的重要性。所拍攝圖片的重要的質量特徵最終在於它們的清晰度，因而需檢驗的生物材料的聚焦具有特別的重要性。為了對需檢驗的生物材料或者培養基進行聚焦通常情況下在不同的平面中拍攝大量的圖片，在電子分析處理期間這些圖片中在質量上不合格的圖片又被廢棄。在用於顯微鏡的自動聚焦方面已知有各種不同的技術方案。其中，通常用在入射光顯微鏡中的主動式自動聚焦系統在這裡的出眾之處在於藉助輔助光源在需檢驗的試樣的表面上或在覆蓋試樣的覆蓋玻璃上投射光點或記號，分析處理所述光點的形狀、位置或大小並且在分析處理的基礎上聚焦在試樣表面上或覆蓋玻璃表面上。例如由DE3446727C2已知一種這樣構造的主動式自動聚焦系統並且應該能夠實現快速自動聚焦。在透射光顯微鏡中通常情況下用被動式自動聚焦系統代替主動式自動聚焦系統。如其例如由DE3439304C2已知的那樣，在對拍攝的圖像數據進行比較的基礎上測算出聚焦面，即在其內拍攝到最清晰的圖片的平面。可是因為為了達到令人滿意的結果必須實施多次搜索，所以這種系統經常較慢。由DE102010035104已知另外一種特殊的主動式自動聚焦系統。在該文獻中介紹了一種用來對微弱發光的培養基進行自動聚焦的裝置，該裝置應該保障快速的圖像聚焦。較快的聚焦一方面應該提高自動顯微術的效率而另一方面應該使螢光染料的褪色在聚焦期間最小化。所介紹的技術方案的出眾之處在於首先在透射光模式中進行多次拍攝並且藉助已知的分析處理方法從中確定最清晰的圖片。在切斷透射光源之後，使顯微鏡的十字工作檯向在透射光模式中確定的聚焦面運動。為了生成螢光圖像，現在激活激發光源。但是由於螢光在不同的平面內能夠關於培養基的濃度發生變化，所以通常情況下還需要相對在透射光模式中確定的聚焦面對螢光中的聚焦面進行調整。不過為了確定精確的聚焦面，由於之前在透射光模式中完成的預聚焦，只需在比較小的搜索範圍內拍攝少量的圖片。最終藉助數位相機拍攝位於精確的聚焦面內的螢光圖像並且為了進行進一步診斷而傳遞給數據處理單元。進一步開發螢光顯微術中的自動聚焦系統的目的始終是使用於聚焦所需的時間或者在聚焦期間所拍攝的以及不被用於之後的培養基檢驗的圖片的數量最小化。為此由DE10100247A1已知用來在螢光顯微術中對培養基進行自動聚焦的另一種方法，通過該方法物鏡焦點高度準確並且儘管如此在比較短的時間間隔內也可確定。在這種情況中介紹了一種幹涉顯微鏡，在該幹涉顯微鏡中載片單元的面設有光學顯微鏡可探測到的塗層。反射的光由探測器探測並且藉助探測信號推斷出在幹涉顯微鏡的目標區域內的相位。通過這種方式最後能夠以適宜的方式對幹涉顯微鏡進行校準。為了藉助抗體使特殊的蛋白質可見，此前所介紹的自動聚焦或至少部分自動聚焦的顯微鏡得到多次應用。通過這種方式確定了在哪種組織中具有特異的蛋白質以及該蛋白質定位在細胞的哪個區間內。在很多情況下由組織切片構成的固定的組織被用於這種抗體染色。通過如下方式生成所述的組織切片首先製造健康的組織的冷凍切片並置於載物玻璃的表面上，特別是載片的或覆蓋玻璃的表面上。接著使所述組織解凍並乾燥。通常情況下，組織切片在已知的測試系統中固定在標準載片上，其中，為每個組織切片才用一個單獨的標準載片。除了此前介紹的藉助設置在標準載片上的組織切片對患者試樣進行檢驗的可能性以外，還已知了歐蒙股份公司(Euroimmun AG)的所謂的生物晶片技術。這個技術與總是將組織切片固定在為檢驗而準備的標準載片上的傳統的間接免疫螢光技術不同，該技術由於需檢驗的試樣的小型化而提供了使自身抗體與感染抗體的確定標準化的可能性。通過這種方式使實驗室內的工作得到簡化而且效率更高。歐蒙公司的生物晶片涉及的是帶有生物材料的比較小的載體。在這種情況下充分利用了如下效果只要將組織切片置於承載切片的培養基上並且與該培養基又共同固定在載片上或分析板上，則為了檢驗就可以製造和採用很小的組織切片。標準覆蓋玻璃是指約100微米至200微米的薄的、矩形的或圓形的、通常面積為18X 18平方毫米的玻璃片，而生物晶片則是塗敷有適宜的生物材料的覆蓋玻璃碎片，因此這些碎覆蓋玻璃碎片通常具有較小的表面。因此與標準覆蓋玻璃相比，生物晶片的出眾之處一方面在於明顯小得多的空間需求，另一方面在於所需組織的量得到明顯減少。在製造生物晶片時，首先同樣將所需組織的冰凍切片置於標準覆蓋玻璃上，然後使其部分解凍並乾燥。接著通過在組織切片的區域內用金剛石刀或者雷射生成缺口線，沿著這些缺口線使塗層的覆蓋玻璃斷裂並且這樣分成切片，使帶有組織的覆蓋玻璃成碎片。為了能夠實現更好的、特別是更有效的檢驗，將生物晶片置於載片的合適的反應區(Reaktions-feld)上。就此而論，可考慮在一個載片上設置多個用於相應的生物晶片的反應區，其中，也可以在一個反應區上設置一個以上的生物晶片，優選帶有不同的組織。為了特別有效地設計對患者試樣的檢驗，通過在一個載片上準備大量的、帶有相應的生物晶片的反應區而構成適宜的生物晶片一馬賽克 (Biochip-Mosaike )。為了檢驗患者試樣，不論是採用位於標準覆蓋玻璃上的組織切片還是採用生物晶片或者特殊的生物晶片一馬賽克 ，在原則上試樣的處理過程、特別是患者血清的稀釋過程以及組織切片的培養過程和藉助顯微鏡的視覺檢驗過程都是相同的。在處理試樣期間，在應該檢驗是否存在特異抗體的、稀釋的患者血清中以及在一種結合物(Konjugat)中培養組織，該結合物包括通常從動物身上獲得的抗體，這些抗體被用螢光材料做了記號並且是針對患者血清中被懷疑的抗體。只要患者血清具有抗組織切片的抗原的抗體，則不僅這種抗體結合在組織切片上而且被螢光標記的二次抗體(Sekundaerantikoerper)也結合在黏附在組織切片上的人體抗體上。藉助突光顯微鏡最終可以發現結合在相應的組織結構上的螢光染料。在用顯微鏡檢驗之前，為培養的組織切片塗敷封固劑，諸如經過PH緩衝處理的(pH-g印uffert)甘油，並且用覆蓋玻璃覆蓋所述組織切片。如此設置覆蓋玻璃，使得它雖然與組織切片的表面保持安全距離，但是可以毫無問題地用顯微鏡進行觀察。

發明內容
如已經提及的那樣，進一步開發用來檢驗患者試樣的自動設備的目的基本上在於儘可能高效率地設計從輸入試樣到完成實驗診斷的所有方法步驟並且同時儘可能地消除可能的錯誤根源。從使實驗室的工作更加高效和更加可靠這個普遍的願望出發，本發明的特殊目的在於，如下地進一步改進現有技術中已知的用於生物材料的自動顯微術的技術方案，即，能夠以有利的方式使帶有位於其上的生物晶片、特別是生物晶片一馬賽克的載片的顯微術自動化。首先，應該可以用比較簡單的方法實現對設置在生物晶片上的生物材料進行聚焦的過程並且同時應該快速且高質量地完成。需闡述的技術方案應該可以簡單地整合到已知的用於生物材料自動顯微術的系統中並且輔助在實驗室工作的人員。本發明的另一個目的在於，使在聚焦期間拍攝的圖片數量和之後圖像分析處理所不需要的圖片數量最小化。上述目的通過如權利要求1所述的設備以及如權利要求13所述的方法得以實現。本發明的有利的實施方式為從屬權利要求的主題並且在下文中部分參照附圖來作進一步闡述。本發明涉及一種用來對生物材料進行自動檢驗的設備,其包括顯微鏡，生物材料在該顯微鏡的十字工作檯上設置在載片或分析板與至少一個蓋片之間；該設備還包括至少一個用於對生物材料照明的光源以及攝影單元，該攝影單元拍攝至少一張生物材料的藉助顯微鏡的物鏡放大的圖片並傳遞給分析處理單元，其中，設置有標記，該標記能夠由用來對生物材料進行自動聚焦的裝置識別，而且能夠通過十字工作檯在所述標記的識別為基礎上的有針對性的運動來實施聚焦，並且如此改進，使得生物材料設置在通過破碎和分割覆蓋玻璃而製成的生物晶片上，該生物晶片安置於載片上，而且標記位於所述生物晶片的朝向生物材料的那側上。利用根據本發明的技術方案保障了對設置在生物晶片上的生物材料高度準確地但儘管如此仍然比較迅速地完成聚焦。如在下文中還將詳細闡述的那樣，通過在生物晶片上設置優選在製造生物晶片時在分割本來的覆蓋玻璃之前就已經塗敷在所述覆蓋玻璃上的標記，可以對生物材料進行簡單而可靠的聚焦。將塗敷標記整合在覆蓋玻璃的製造過程中在此提供的優點是在還未成碎片的覆蓋玻璃上塗敷標記明顯地比在較小的生物晶片上塗覆標記簡單。對有效的聚焦過程重要的是標記位於生物晶片的表面上，該表面與生物材料的表面相比比較平坦並且這樣能夠實現精確的距離確定。在這種情況下原則上可以將標記設置在生物晶片的朝向生物材料的那側上或者設置在生物晶片的背向該側的背面上。在聚焦過程開始前的第一步是進行對標記的探測，特別是確定物鏡與標記之間的距離。在確定標記的位置和/或方位、特別是標記與物鏡之間的距離的基礎上確定目標間隔。目標間隔在此具有至物鏡的最大距離和最小距離，標記和設置在生物晶片的表面上的試樣位於這些距離之間。在本發明的一個特別的實施方式中，在確定目標間隔之後繼續在所述目標間隔之內對生物材料進行聚焦。因為通過這種方式對焦點的搜索限制在所述目標間隔上，所以能夠明顯縮短聚焦過程。優選在透射光模式中實施對標記的聚焦，這另外具有的優點是用螢光染料標記的生物材料僅僅短時間地在激發波長的範圍內被照射並且因此能夠以適當的方式抵抗螢光染料的提早褪色。然而原則上同樣可考慮在螢光模式中實施聚焦。根據本發明的聚焦方法主要能夠通過如下方式得以實現，即，使得聚焦過程所需時間相對眾所周知的方法縮短。作為備選或補充的是，為了探測標記採用輔助輻射源、諸如雷射器。這種所採用的雷射器的射線優選通過標記反射並且由接收裝置接收。這樣根據對光程和/或渡越時間的分析處理可以確定標記與物鏡之間的距離。因為輔助輻射源、特別是雷射器位於相對物鏡的一個限定的位置中，所以這一點是可能的。任意一種圖案都可以用作由用來聚焦的裝置識別的標記。按照有利的方式，至少沿延伸方向具有等距離的網格線適合。在優選為一種組織的冷凍切片的生物材料被置於生物晶片上之前，在覆蓋玻璃上或者生物晶片上安置這樣的網格線。在這種情況下如此構造所述標記，使得標記與安置在生物晶片之上的生物材料之間的影響能夠被儘可能排除。本發明的一種特殊的改進方案設定作為生物晶片的標記設置有至少三個輪廓，它們的中心點等距地間隔開。這種輪廓被用來聚焦的裝置識別，因而顯微鏡的物鏡可以在聚焦完成後被精確地調整到生物晶片的表面上或者位於那裡的生物材料上。在任何情況下藉助根據本發明的設置在生物晶片上的標記保障了生物晶片的位置和/或方位、特別是生物晶片表面到顯微鏡物鏡的距離被可靠識別。設置在生物晶片表面上的輪廓優選構造成圓圈，它們的中心彼此等距地間隔開。就此而論可考慮在覆蓋玻璃破碎之前或之後藉助適宜的裝置將這樣的標記以所期望的形式塗敷在生物晶片的表面上。然而同樣可考慮將表面至少部分地塗敷成平面並且為了生成所期望的標記而設置相應的模板或可以在平面塗敷之後例如通過蝕刻生成相應的標記輪廓。在本發明的另一種實施方式中設定確定包圍所述標記的區域，在該區域內攝影單元不拍攝圖片和/或被拍攝的圖片在分析處理單元中在處理時不被使用或被廢棄或被刪除。通過設置圍繞被設置在生物晶片表面上的標記的相應區域來保障在對生物材料進行檢驗時或者在對患者試樣做出診斷時不考慮可能情況下與所述標記發生反應的組織區域或者細胞。根據本發明的另一種改進方案設定所述標記構造成生物晶片表面的平面塗層的形式。在這種情況下，以有利的方式為特別是生物晶片的三個區域設置平面的標記。在一種十分特殊的設計方案中，生物晶片的整個為了標記而設置的表面都設有相應的平面標記。藉助生物晶片的表面的完全平面的或部分平面的塗層，然後同樣基於塗層上的反射或透射而在測距傳感器中生成相應的信號。含有矽的標記有利地適於在用自動顯微鏡工作期間的識別。為此備選或補充可考慮所述標記具有金屬、優選鉻。同樣可考慮介電層，這些介電層的光譜反射性能為了測距傳感器而被最佳化並且不對圖像分析產生不良影響。如果將金屬或電介體用於生物晶片表面上的標記，可考慮將金屬或電介體汽化滲鍍或濺鍍到所述表面上。在製造被作了相應標記的生物晶片方面，這一點具有的優點是金屬的汽化滲鍍可靠地完成而且實施成本較低。在一種特殊的實施方式中，此處還可以在完全氣相噴鍍的表面區域中通過蝕刻雕出特殊的輪廓。根據本發明的另一種實施方式可考慮用來對生物材料進行自動聚焦的裝置具有至少一個雷射光源或多色的輻射源和探測器，該探測器至少部分地接收被標記反射的光線並且在接收到的光線的基礎上產生信號，該信號被分析處理並且在考慮到被分析處理的信號的情況下為了對生物材料進行聚焦而使十字工作檯有針對性地運動。在使用雷射光源以及探測器時有利地適合於至少部分地用金屬諸如鉻塗敷生物晶片的表面並且這樣反射雷射束。藉助所描述的探測器的雷射光源可以以優選的方式確定生物晶片的表面的位置和/或方位，在該表面上設置有生物材料。另外，本發明的出眾之處在於用來自動檢驗生物材料的方法。根據本發明的方法包括顯微鏡，生物材料在該顯微鏡的十字工作檯上設置在載片或分析板與至少一個蓋片之間，在該方法中生物材料被照明，在該方法中用攝影單元拍攝至少一張生物材料的藉助顯微鏡的物鏡放大的圖片並傳遞給分析處理單元，而且在該方法中利用用來對生物材料進行自動聚焦的裝置探測標記、確定該標記的方位和/或位置，並且在所探測到的標記的方位和/或位置的基礎上通過使十字工作檯有針對性地運動來實施對生物材料的聚焦，如此改進該方法，即，在通過破碎和分割覆蓋玻璃而製成的生物晶片上提供所述生物材料，該生物晶片安置在載片上，而且探測在生物晶片的表面上的標記。根據本發明的方法的一種有利的改進方案設定在所述標記的被探測到的方位和/或位置的基礎上確定目標間隔，在聚焦期間中十字工作檯在該目標間隔內移動。通過與承載生物材料的生物晶片表面的被探測到的位置和/或方位相關地設置目標間隔，能夠以優選的方式確定一個間隔，該間隔包括生物晶片表面之上和之下的區域。在聚焦過程期間使十字工作檯如此移動，使得聚焦面在間隔界限之間運動。由此通過優選的方式將十字工作檯在聚焦期間的移動位移限定在適當的值上。這樣在所述標記的被探測到的方位和/或位置的基礎上，十字工作檯從物鏡具有到生物材料的第一距離的至少第一位置中移動進入所述物鏡具有到所述生物材料的第二距離的第二位置中，並且此外在所述第一與第二位置之間的兩個不同的平面內分別拍攝至少一張所述生物材料的圖片並傳遞給分析處理單元。在這種情況下能夠容易理解在拍攝至少兩張在不同平面內的圖片時，這些圖片具有不同的清晰度。通過用眾所周知的圖像數據分析處理方法來分析處理在目標間隔內在至少兩個不同平面內拍攝的圖片，最後能夠以優選的方式確定最清晰的圖片。再通過選出最清晰的圖片來確定聚焦面。因此用所介紹的方法能夠以有利的方式在對所拍攝的圖片在分析處理單元中進行比較的基礎上確定聚焦面。那些被拍攝的而且也位於聚焦面之內的圖片最終被傳送給用來完成診斷的裝置。優選此處涉及的是數據處理單元，特別是其上安裝有實驗室軟體的電腦。藉助該實驗室軟體，將為特殊的患者試樣所拍攝的圖片歸入患者數據記錄並相應地存儲。對完成診斷負責的醫生能夠以比較簡單的方式允許將整個關於被檢驗的患者試樣的數據迅速地顯示在顯示屏上。


下文將參照附圖藉助實施例進一步闡述本發明而不制約本發明的一般思想。附圖中圖1為帶有生物晶片的載片；圖2為帶有生物晶片的載片的反應區的剖視圖；圖3為帶有標記的生物晶片的俯視圖；圖4為帶有自動聚焦的顯微鏡的示意圖；圖5為帶有自動聚焦的顯微鏡的前視圖；圖6為帶有自動聚焦的顯微鏡的側視圖，以及圖7為帶有自動聚焦的顯微鏡的等軸圖。
具體實施例方式首先，圖1示出的是一個其上設置有生物晶片2的載片I。為此載片I具有十個反應區，這些反應區相對載片I的其餘的表面構造成小的凹部。在反應區3上設置有生物晶片2。原則上可考慮在一個反應區3上設置一個或也可以是多個生物晶片2。就此而論，當然可以以適當的方式使反應區3的大小相匹配。生物晶片2涉及的是帶有生物材料的小載體，其通過將組織切片塗敷在標準覆蓋玻璃上並且接著使覆蓋玻璃成碎片而製成。標準覆蓋玻璃涉及的是約100微米至200微米的薄的、矩形的或圓形的玻璃板，該玻璃板通常具有18X18平方毫米的面積，而生物晶片2則是塗敷有適當的生物材料的覆蓋玻璃碎片，這些覆蓋玻璃碎片因此具有小得多的表面。與相應的檢驗特性(Untersuchungsprofil)以及客戶需求相關地可以在一個載片I上為相應的生物晶片2設置大量的反應區3。在這種情況下同樣可考慮在一個反應區3上又設置一個以上的帶有不同組織的生物晶片。在實驗室中檢驗期間用各種不同的液體、特別是患者試樣來培養布置在載片I的反應區3上的而且塗敷有組織的組織切片。在培養結束之後並且在用顯微鏡檢驗之前，為所培養的組織切片塗敷經過PH緩衝處理的、作為封固劑的甘油並且用覆蓋玻璃4覆蓋所述組織切片。如此布置覆蓋玻璃4，使得該覆蓋玻璃雖然與組織切片的表面具有安全的距離，但是可以毫無問題地用顯微鏡進行觀察。圖2示出的是載片I的反應區3的大幅放大的剖視圖。在載片I的反應區3上有塗敷有組織切片6的一部分的生物晶片2。所述組織切片塗覆有封固劑5並且通過覆蓋玻璃4覆蓋。生物晶片2的承載組織切片6的表面在朝向顯微鏡的南側上具有線條形式的標記7。作為對此的補充，在圖3中示出的是設置在載片的反應區3上的生物晶片2的俯視圖。用作標記7的線條按照具有數個同心圓的組的方式布置在表面上。在用顯微鏡檢驗期間，標記7藉助用來對位於生物晶片上的生物材料6進行自動聚焦的裝置得到識別並實施聚焦。作為可選，在聚焦過程期間考慮標記7沿Z方向的膨脹，以便實現聚焦的最佳化。因此設置在生物晶片2上的標記用來探測聚焦面。對標記7來說重要的是該標記不與位於生物晶片2上的生物材料6發生反應。作為在圖3中所示出的、同心圓組形狀的標記7的實施形式的備選方案，可考慮在生物晶片2的表面上設置平行的線或網格圖案。同樣可以是平面的標記7，特別是含有金屬或電介體。另外，根據本發明所設置的標記7或者可以設置在生物晶片2的上側上，即在朝向位於其上的組織6的那側上，或者可以設置在背側上，即朝向載片I的表面上。始終重要的是標記7可以由用來對位於生物晶片2上的生物材料6進行自動聚焦的裝置可靠地識別。此外，在測算聚焦面時根據標記7的實施形式和設計結構考慮所述標記7沿Z方向的膨脹和/或承載組織的生物晶片2的厚度。為了對患者試樣進行檢驗，設置有根據圖1所示的、配備有大量的由覆蓋玻璃4覆蓋的生物晶片2的載片I。在這種情況下，在不同的生物晶片2上安置有各種不同的組織6或者生物材料。帶有生物晶片2的載片I定位且鎖定在顯微鏡8的十字工作檯9上。就此而論可考慮將載片I手動地或藉助操縱裝置13定位在十字工作檯9上。特別是在至少部分自動化的實驗室內運行的顯微鏡8中，經過培養的、帶有生物晶片2的載片I儲存在適宜的載片箱12內並且在這個載片箱與十字工作檯9之間藉助操縱裝置13來自動運動。適合的操縱裝置13優選具有抓取裝置，其中所述抓取裝置或可以相對十字工作檯9運動或可以與所述十字工作檯共同運動。在任何情況下，載片I都具有標題形的或代碼形的記號14，該記號能夠準確地鑑定位於生物晶片2上的患者試樣以及優選還有位於生物晶片2上的組織類型。 圖4示出的是螢光顯微鏡8的示意圖，其包括透射光裝置、可豎直移動的十字工作檯9和用來攝影的數位相機17。另外設置有帶有二色分光鏡18和激發光源16的激發光裝置。分光鏡18將由激發光源16發射的激發光向設置在生物晶片2上的生物材料6的方向反射。與此相反，由透射光源15發射的並通過轉向鏡23改變方向的透射光從帶有生物材料6的生物晶片2的方向中透射出來。二色分光鏡18優選構造成反射濾光鏡並且反射所有小於510納米的波長。簡而言之，二色分光鏡18因此對於激發光起到轉向鏡的作用，而具有螢光波長的光線暢通無阻地穿過該分光鏡18。作為分光鏡或者完全反射激發光的反射濾光鏡18的補充,優選還設置有長通閉塞濾光鏡(Langpasssperrfilter) 19,該長通閉塞濾光鏡濾除波長在510納米以下的光線。在這裡介紹的實施例中，螢光染料使用的是螢光素,該螢光素的吸收峰值為485納米而該螢光素的發射峰值為514納米。所介紹的技術的基本觀點在於沿光路的方向設置在長通閉塞濾光鏡19之後的數位相機17不但必須在螢光中拍攝圖片而且還必須在透射光中拍攝圖片。由於這個原因，透射光源15構造成波長在520至535納米內的LED。這種波長的光線不但穿過分光器18而且還穿過閉塞濾光鏡19。為了聚焦過程，透射光裝置藉助透射光源15生成具有的波長在所採用的螢光染料的發射波長範圍內的光線。在這種情況下，由透射光源15發射的光線通過適宜的鏡組22聚焦而且接著通過轉向鏡23轉向為豎直向上，以便從下側發射穿過帶有位於其上的生物材料6的生物晶片2。所採用的、塗敷在生物晶片2上的試樣6涉及的是例如培養的人的上皮細胞，抗細胞核抗體接合在這些上皮細胞上，它們被用螢光素標記的抗人體抗體(Ant1-Human-Antikoerper)著色。由於吸收峰值、即突光素的激發波長為485納米,染料不通過透射光激發成螢光。如另外在圖4中可以看到的那樣，由透射光源15沿水平方向發射的透射光首先通過鏡組22聚束並且然後通過轉向鏡23轉向為豎直方向。透射光穿過設置在十字工作檯9上的、帶有生物材料6的生物晶片2，通過顯微鏡8的物鏡20聚束並且暢通無阻礙地穿過二色分光鏡18以及長通閉塞濾光鏡19，以便然後到達數位相機17的傳感器。數位相機17以約10毫秒的相對短的曝光時間生成生物材料6的細胞壁的、用透射光生成的圖片。為了使在透射光模式中聚焦所需的、在不同的垂直於z軸線的平面內拍攝的圖片的數量最小化，生物晶片2在它的表面上具有標記7而且顯微鏡8具有用來識別該標記的裝置。在透射光模式中的聚焦過程開始之前，現在首先測算標記7到物鏡20的距離和/或其相對物鏡20的位置。為此設置有發射光線的光源或者輻射源，所述光線最終由標記7反射並且由適當的傳感器探測。在考慮渡越時間和/或光程的情況下測算標記7到物鏡20的距離和/或其相對物鏡20的位置。作為可選，在上述的對距離和/或位置進行測算時還考慮標記7的厚度、即該標記沿z方向的延伸。在考慮所測算的標記7到物鏡的距離的情況下，十字工作檯9藉助電動機24如此沿z方向移動，使得透射光模式中的聚焦僅僅在一個確定的目標區域內實施。在這個沿z方向具有幾微米的距離間隔(Abstands-1ntervall)的目標區域內，在透射光模式中拍攝少量的，優選三張在不同平面中的圖片。在此之後或至少部分同步地通過相連接的數據處理設備(未示出)藉助已知的相鄰像素灰度方差法(Sum-Modulus-Difference_Verfahren)(SMD)來測算每張單獨的圖片的相應的清晰度的值。所述值最大的圖片鑑定為最清晰的圖片而且十字工作檯的附屬的(沿z方向的)豎直位置確定為聚焦面。在測算聚焦面時，優選與生物晶片上的標記的種類和實施形式無關地不考慮圖片中反映標記附近區域的區域。這樣做是為了確保在分析處理時不考慮位於生物晶片2上的生物材料6的、可能受到標記影響的部分。在切斷透射光源15之後，使十字工作檯9向在透射光中測算的聚焦面運動。為了生成螢光圖像，接著接通構造為LED的激發光源16。所發射的光線通過適宜的鏡組21聚焦並且投射到已經介紹的二色分光鏡18上，該二色分光鏡將激發光線向下反射並且這樣穿過物鏡16引導到生物晶片2上的生物材料6上。在那裡所述激發光線投射到螢光染料上，該螢光染料由於所述激發而發射主波長為514納米的漫射光線。為了由數位相機17拍攝，螢光輻射的一小部分豎直向上地射出，穿過物鏡16且穿過二色分光鏡18以及長通閉塞濾光鏡19。由於約500毫秒的長的曝光時間，相機17生成螢光圖像。由於螢光的位置在生物材料6的高度內變化，所以所述螢光內的聚焦面相對在透射光中發現的聚焦面具有偏差。為了確定精確的聚焦面，現在也在只有幾個微米大的搜索區域內拍攝幾份螢光圖像。如在透射光中那樣，在此為了每張圖片，十字工作檯位置沿豎直方向(z方向)電動驅動地發生變動。藉助相鄰像素灰度方差法(SMD)測算最清晰的螢光圖像。由於首先實施的透射光中的聚焦，其內必須在螢光中測算聚焦面的區域比較小。通過這種方式為了發出輻射而激發螢光染料的並因此至少部分被使用的時間可以最小化。此外，透射光中的曝光時間明顯比螢光中的短。為了實現自動聚焦所需的時間的進一步減小，藉助設置在生物晶片上的標記7保障只必須拍攝少數幾張、優選3張透射光中的圖片。在未設置相應的標記的情況下，在聚焦期間通常拍攝約100張透射光中的圖片。因此透射光聚焦的持續時間在考慮到相應的曝光時間的情況下從100X 10毫秒=1秒縮短到3X 10毫秒=30毫秒。如果在螢光光線中實施整個自動聚焦過程，聚焦的持續時間甚至會上升到約200 X 500毫秒=100秒。即使是在由於在螢光中的曝光時間長而對圖像清晰度的計算(SMD)能夠與圖像拍攝同時進行而且因此一旦獲得了最清晰的圖片就能馬上中斷圖像拍攝的情況下，平均還是需要約50秒的累計曝光時間。圖5、6和7分別示出的是用來對生物試樣6進行自動檢驗的螢光顯微鏡8。相同的構件依然設有相同的附圖標記。所示出的顯微鏡8具有用來對生物材料6進行自動聚焦的裝置，該裝置如此構造，使得它識別設置在生物晶片2上的標記7，這些生物晶片設置在載片I上，並且以這個識別為基礎沿z方向確定目標區域，聚焦面位於該目標區域之內。為了精確地確定聚焦面，只需再進行少量的圖像拍攝，從而與已知的系統相比，所述自動聚焦能夠明顯地加快速度。突光顯微鏡8具有一個容納部，用於儲存和提供多個載片I的載片箱12可固定在該容納部上。藉助被構造成固定在十字工作檯9上的抓取裝置的操縱裝置13可以將用來檢驗而需要的載片I有針對性地從載片箱12中取出並且接著又放到這個載片箱中。為了分別保證明確的鑑定，不但載片箱12而且各個載片I都具有一個標題形的或代碼形的記號。藉助實驗室軟體對試樣的準備、處理和檢驗進行控制，檢驗結果也通過該實驗室軟體存儲及輸出。為了準備用顯微鏡進行檢驗的過程，將其內固定有所需的載片I的所謂的託架25從載片箱12中取出並且藉助操縱裝置13將該託架鎖定在十字工作檯9上的所期望的位置上。圖8示例性示出託架25的構造。所示出的託架25構造成框架形的並且具有五個用於載片I的容納部。帶有設置在其上的生物晶片2的載片I通過所述託架25安全地固定並且通過這種方式能夠被可靠地儲運和運輸，所述生物晶片分別設置在十個反應區3上。在通過抓取裝置形式的操縱裝置12從載片箱12中取出託架25之後如此完成定位，即，使得為了檢驗所設置的生物晶片2最終處於顯微鏡的物鏡10的下方。數位相機17位於所述物鏡16的上方，通過該數位相機拍攝所需的圖片。透射光源以及激發光源15、16以及其餘的光學構件的設置結構與在圖4的說明中相關闡述的設置結構相符。已經介紹過的、包括生物晶片上的標記7的探測以及不同平面內的圖片的拍攝在內的自動聚焦過程，首先在每次檢驗的生物晶片的中心區域內進行。在此之後，還在所述生物晶片2的兩個另外的、位於中心左側或者右側的區域內繼續進行聚焦以及與此相關的圖像拍攝。為此十字工作檯9相應地沿水平方向移動。始終重要的是在聚焦時首先對生物晶片2上的標記7進行探測，以便這樣以合理的方式限定所述聚焦面預計位於其內的水平區域以及在所需的時間方面最佳化自動聚焦過程。附圖標記列表I 載片2 生物晶片3 反應區4 覆蓋玻璃5 封固劑6 生物材料7 標記8 顯微鏡9 十字工作檯10 物鏡11 用來自動聚焦的裝置12 載片箱13 操縱裝置14 記號15 透射光源16 激發光源17 數位相機18 二色分光鏡19 長通閉塞濾光鏡20 物鏡21 激發光源的鏡組22 透射光源的鏡組23 轉向鏡24 電動機25 託架
權利要求
1.用來對生物材料(6)進行自動檢驗的設備，其包括:顯微鏡(8)，所述生物材料(6)在該顯微鏡的十字工作檯(9)上設置在載片(I)或分析板與至少一個蓋片(4)之間；至少一個用於對所述生物材料(6)進行照明的光源(15、16);以及攝影單元(17)，該攝影單元拍攝至少一張所述生物材料(6)的藉助所述顯微鏡(8)的物鏡(10)放大的圖片並傳遞給分析處理單元，其中，設置有標記(7)，該標記能夠由用來對所述生物材料(6)進行自動聚焦的裝置(11)識別，並且能夠在識別所述標記(7)的基礎上通過所述十字工作檯(9)的有針對性的運動來實施聚焦，其特徵在於:所述生物材料(6)設置在通過破碎和分割覆蓋玻璃而製成的生物晶片(2)上，該生物晶片安置在所述載片(I)上，而且所述標記(7)位於所述生物晶片(2)的表面上。
2.如權利要求1所述的設備，其特徵在於:所述生物晶片(2)的標記(7)構造成網格線圖案。
3.如權利要求1所述的設備，其特徵在於:所述生物晶片(2)的標記(7)具有至少三個輪廓，這些輪廓的中心點等距地間隔開。
4.如權利要求3所述的設備，其特徵在於:所述輪廓構造成圓圈。
5.如權利要求1至4之任一項所述的設備，其特徵在於:確定包圍所述標記(7)的區域，在該區域內不拍攝圖片和/或拍攝的圖片在分析處理單元中在處理時不被使用。
6.如權利要求1所述的設備，其特徵在於:標記(7)至少局部地平面地覆蓋生物晶片(2)。
7.如權利要求1或6所述的設備，其特徵在於:標記(7)平面地覆蓋所述生物晶片(2)的朝向所述生物材料(6)的那側。
8.如權利要求1至7之任一項所述的設備，其特徵在於:所述標記(7)具有矽。
9.如權利要求1至7之任一項所述的設備，其特徵在於:所述標記(7)具有金屬。
10.如權利要求1至7之任一項所述的設備，其特徵在於:所述標記(7)具有電介體。
11.如權利要求1至7之任一項所述的設備，其特徵在於:所述標記(7)具有鉻。
12.如權利要求1至11之任一項所述的設備，其特徵在於:所述標記(7)被汽化滲鍍和/或噴鍍在所述生物晶片(2)上。
13.如權利要求1至12之任一項所述的設備，其特徵在於:所述用來對所述生物材料(6)進行自動聚焦的裝置(11)具有至少一個雷射輻射源或多色輻射源和探測器，該探測器至少部分地接收由所述標記(7)反射的輻射並且在接收到的輻射的基礎上產生信號，該信號被分析處理並且在考慮到被分析處理的信號的情況下為了對所述生物材料(6)進行聚焦而進行所述十字工作檯(7)的有針對性的運動。
14.用來對生物材料(6)進行自動檢驗的方法，其包括:顯微鏡(8)，所述生物材料(6)在該顯微鏡的十字工作檯(9)上設置在載片(I)或分析板與至少一個蓋片(4)之間，在該方法中，所述生物材料(6)被照明，用攝影單元(17 )拍攝所述生物材料(6)的至少一張藉助所述顯微鏡(8)的物鏡(10)放大的圖片並傳遞給分析處理單元，而且利用用來對所述生物材料(6)進行自動聚焦的裝置(11)探測標記(7)，確定該標記(7)的方位和/或位置並且在所探測到的所述標記(7)的方位和/ 或位置的基礎上通過所述十字工作檯的有針對性的運動來對所述生物材料(6)實施聚焦，其特徵在於:在通過破碎和分割覆蓋玻璃而製成的的生物晶片(2)上提供所述生物材料(6)，所述生物材料(6)設置在該生物晶片上，而且在所述生物晶片(2)的表面上探測所述標記(7)。
15.如權利要求14所述的方法，其特徵在於:在所述標記(7)的被探測到的方位和/或位置的基礎上確定目標區域，在該目標區域內，所述十字工作檯(9)在聚焦期間移動。
16.如權利要求14或15所述的方法，其特徵在於:在所述標記(7)的被探測到的方位和/或位置的基礎上，使所述十字工作檯(9)至少從所述物鏡(10)具有到所述生物材料(6)的第一距離的第一位置中移動到所述物鏡(10)具有到所述生物材料(6)的第二距離的第二位置中，而且在所述第一位置與所述第二位置之間的兩個不同的平面內分別拍攝至少一張所述生物材料(6)的圖片並傳遞給所述分析處理單元。
17.如權利要求14至16之任一項所述的方法，其特徵在於:為了探測述標記(7)以及為了照明所述生物材料(6)採用不同波長的光線。
18.如權利要求14至17之任一項所述的方法，其特徵在於:在聚焦期間以及在所述十字工作檯(9 )在所述目標區域內的期間，對所述生物材料(6 )進行照明，並且在所述目標區域內部的兩個不同的平面中分別拍攝至少一張所述生物材料(6)的圖片並傳遞給所述分析處理單元。
19.如權利要求14至18之任一項所述的方法，其特徵在於:在所述分析處理單元中比較所拍攝的圖片的基礎上確定聚焦面。
20.如權利要求19所述的方法，其特徵在於:將處於所述聚焦面內的圖片傳遞給用來完成 診斷的裝置。
全文摘要
本發明涉及用來對生物材料(6)進行自動檢驗的裝置和方法，其包括顯微鏡(8)，在該顯微鏡的十字工作檯(9)上，生物材料(6)設置在載片(1)或分析板與至少一個蓋片(4)之間；至少一個用於對生物材料(6)進行照明的光源(15、16)以及攝影單元(17)，該攝影單元拍攝至少一張生物材料(6)的藉助顯微鏡(8)的物鏡(10)放大的圖片並傳遞給分析處理單元。在此設置標記(7)，該標記能由用來對生物材料(6)進行自動聚焦的裝置(11)識別，從而能在識別該標記(7)的基礎上通過十字工作檯(9)的有針對性的運動來實施聚焦。所述技術方案的特徵在於生物材料(6)設置在通過破碎和分割覆蓋玻璃製成的生物晶片(2)上，該生物晶片安置在載片(1)上，而且標記(7)位於生物晶片(2)的表面上。
文檔編號G02B21/34GK103080807SQ201180040622
公開日2013年5月1日 申請日期2011年8月23日 優先權日2010年8月23日
發明者M·莫林 申請人:歐蒙醫學診斷技術有限公司