Talen在製備靶向幹預B肝病毒的藥物中的應用的製作方法

2023-05-24 16:57:11 1

Talen在製備靶向幹預B肝病毒的藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬醫藥領域，涉及TALEN技術在靶向B肝病毒基因組即cccDNA及治療慢性B肝病毒感染中的應用。本發明提供了轉錄激活因子樣效應因子核酸酶在製備靶向幹預B肝病毒的藥物中的應用，其中靶向幹預B肝病毒的藥物中的活性成分為針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶。本發明還提供了一種針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶，以及利用其抑制體外培養細胞中的B肝病毒的方法。本發明採用TALEN技術在細胞系中可通過特異性靶向B肝病毒cccDNA顯著抑制B肝病毒基因組的轉錄活性並導致B肝病毒基因組DNA含量的下降。
【專利說明】TALEN在製備靶向幹預B肝病毒的藥物中的應用

【技術領域】
[0001]本發明屬醫藥領域，涉及TALEN技術在靶向B肝病毒基因組及治療慢性B肝病毒感染中的應用。

【背景技術】
[0002]B肝病毒(HBV)是一種肝嗜性小DNA病毒，其引起的慢性肝炎、肝纖維化和肝癌嚴重危害著人類的健康。全球約3.5億人慢性感染有B肝，其中亞洲佔約3/4。
[0003]B肝病毒病毒核衣殼內的B肝病毒基因組是含有不完全雙鏈的DNA (rcDNA),在病毒感染人肝細胞後，隨著核衣殼脫去，rcDNA會入核並經由修補機制形成共價閉合環狀的DNA (cccDNA)。cccDNA可經由宿主RNA聚合酶II轉錄出包括B肝病毒病毒前基因組RNA(PgRNA)在內的多條長短不一的B肝病毒RNA，病毒蛋白即以此些RNA作為模板進行翻譯，其中PgRNA還可以作為模板通過逆轉錄生成rcDNA，進而包裝入病毒核衣殼蛋白而進入新的一輪複製周期。此外，研究表明cccDNA可以結合宿主組蛋白以形成微小染色體結構，該結構非常穩定以致cccDNA的最終消失可能要伴隨其所在肝細胞的死亡。正是由於cccDNA在B肝病毒複製過程中作為DNA-RNA-DNA模板以及cccDNA很難徹底於肝內清除的特性，cccDNA在B肝病毒感染慢性化、再發及治療停止耐藥中扮演重要角色。
[0004]當前用於治療慢性B肝病毒感染的藥物有幹擾素α (IFN-α )或阻斷病毒RNA或DNA合成的核苷類似物，但是IFN- α治療應答率僅30%而核苷類似物的長期使用易導致B肝病毒耐藥，同時這兩種藥物但都不直接靶向cccDNA，這也是目前的治療手段應用於許多慢性B肝病毒感染患者中效果不佳且易引起復發的原因之一。發明一種特異性靶向cccDNA的治療方法對於B肝病毒治療乃至根治B肝病毒慢性感染有重要意義。


【發明內容】

[0005]本發明的一個目的是提供轉錄激活因子樣效應因子(Transcript1nactivator-1ikeeffectors, TALE)核酸酶在製備祀向幹預B肝病毒的藥物中的應用。
[0006]本發明的另一個目的是提供一種針對B肝病毒的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶。
[0007]本發明的再一個目的是提供一種利用轉錄激活因子樣效應因子核酸酶抑制體外培養細胞中B肝病毒的方法。
[0008]為了解決上述技術問題，本發明首先設計了兩對針對B肝病毒基因組的特異性TALEN,在設計過程除考慮TALEN識別長度(12_19bp)及左右臂間隔長度(14_19bp)外還額外考慮了以下兩點以保證TALEN對B肝病毒的有效性:
[0009]1、根據NCBI公布的已有B肝病毒A型、B型、C型序列(其中我國主要是B型和C型)，下載並比對了各型別代表株的序列，確定了各型別B肝病毒基因組的保守序列區段，進而針對這些區段設計TALEN，以利於設計出的TALEN可以廣譜靶向各型別的B肝病毒。
[0010]2、設計TLANE時避開了根據文獻報導可能結合有宿主組蛋白的cccDNA區段，以利於TALEN結合至cccDNA。
[0011]本發明最終設計並構建完成的TALEN分別針對在cccDNA序列中轉錄pgRNA相關的片段的頭尾，其中頭部設計在與Core、Po 1、HBeAg和pgRNA轉錄密切相關的區段；尾部設計在HBx啟動子區域，其亦為B肝病毒其他各條病毒RNA轉錄所共有的區域。
[0012]利用細胞和小鼠模型，經過無數次試驗摸索以及反覆優化條件，本發明最終獲得了一種TALEN,其不僅可以抑制B肝病毒抗原標誌物HBsAg和HBeAg的產生,並且可以部分降低cccDNA的含量及可以使cccDNA特定位點發生突變進而導致轉錄失活；此外,在合適時間加入IFN- α ( α幹擾素)等B肝治療藥物可以進一步降低pgRNA轉錄水平和cccDNA的含量，顯示聯用TALEN和其他抗病毒及免疫調節藥物在治療乃至根治B肝病毒感染中的可能性。
[0013]本發明提供了一種轉錄激活因子樣效應因子核酸酶在製備抑制B肝病毒藥物中的應用。
[0014]所述的抑制B肝病毒藥物的活性成分是針對B肝病毒的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶。
[0015]本發明提供了一種抑制體外培養細胞中B肝病毒的方法，將針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶轉入含有B肝病毒的體外培養細胞。
[0016]所述的體外培養細胞源自肝細胞。
[0017]所述的體外培養細胞是肝癌細胞。
[0018]所述的抑制體外培養細胞中B肝病毒是指抑制B肝病毒的病毒蛋白轉錄和cccDNA 活性。
[0019]本發明提供的種抑制體外培養細胞中B肝病毒的方法，包括如下步驟:
[0020](I)設計並預處理針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶；
[0021](2)將步驟(I)所得的針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶轉染入體外培養細胞。
[0022]針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶轉染入細胞後繼續培養1-4天，能夠達到較好的抑制B肝病毒的效果。
[0023]較好的，針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶轉染入細胞後，繼續培養1-2天，然後加入IFN-α，從而達到更好的抑制B肝病毒的效果。
[0024]另一方面，本發明提供了一種轉錄激活因子樣效應因子核酸酶，所述的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶特異性針對B肝病毒基因組。
[0025]所述的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶包括針對在cccDNA序列中轉錄pgRNA片段的頭部和尾部；其中頭部設計在與Core、Po 1、HBeAg和pgRNA的轉錄密切相關的區段，尾部設計在HBx啟動子區域。
[0026]另一方面，本發明提供了所述的方法的應用，即利用B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶加入收到B肝病毒感染的細胞中，抑制B肝病毒HbeAg、HbsAg,HBcAg病毒蛋白的產生，抑制cccDNA轉錄活性，或者抑制pgRNA、cccDNA的含量。
[0027]本發明提供了 TALEN在靶向B肝病毒cccDNA及治療慢性B肝中的作用，並為TALEN最終應用於B肝慢性感染的治療展示了非常好的前景並提供了實驗理論基礎。
[0028]本發明經由細胞和動物模型水平的實驗證實，針對B肝病毒cccDNA所設計的TALEN對B肝病毒編碼蛋白的產生、基因組的轉錄活性、及cccDNA含量均有顯著抑制作用；同時，TALEN與IFN等藥物聯用具有更強的抗病毒效果。本發明將TALEN技術用於靶向B肝病毒cccDNA，為TALEN最終應用於B肝慢性感染的治療及根治展示了非常好的前景並提供了實驗理論基礎，同時為優化治療B肝病毒慢性感染提供了新的思路。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029]圖1.B肝病毒的cccDNA結構以及TALEN設計。
[0030]圖2.TALEN 對 HBsAg，HBeAg, pgRNA 和 cccDNA 含量等的影響。
[0031]圖3.小鼠高壓尾靜脈注射模型驗證TALEN抗B肝病毒作用。
[0032]圖4.TALEN和IFN聯用顯示出更強的抑制B肝病毒效應。

【具體實施方式】
[0033]本發明設計了特異性靶向B肝病毒cccDNA的TALEN。該發明為人們靶向cccDNA並進而調控cccDNA轉錄活性提供了實用的手段，更為有效治療甚至根治慢性B肝病毒感染提供了新的策略。
[0034]有報導顯示，鋅指蛋白(ZNPs)可以直接結合鴨B肝病毒的cccDNA，而針對B肝病毒的鋅指蛋白偶聯的核酸酶(ZFNs)可以顯著降低pgRNA的水平，為人們控制B肝病毒感染提供了新的思路。轉錄激活因子樣效應因子(Transcript1nactivator-likeeffectors,TALE)技術是一種薪新的分子生物學工具。科學家發現,來自植物細菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸結合域的胺基酸序列與其靶位點的核酸序列有恆定的對應關係。利用TAL的序列模塊，可組裝成特異結合任意DNA序列的模塊化蛋白，從而達到靶向操作內源性基因的目的。基於TALE技術的TALE核酸酶(TALEnuclease，TALEN)技術可構建針對任意特定核酸靶序列的重組核酸酶，在特異的位點打斷目標基因DNA，進而調控該位點所在基因的轉錄和功能。TALEN技術克服了常規的ZFN方法不能識別任意目標基因序列，以及識別序列經常受上下遊序列影響等問題，而具有ZFN相等或更好的活性，且細胞毒性低、脫靶率低，是一種簡單便捷的基因靶向技術。
[0035]本發明的TALEN技術在幹預B肝病毒感染中，是一種全新的靶向B肝病毒基因組DNA (即cccDNA)及治療和根治慢性B肝病毒感染的策略和手段。
[0036]TALEN技術可以應用於革巴向B肝病毒cccDNA。
[0037]TALEN技術可以應用於抑制B肝病毒感染。
[0038]TALEN技術可以和其他抗病毒及免疫調節藥物聯用用於治療B肝病毒感染。
[0039]TALEN技術對B肝病毒HBeAg，HBsAg, HBcAg等病毒蛋白的產生，cccDNA轉錄活性，及pgRNA和cccDNA含量的抑制作用。
[0040]為便於理解，以下將通過具體的實施例和附圖對本發明的TALEN設計及應用進行詳細地描述。需要特別指出的是，該附圖僅是為了說明，顯然本領域的普通技術人員可根據本文說明，在本發明的範圍內對本發明做出修改，這些修改也納入本發明的範圍內。
[0041 ] 實施例1、HBV複製型細胞系模型實施方式
[0042]將具有靶向B肝病毒cccDNA功能的TALEN轉染入B肝病毒複製的細胞，B肝病毒的病毒蛋白轉錄和cccDNA活性均受顯著抑制。
[0043](I)肝癌細胞系Huh7的培養:採用DMEM培養液(Gibco公司，加10%胎牛血清、100U/ml青黴素、100mg/ml鏈黴素和400mg/mlG418)在5%C02飽和水蒸氣環境下37°C恆溫培養；
[0044](2)採用羅氏公司生產的轉染試劑將B肝病毒複製型質粒:體外酶切線性化了的B肝病毒基因組質粒(A基因型)，PB肝病毒1.3 (B基因型)，PB肝病毒1.3 (C基因型)或pCMV-B肝病毒(D基因型)等導入Huh7細胞；
[0045](3)將編碼TALEN (特異靶向cccDNA)的質粒或空白對照質粒同樣以轉染試劑導入細胞；
[0046](4)細胞培養72小時後，確認轉染效率平衡的基礎上，收集細胞上清檢測病毒抗原標誌物HBeAg，HBsAg ;固定或裂解細胞，檢測胞漿中HBcAg，及pgRNA和cccDNA等的含量；
[0047](5)結果顯示TALEN處理組相較空白處理組，B肝病毒病毒蛋白和pgRNA及cccDNA水平全面下調，其中HBeAg下調可達70%，pgRNA和cccDNA下調50%左右，另表達有TALENs的細胞中鮮見HBcAg表達。
[0048](6)若在轉染TALEN後36小時加入1000IU/mlIFN-α，在72小時時所檢測得到的抑制效果比單獨使用TALEN或IFN- α進一步增強近一倍，提示TALEN和IFN等其他抗病毒藥物具有協同作用。
[0049]上述實例說明，本發明採用TALEN技術在細胞系中可通過特異性靶向B肝病毒cccDNA顯著抑制B肝病毒基因組的轉錄活性並導致B肝病毒基因組DNA含量的下降。
[0050]實施例2、小鼠模型實施方式
[0051](1)7周齡C3H/HeN雄性小鼠飼養於SPF環境中；
[0052](2)高壓尾靜脈注射以PBS稀釋的B肝病毒線性化質粒和TALEN或對照質粒；
[0053](3)注射後3天取血檢測血清中HBsAg和HBeAg含量，注射後6天老鼠取材，其中血清用於檢測HBsAg，HBeAg和B肝病毒DNA，肝臟用於檢測肝內pgRNA和cccDNA ；
[0054](4)結果顯示，TALEN組血清和肝臟中病毒蛋白和核酸含量均顯著低於對照組。其中HBsAg和HBeAg含量下降約50%，血清病毒DNA及肝內pgRNA和cccDNA下降約60_80%。
[0055]上述實例說明本發明採用TALEN技術在小鼠體內通過特異性靶向B肝病毒cccDNA，對B肝病毒病毒蛋白的產生、基因組的轉錄活性、及B肝病毒基因組DNA含量均有顯著抑制作用。
【權利要求】
1.轉錄激活因子樣效應因子核酸酶在製備靶向幹預B肝病毒的藥物中的應用，其特徵在於，靶向幹預B肝病毒的藥物中的活性成分為針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的幹預B肝病毒是指抑制B肝病毒的病毒蛋白轉錄和⑶⑶嫩活性。
3.一種抑制體外培養細胞中B肝病毒的方法，其特徵在於，所述的方法是將針對B肝病毒的轉錄激活因子樣核酸酶加入體外培養細胞。
4.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的體外培養細胞源自肝細胞。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的體外培養細胞是肝癌細胞。
6.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，所述的方法包括如下步驟: (1)設計並預處理針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶； (2)將步驟(1)所得的針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶轉染入體外培養細胞。
7.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶轉染入細胞後繼續培養1-4天。
8.如權利要求6所述的方法，其特徵在於，針對B肝病毒基因組的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶轉染入細胞後繼續培養1-2天，然後加入11^-0。
9.一種轉錄激活因子樣效應因子核酸酶，其特徵在於，所述的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶特異性針對B肝病毒基因組。
10.如權利要求9所述的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶，其特徵在於，所述的轉錄激活因子樣效應因子核酸酶包括針對在⑶⑶嫩序列中轉錄？成嫩片段的頭部和尾部；其中頭部設計在與001*6、？01、耶6^和的轉錄密切相關的區段，尾部設計在啟動子區域。
【文檔編號】A61P31/20GK104367994SQ201310354673
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月14日 優先權日:2013年8月14日
【發明者】袁正宏, 陳捷亮 申請人:復旦大學