用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒及方法
2023-04-22 19:18:26
用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒及方法
【專利摘要】一種用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，包括分別裝有RNA提取液、漂洗液、逆轉錄反應液、PCR擴增反應液、特異性鑑別引物、陰性對照品、陽性對照品並加蓋密封的多個試劑瓶或試劑管，其中的特異性鑑別引物的核苷酸序列如下：上遊引物：5』-AACRCCCAGGCGACTTCAG-3』；下遊引物：5』-TCTCATTAGGAGCAGTTCTTACAC-3』。本發明設計的試劑盒及方法不僅特異、準確、靈敏，且具有簡便、快速的特點，一次可鑑別三種不同的豬繁殖與呼吸症候群病毒類型，並解決了以往方法可能存在的漏檢問題。
【專利說明】用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒及方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術，特別涉及一種用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒 及方法。 技術背景
[0002] 豬繁殖與呼吸系統症候群（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，又稱豬藍耳病，是由豬繁殖與呼吸系統症候群病毒（PRRSV)引起的一種 高度接觸性傳染病，以引起母豬繁殖障礙、仔豬和肥育豬呼吸道症狀為主要特徵。豬繁殖與 呼吸系統症候群病毒（PRRSV)與多種病毒混合感染，常常伴發細菌繼發感染，且該病在全 世界範圍內大規模的流行，給養豬業造成了極大的經濟損失。該病1987年首次在美國發 現，當時被稱為"豬神秘病"（mystery swine disease, MSD，之後便迅速蔓延至世界大多數 養豬國家。1991年Wensvoort等首次分離到該病毒，並命名為（lelystad virus, LV)，在第 10次國際病毒大會上將該病毒歸屬於新設立的動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬。1996年郭寶 清等首次從國內PRRS血清陽性豬群中分離到PRRSV，從而證實了我國也有此病的流行（童 光志，周豔君，郝小芳等）。
[0003] 2006年夏季，我國中南部爆發了高致病性豬藍耳病，之後蔓延到全國各個省市。其 病原已確定是Nsp2基因發生連續缺失的高致病性豬藍耳病病毒變異株。高致病性豬藍耳 病能使各種年齡、各種品種的豬都感染髮病，且發病率高、病死率高、治癒率較低。據農業部 通報，2006年6月份，全國共有12個省份暴發"高致病性豬藍耳病（HP-PRRS) "疫情28次， 因"高致病性豬藍耳病"發病生豬379. 8萬頭，死亡99. 2萬頭。2007年，有26個省份的310 個縣市發生不同程度的豬高致病性藍耳病疫情，發病豬31. 3萬頭，死亡8. 2萬頭。近年來， 疫病形勢依然嚴峻，嚴重地影響了我國畜牧業發展。因此，為了監測和控制高致病性豬藍耳 病的感染，研究高致病性豬藍耳病毒變異株的快速檢測方法具有重要意義。
[0004] PRRSV傳統的檢測方法主要是病毒的分離培養鑑定，雖然該方法具有一定的特異 性和敏感性，但是PRRSV培養的條件苛刻，一般實驗室難以實現。同時操作繁瑣且耗時長， 不利於對大規模樣品進行檢測。免疫學檢測PRRSV的方法主要有酶聯免疫吸附試驗、間接 螢光抗體試驗等，但都有敏感性低或特異性較差的問題。此外，上述的這些檢測方法還存在 著無法區分普通PRRSV和現時國內流行的高致病性PRRSV變異株以及PRRSV疫苗毒株的局 限性。由於高致病性豬藍耳病發病率高、病程進展快、病死率高，傳統的檢測方法有可能延 誤診斷和治療。因此，開發早期、快速、特異、敏感的檢測技術非常必要。
[0005] 隨著分子診斷技術的飛速發展，聚合酶鏈式反應（PCR)技術已經廣泛應用於細 菌、微生物基因水平的研究，也給病毒的快速鑑定提供了可能。針對國內流行的高致病性 PRRSV變異株基因組的特點，國內學者建立了高致病性PRRSV RT-PCR檢測技術（童光志，周 豔君，郝曉芳.高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒的分離鑑定及其分子流行病學分析.中 國預防獸醫學報，2007, 29(5) :321-326)，該方法可以擴增PRRSV Nsp2基因，測序後通過軟 件進行比較，看是否在NSP2處發生缺失或缺失的區域是否與報導的缺失區域相同。這種方 法雖然能夠區分普通豬藍耳病和高致病性豬藍耳病，但顯然比較費時費力，不適用與臨床 檢測。還有學者通過參考普通PRRSV及高致病性PRRSV變異株的Nsp2基因序列，設計一 對位於緊靠缺失區兩端的保守區的引物，其擴增範圍覆蓋整個缺失區域，缺失毒株（高致 病性PRRSV變異株）和非缺失毒株（普通PRRSV株），預期擴增產物長度分別約230bp和 320bp，通過凝膠電泳分析可分別檢測出普通豬藍耳病和高致病性豬藍耳病（郝曉芳，周豔 君，田志軍。高致病性豬繁殖與呼吸症候群病毒RT - PCR鑑別診斷方法的建立.中國預防 獸醫學報，2007, 29 (9) : 705-709)。但該方法由於需要對PCR產物進行雜交分析等後處理， 極易造成PCR產物汙染，導致假陽性，不宜用於臨床診斷。
[0006] 常規的病毒血清學檢測方法普遍存在靈敏度不高的缺點，而一般的分子檢測病 毒，RNA提取質量的好壞對實驗結果影響很大，而RNA又特別容易降解，提取技術要求高；同 時，要檢測豬繁殖與呼吸症候群病毒的三種不同類型必須要設計不同引物對，檢測的過程 也要分開進行，費時費力。
【發明內容】
[0007] 本發明的目的，就是為了解決上述問題，提供一種用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群 病毒的試劑盒及方法。
[0008] 為了實現本發明的目的，本發明採用了以下技術方案：一種用於鑑別豬繁殖與呼 吸症候群病毒的試劑盒，包括分別裝有RNA提取液、漂洗液、逆轉錄反應液、PCR擴增反應 液、特異性鑑別引物、陰性對照品、陽性對照品並加蓋密封的多個試劑瓶或試劑管，以及分 隔併集中包裝這些試劑瓶或試劑管的包裝盒；
[0009] 所述特異性鑑別引物包括上遊引物和下遊引物，其核苷酸序列如下：
[0010] 上遊引物：5' -AACRCCCAGGCGACTTCAG-3' ；
[0011] 下遊引物：5 ' -TCTCATTAGGAGCAGTTCTTACAC-3 '。
[0012] 所述豬繁殖與呼吸症候群病毒包括PRRSV經典毒株、PRRSV高致病性毒株，以及 PRRSV疫苗毒株TJM-F92株。
[0013] 所述RNA提取液的配方包括：
[0014] Carrier RNA，4 ?IOul ;蛋白酶 K，10 ?20ul ;十二燒基硫酸鈉，1% ?4% ; Tris_C1150 ?250mmol/L ;EDTA,0? 5 ?lmmol/L ;pH7 ?8 ;
[0015] 所述漂洗液包括漂洗液1和漂洗液2 ;
[0016] 漂洗液1的配方為：鹽酸胍，4?6mol/L ;無水乙醇，50%?70% ;蛋白酶K, 80? 100ug/ml ；
[0017] 漂洗液2為：60?80%無水乙醇。
[0018] 所述逆轉錄反應液的配方包括：
[0019] 5 X RT Buffer ;2. 5mmol dNTP ;RNA 酶抑制劑（Rnase Inhibitor);逆轉錄酶 (M-MLV)。
[0020] 所述PCR擴增反應液的配方包括：
[0021] 10mmol dNTP Mix ； 10XTaq Buffer ；5U/ul Taq DNA Polymerase0
[0022] 所述陽性對照品包括PRRSV經典毒株陽性對照品、PRRSV高致病性毒株陽性對照 品和PRRSV疫苗毒株TJM-F92株陽性對照品；三個陽性對照品分別含有三種特定目的基因 序列的質粒；其中PRRSV經典毒株陽性對照品所含質粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 3所 示，PRRSV高致病性毒株陽性對照品所含質粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 4所示，PRRSV 疫苗毒株TJM-F92株陽性對照品所含質粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0023] 基於上述試劑盒的一種鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的方法，包括以下步驟：
[0024] (1)、提取待測樣品病毒總RNA ;
[0025] (2)、樣品病毒總RNA經反轉錄獲得其cDNA ;
[0026] (3)、以樣品cDNA為模板，加入特異性鑑別引物和PCR擴增反應液，進行PCR擴 增反應，擴增產物進行凝膠電泳，若電泳結果出現1879bp特異性條帶，則表示樣品中含有 PRRSV經典毒株；若樣品中出現1789bp條帶，則表示樣品中含有PRRSV高致病性毒株；若電 泳結果出現1429bp條帶，則表示樣品中含有PRRSV疫苗毒株TJM-F92株；若陽性對照溶液 出現條帶而待檢樣品無條帶的為待檢樣品陰性；兩者均無條帶或待檢樣品出現條帶而陽性 對照溶液無條帶的需重新檢測並判定。
[0027] 所述樣品取自豬的血液、唾液、肺臟、肝臟、腎臟、淋巴結、扁桃體、腦組織、糞便、精 液、尿液、豬場內外環境表面拭子、空氣、PRRSV疫苗以及與PRRSV相關的樣品。
[0028] 所述PCR擴增反應程序如下：95°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，53°C退火1分 鍾，72 °C延伸90秒，循環次數為38次，72 °C再延伸10分鐘。
[0029] 本發明設計的試劑盒及方法不僅特異、準確、靈敏，且具有簡便、快速的特點，一次 可鑑別三種不同的豬繁殖與呼吸症候群病毒類型，並解決了以往方法可能存在的漏檢問 題。人工汙染試驗檢測結果表明，該系統亦適合於組織樣品中PRRSV的直接檢測，具有快 速、特異和簡便的特點。本發明還涉及針對NSP2的基因的引物設計、PCR反應條件以及應 用此試劑盒進行組織樣品的檢測方法。
[0030] 本發明建立的PCR方法可同時擴增出NSP2基因上種豬繁殖與呼吸症候群病毒的 三種類型（經典毒株、高致病性毒株、疫苗毒株），但對其它4種豬常見病毒均未擴增出任何 條帶，表明該檢測系統具有很強的特異性。測序同源性均在98. 67%-100%，進一步反應了 該系統具有很好的準確性及特異性。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031] 圖1為質控樣品擴增條帶。
[0032] 具體實施方法
[0033] 下面結合實施例對本發明作進一步的描述。
[0034] 1、材料與方法
[0035] I. 1陽性對照選取豬繁殖與呼吸症候群的三種活疫苗：豬繁殖與呼吸症候群活 疫苗CH-IR株購自上海海利生物藥品有限公司；高致病性豬繁殖與呼吸症候群活疫苗 JXAl-R株購自廣東大華農動物保健品股份有限公司；高致病性豬繁殖與呼吸症候群活疫 苗TJM-F92株購自新疆天康畜牧生物技術股份有限公司。陰性對照使用豬圓環病毒2型滅 活疫苗SH株購自普萊柯生物工程股份有限公司；豬偽狂犬病活疫苗Bartha-K61株購自雲 南生物製藥有限公司；豬瘟活疫苗（細胞源）購自洛陽普萊柯生物工程股份有限公司；豬 乙型腦炎活疫苗SA14-14-2株購自中牧實業股份有限公司成都藥械廠。空白對照使用雙蒸 水。
[0036] I. 2提取待測樣品病毒總RNA
[0037] 1. 2. 1取已處理好的樣品、陰性對照和陽性對照各200ul，分別加入RNA提取液 250ul，充分顛倒混勻，56°C水浴10?15min。
[0038] 1. 2. 2將液體吸入已套好收集管的吸附柱中，8000rpm離心lmin。
[0039] 1. 2. 3棄去收集管中液體，加入600ul漂洗液1，12000rpm離心30s。
[0040] 1. 2. 4棄去收集管中液體，加入500ul漂洗液2,12000rpm離心30s。
[0041] 1. 2. 5棄去收集管中液體，12000rpm空柱離心2min，以除去殘留的洗脫液。
[0042] 1.2. 6將吸附柱移入新的1.5ml離心管中，向柱中央加入CldH2O 20?50ul，室溫 靜置3?5min，12000rpm離心lmin，離心管中液體即為模板RNA。
[0043] 1. 3病毒RNA逆轉錄
[0044] 1. 3. 1在PCR反應管中依次加入Iul下遊引物、17ulRNA模板、7ul逆轉錄反應液， 震蕩混勻，短暫離心。
[0045] 1. 3. 2按以下反應條件在PCR儀上進行逆轉錄：42°C逆轉錄45min?60min，即為 cDNA。
[0046] 1.4PCR 擴增
[0047] 1.4. 1在PCR反應管中依次加入Iii L上遊引物、Iii L下遊引物、2 ii L待檢樣品、 6 ii LPCR擴增反應液及10 ii L ddH20,震蕩混勻，離心數秒。
[0048] 1. 4. 2將1. 4. 1按以下反應條件在PCR儀上進行擴增：95°C預變性5分鐘，94°C變 性30秒，53 °C退火1分鐘，72 °C延伸90秒，循環次數為38次，72 °C再延伸10分鐘。
[0049] 1. 4. 3將1. 4. 2反應後的產物使用1. 5%瓊脂糖凝膠，在IXTAE緩衝液中電泳，用 凝膠成像系統分析。
[0050] I. 4. 4PCR產物的測序及分析按1. 4所述步驟加樣後進行PCR檢測，並將PCR產物 割膠回收測序。
[0051] 1. 4. 5特異性試驗使用I. 1中的空白對照，用建立的PCR方法進行擴增。
[0052] 2、結果
[0053] 2. 1通過優化的鑑別引物，豬繁殖與呼吸障礙症候群活疫苗CH-IR株出現1879bp 條帶；高致病性豬繁殖與呼吸症候群活疫苗JXAl-R株出現1789bp條帶；高致病性豬繁殖 與呼吸症候群活疫苗TJM-F92株出現1429bp條帶。質控樣品擴增條帶如圖1所示，圖中 所示，A為PRRSV經典毒株陽性對照品；B為PRRSV高致病性毒株陽性對照品；C為PRRSV 疫苗毒株TJM-F92株陽性對照品；D為陰性對照品；Mark為對比參照條帶，從上到下依次為 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
[0054] 2. 2PCR產物的測序鑑定：PCR擴增產物通過TA克隆、測序後在NCBI上進行 BLAST對比，結果顯示，與NSP2已知經典毒株序列（CH-1R、VR2332等）比對同源性為 98. 67%-100% ;與已知高致病性毒株序列（JXAUHuN等）的同源性為99. 62%-100% ;與 已知高致病性疫苗毒株序列（TJ)的同源性為99. 52%。表明該PCR反應系統具有很好的準 確性。
[0055] 2. 3特異性試驗：利用試劑盒分別對豬圓環病毒2型滅活疫苗SH株、豬偽狂犬病 活疫苗Bartha-K61株、豬瘟活疫苗（細胞源）、豬乙型腦炎活疫苗SA14-14-2株為待檢樣品 檢測，結果顯示未見任何條帶，表明該PCR反應擴增NSP2基因片段具有很好的特異性。
[0056] 3、討論：研究表明，針對NSP2基因設計的鑑別引物可以鑑定到豬繁殖與呼吸綜合 徵毒株的三種類型，因此，針對上述基因設計的PCR引物，不僅可用於豬繁殖與呼吸症候群 病毒的檢測，又可以進行不同病毒類型之間的檢測。
[0057] 本試驗建立的PCR方法可同時擴增出NSP2基因上種豬繁殖與呼吸症候群病毒的 三種類型（經典型毒株、高致病性毒株、高致病性疫苗毒株），但對其它4種豬常見病毒均未 擴增出任何條帶，表明該檢測系統具有很強的特異性。測序同源性均在98. 67%-100%，進 一步反應了該系統具有很好的準確性及特異性。
[0058] 本發明設計的PCR試劑盒方法不僅特異、準確、靈敏，且具有簡便、快速的特點，一 次可鑑別三種不同的豬繁殖與呼吸症候群病毒類型，並解決了以往方法可能存在的漏檢問 題。人工汙染試驗檢測結果表明，該系統亦適合於組織樣品中PRRSV的直接檢測，具有快 速、特異和簡便的特點。本發明還涉及針對NSP2的基因的引物設計、PCR反應條件以及應 用此試劑盒進行組織樣品的檢測方法。
[0059] 本發明中的試劑盒組成具體如下：
[0060] A管，含有2mL溶液，為豬繁殖與呼吸症候群經典毒株陽性對照品，保存於-20°c。 [0061] B管，含有2mL溶液，為豬繁殖與呼吸症候群高致病性毒株陽性對照品，保存 於-20。。。
[0062] C管，含有2mL溶液，為豬繁殖與呼吸症候群疫苗毒株TJM-F92株陽性對照品，保存 於-20。。。
[0063] D管，含有2ml溶液，為陰性對照品，保存於_20°C。
[0064] E管、F管分別為上遊引物和下遊引物，保存於_20°C。
[0065] G管，為RNA提取液，4°C保存。
[0066] H管，為漂洗液1，室溫保存。
[0067] I管，為漂洗液2,室溫保存。
[0068] J管,為逆轉錄反應液,保存於_20°C。
[0069] K管，含有PCR擴增反應液，保存於_20°C。
[0070] L 管，含有 ddH20,保存於-20°C。
[0071] 加樣及檢測步驟說明：
[0072] 1提取待測樣品病毒總RNA
[0073] I. 1取已處理好的樣品、A、B、C、D各200ul，分別加入G管液體250ul，充分顛倒混 勻，56°C水浴 10 ?15min。
[0074] 1. 2將液體吸入已套好收集管的吸附柱中，8000rpm離心lmin。
[0075] 1.3棄去收集管中液體，加入600ul H管液體，12000rpm離心30s。
[0076] 1. 4棄去收集管中液體，加入500ul I管液體，12000rpm離心30s。
[0077] 1. 5棄去收集管中液體，12000rpm空柱離心3min，以除去殘留的洗脫液。
[0078] 1. 6將吸附柱移入新的I. 5ml離心管中，向柱中央加入L管液體20?50ul，室溫 靜置3?5min，12000rpm離心lmin，離心管中液體即為模板RNA。
[0079] 2病毒RNA逆轉錄
[0080] 2. 1在PCR反應管中依次加入Iul F管液體、17ulRNA模板、7ulJ管液體，震蕩混 勻，短暫離心。
[0081] 2. 2按以下反應條件在PCR儀上進行逆轉錄：42°C逆轉錄45min?60min，即為 cDNA。
[0082] 3PCR 擴增
[0083] 3. 1在PCR反應管中依次加入IiiL E管液體、IiiL F管液體、2iiL待檢樣品、6iiL K管液體及10 U L L管液體，震蕩混勻，簡短離心。
[0084] 3. 2將3. 1按以下反應條件在PCR儀上進行擴增：95°C預變性5分鐘，94°C變性30 秒，53°C退火1分鐘，72°C延伸90秒，循環次數為38次，72°C延伸10分鐘。
[0085] 3. 3將3. 2反應後的產物使用1. 5%瓊脂糖凝膠，在IXTAE緩衝液中電泳，用凝膠 成像系統分析。
[0086] 3. 4PCR產物的測序及分析按上述步驟進行PCR檢測，並將PCR產物割膠回收測序。
[0087]
【權利要求】
1. 一種用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其特徵在於：包括分別裝有RNA 提取液、漂洗液、逆轉錄反應液、PCR擴增反應液、特異性鑑別引物、陰性對照品、陽性對照品 並加蓋密封的多個試劑瓶或試劑管，以及分隔併集中包裝這些試劑瓶或試劑管的包裝盒； 所述特異性鑑別引物包括上遊引物和下遊引物，其核苷酸序列如下： 上遊引物：5 ' -AACRCCCAGGCGACTTCAG-3 ' ； 下遊引物：5' -TCTCATTAGGAGCAGITCTTACAC-3'。
2. 根據權利要求1所述的用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其特徵在於， 所述豬繁殖與呼吸症候群病毒包括PRRSV經典毒株、PRRSV高致病性毒株，以及PRRSV疫苗 毒株TJM-F92株。
3. 根據權利要求1所述的用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其特徵在於， 所述RNA提取液的配方包括： Carrier RNA，4?10ul ;蛋白酶K，10?20ul ;十二燒基硫酸鈉，1%?4%; Tris_C1150 ?250mmol/L ;EDTA,0? 5 ?lmmol/L ;pH7 ?8。
4. 根據權利要求1所述的用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其特徵在於， 所述漂洗液包括漂洗液1和漂洗液2 ; 漂洗液1的配方為：鹽酸胍，4?6111〇1/1^;無水乙醇，50(%?70(% ;蛋白酶1(，80?1001^/ ml ； 漂洗液2為：60?80 %無水乙醇。
5. 根據權利要求1所述的用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其特徵在於， 所述逆轉錄反應液的配方包括： 5XRT Buffer ;2. 5mmol dNTP ;RNA 酶抑制劑；逆轉錄酶。
6. 根據權利要求1所述的用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其特徵在於， 所述PCR擴增反應液的配方包括： lOmmol dNTP Mix ；10XTaq Buffer ；5U/ul Taq DNA Polymerase〇
7. 根據權利要求1所述的用於鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的試劑盒，其特徵在於， 所述陽性對照品包括PRRSV經典毒株陽性對照品、PRRSV高致病性毒株陽性對照品和 PRRSV疫苗毒株TJM-F92株陽性對照品；三個陽性對照品分別含有三種特定目的基因序列 的質粒；其中PRRSV經典毒株陽性對照品所含質粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 3所示， PRRSV高致病性毒株陽性對照品所含質粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 4所示，PRRSV疫苗 毒株TJM-F92株陽性對照品所含質粒的目的基因序列如SEQ ID NO. 5所示。
8. 基於權利要求1所述試劑盒的一種鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的方法，其特徵在 於，包括以下步驟： (1) 、提取待測樣品病毒總RNA; (2) 、樣品病毒總RNA經反轉錄獲得其cDNA ; (3) 、以樣品cDNA為模板，加入特異性鑑別引物和PCR擴增反應液，進行PCR擴增反應， 擴增產物進行凝膠電泳，若電泳結果出現1879bp特異性條帶，則表示樣品中含有PRRSV經 典毒株；若樣品中出現1789bp條帶，則表示樣品中含有PRRSV高致病性毒株；若電泳結果 出現1429bp條帶，則表示樣品中含有PRRSV疫苗毒株TJM-F92株；若陽性對照溶液出現條 帶而待檢樣品無條帶的為待檢樣品陰性；兩者均無條帶或待檢樣品出現條帶而陽性對照溶 液無條帶的需重新檢測並判定。
9. 根據權利要求8所述的鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的方法，其特徵在於，所述樣 品取自豬的血液、唾液、肺臟、肝臟、腎臟、淋巴結、扁桃體、腦組織、糞便、精液、尿液、豬場內 外環境表面拭子、空氣、PRRSV疫苗以及與PRRSV相關的樣品。
10. 根據權利要求8所述的鑑別豬繁殖與呼吸症候群病毒的方法，其特徵在於，所述 PCR擴增反應程序如下：95°C預變性5分鐘，94°C變性30秒，53°C退火1分鐘，72°C延伸90 秒，循環次數為38次，72°C再延伸10分鐘。
【文檔編號】C12Q1/70GK104450970SQ201410821987
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月22日 優先權日:2014年12月22日
【發明者】馬晶晶, 張瑜, 賴 志, 吳碧清, 高俊鋒, 韓相敏 申請人:上海創宏生物科技有限公司