一種直接檢測il-6抗原的電化學免疫傳感器及應用的製作方法

2023-05-24 09:00:46 3

專利名稱：一種直接檢測il-6抗原的電化學免疫傳感器及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種免疫傳感器，特別涉及一種直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器及製備方法和檢測應用。
背景技術：
白細胞介素6(IL_6)可由淋巴細胞或非淋巴細胞產生，是一種多功能細胞因子，不僅在機體免疫應答、急相反應和造血控制中起重要作用，而且其失調產生與多種臨場疾病和炎症反應密切相關，如牛皮癬，風溼性關節炎，心血管疾病和炎性腸病。此外，其過高表達與幾種典型癌症相關，如頭頸部鱗癌(HNSCC)、結腸癌、胃腸癌。然而白細胞介素6在正常人體內濃度(6pg/ml)非常低，因此，對低濃度IL-6的檢測是該領域的一大挑戰。
生物醫學上關於白細胞介素6的常規臨床免疫分析方法主要有放射免疫分析法、酶聯免疫分析法、螢光免疫分析法、化學發光免疫分析法等。其中，放射免疫分析法靈敏度高，幹擾少，應用範圍寬，但實際壽命有限，並且其放射性標記物對人體有害；酶聯免疫分析法、螢光和化學發光免疫分析法在很大程度上促進了臨床免疫分析手段的自動化、智能化和網絡化，但這些方法需要價格昂貴的專用儀器設備，操作複雜，成本高，難以推廣使用。因此研發一種廉價、簡便且適用於現場直接定量的免疫測定技術極為重要。免疫傳感器檢測技術是將免疫檢測技術與傳感檢測技術相結合而形成的一類新型檢測技術，是生物傳感器領域發展最迅速的技術之一，具有靈敏度高、特異性強、檢測快速、使用簡便、低成本等許多有點。傳統的免疫傳感器測定技術分為兩類競爭測定和夾層測定。在競爭測定中，試樣中的抗原與抗原-探針複合物(通常稱作報導複合物)進行混合，然後，混合物中的抗原通過競爭與抗體結合。探針可以是放射性同位素、酶、螢光團。在夾層免疫測定技術中，試樣中的抗原與抗體結合，然後第二抗體-探針複合物與抗原結合。但上述方法需要對目標抗原進行處理，操作過程複雜並且耗費抗體。本發明通過在現場生長的碳納米管上電沉積金納米粒子作為工作電極，再在金納米粒子上自組裝上巰基乙酸分子層來固定anti-IL-6抗體，發展成一種高靈敏度、高特異性免疫傳感器，可以快速直接檢測液體試樣中目標抗原的濃度。碳納米管(CNTs)是一種具有一維納米管狀結構的新型納米材料，它獨特的電子特性和表面結構，能很好地促進生物電活性分子的電子傳遞，並易於固定生物大分子並能保持其活性。納米金顆粒具有比表面積大、生物親和性高等優點，並具有導電作用和加快蛋白質與電極之間的直接電子轉移，適合於構建無需電子媒介物質的直接電化學生物傳感器。目前，碳納米管和納米金作為電活性材料及載體已被廣泛應用於電化學和生物傳感器中，愛爾蘭國立大學的Rusling教授的研究小組(Anal. Chem. 2010，82，3118)報導在高表面積、高傳導性的垂直碳納米管上固定anti-IL-6捕獲抗體，捕獲抗體附著在碳納米管末端，再與樣本中的IL-6目標抗原結合，接著一個被酶標記的第二抗體耦合物再與傳感器上的目標抗原結合，通過電化學方法檢測酶標記物的信號。另外，山東省氟化學和化工化學重點實驗室的魏琴教授課題組(Biosens. Bioelectron. 2011, 26, 3714)利用納米金大的比表面積和好的生物相容性等優點，在納米金上固定生物分子，通過對鐵氰化鉀的電子轉移響應電流信號來監控。但鮮有在現場生長的碳納米管上直接電沉積納米金粒子構建電化學免疫傳感器。

發明內容
本發明目的是提供一種簡單、廉價、高靈敏度且可以現場直接檢測的電化學免疫傳感器，提供所述IL-6免疫電化學傳感器的製備方法以及檢測應用，本發明電化學傳感器以單壁碳納米管為基底，將金納米粒子沉積於單壁碳納米管上構成單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極，雜化電極用巰基乙酸修飾，再在巰基乙酸上組裝IL-6捕獲抗體。本發明採用的技術方案是一種直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器，所述傳感器按下述方法製備(I)單壁碳納米管以矽片或石英片為基底，以Fe/Mo納米粒子為催化劑，以乙醇作碳源，以200ml/ min流速的氫氣作為載氣和保護氣，將碳源帶入，於石英管中1000°C下反應15min，獲得單壁碳納米管；所述Fe/Mo催化劑通過在辛基醚中熱分解Fe (CO)6和Mo (CO)6獲得(參見Chem. Mater. 2001，13，1008-1014);所述Fe/Mo納米粒子中Fe和Mo物質的量之比為5 I ；
(2)單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極將單壁碳納米管用銅絲連接作為工作電極，以鉬作為對電極，以摩爾濃度O. I IOmMHAuCl4水溶液(優選ImM的HAuCl4水溶液)為電解液，在電壓為-O. IV -O. 5V下進行電化學沉積5 50s，獲得單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極；(3)單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極的修飾將單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極浸泡在I IOmM (優選5mM)的SHCH2C00H水溶液中，室溫下浸泡3 IOh (優選5h)，取出，用水清洗，得清洗後的電極置於EDC/NHS混合水溶液中，室溫下浸泡10 30min(優選IOmin)，取出用水清洗後，獲得修飾後的單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極；所述EDC/NHS混合水溶液為I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺與N-羥基琥珀醯亞胺的混合水溶液；(4)電化學免疫傳感器將步驟(3)獲得的修飾後的單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極浸泡在10 100 μ g/ml (優選10 μ g/ml)的IL-6捕獲抗體的PBS緩衝液(pH =7. 2)中，室溫(25°C )下浸泡2 8h (優選5h)，取出，用Tween-20水溶液和PBS緩衝液交替清洗，獲得結合抗體的雜化電極，然後再將結合抗體的雜化電極浸泡在質量濃度I 5%(優選2 % )牛血清蛋白的PBS緩衝液(pH = 7. 2)中，室溫下浸泡O. 5 2h (優選Ih)進行封閉，取出，用Tween-20水溶液和PBS緩衝液交替清洗，風乾，獲得所述的電化學免疫傳感器。步驟(I)所述方法優選為將矽基片浸入Fe/Mo納米粒子的庚烷溶液(Fe/Mo納米粒子的量以Fe物質的量計，5mmol/L)，IOs後取出，晾乾，轉移至石英管中，然後用加熱爐將石英管升溫到1000°C，以乙醇作碳源，以200ml/min流速的氫氣作為碳源的載氣和保護氣，將乙醇蒸汽(碳源)帶入石英管中，1000°C下反應15min，在矽基片上獲得單壁碳納米管(SffCNTs)。步驟(I)所述單壁碳納米管為水平平行排列的陣列結構，陣列密度控制在每100 μ M區間有4 50根單壁碳納米管，每根單壁碳納米管的長度位於100 μ m 2mm之間。步驟(2)所述單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極上的金納米粒子為多級結構的金枝晶，所述金納米粒子的負載量與沉積時間，電壓和含金溶液的濃度有關，本發明中金納米粒子的沉積條件需控制在所述的沉積時間、電壓、含金溶液的濃度範圍內。步驟(2)所述電壓優選為-O. 5V下進行電化學沉積8 15s，更優選10s。步驟(3)所述EDC/NHS混合水溶液為1_乙基_3_ (3_ 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺、N-羥基琥珀醯亞胺與水混合，使I-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺終濃度為400mM, N-羥基琥珀醯亞胺終濃度為lOOmM。 步驟(4)所述用Tween-20水溶液和PBS緩衝液交替清洗的方法為用質量濃度O. 01 O. 05% (優選 O. 05% ) Tween-20 水溶液和 ρΗ7· O 7. 3 (優選 ρΗ7· 2)的 PBS 緩衝液交替清洗5次，再用蒸餾水或超純水清洗5次。本發明提供一種所述的直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器在檢測IL-6抗原中的應用。進一步，所述的應用推薦按如下步驟進行1)將電化學免疫傳感器置於IL-6抗原溶液中，37°C下浸泡(免疫結合)O. 5 2h (優選O. 5h)，反應結束後，取出傳感器用質量濃度 O. 01 O. 05% (優選 O. 05% )的 Tween-20 水溶液和 ρΗ7· O 7. 3 (優選 ρΗ7· 2)的 PBS緩衝液交替清洗，獲得結合抗原的電化學傳感器；2)以步驟I)獲得的結合抗原的電化學傳感器作為工作電極，以鉬絲為對電極，以Ag/AgCl電極作參比電極，在鐵氰化鉀和氯化鉀混合溶液的電解液中，25°C下浸泡lh，採用電化學方法檢測電極表面上的電子傳遞電阻，根據電子傳遞電阻在結合IL-6抗原前後的變化，實現定量或定性檢測待檢測的IL-6抗原濃度。進一步，所述IL-6抗原溶液為I X 10_17 I X 10_13g/ml的IL-6抗原的PBS緩衝溶液，所述PBS緩衝溶液pH為7. O 7. 3 (優選ρΗ7· 2)。所述鐵氰化鉀和氯化鉀混合溶液為鐵氰化鉀、氯化鉀和水的混合溶液，所述混合溶液中鐵氰化鉀終濃度為5mM，氯化鉀終濃度為O. ImM。所述電化學方法檢測為在頻率為IOOmHz IOkHz，電壓為O. 17V的條件下進行電解反應，測試電極表面上的電子傳遞電阻。本發明所述直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器檢測IL-6抗原的應用中，根據電化學檢測方法檢測出待測溶液中抗原的電子傳遞阻抗，再根據電子傳遞阻抗與抗原濃度對數的標準曲線圖所得擬合計算公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C為抗原濃度)，計算出待測溶液中抗原的濃度。本發明中所述的SWCNTs為單壁碳納米管(優選單壁碳納米管的陣列密度為每
100μ M區間有15-30根，長度位於500 μ m Imm之間)，SWCNTs-Au為單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極，anti-IL-6為白細胞介素6捕獲抗體(優選來源於上海晶天生物科技有限公司)，IL-6抗原為白細胞介素6 (優選來源於上海晶天生物科技有限公司)，EDC為I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺，NHS為N-羥基琥珀醯亞胺，BSA為牛血清蛋白。本發明製備方法中的電解液可為常用的電解液，如5mM[Fe(CN)4]3_/4_ ;而所用的電化學檢測方法可為現有常規的電化學檢測方法，如電化學阻抗或脈衝伏安法，本發明優選電化學阻抗的方法，可定量檢測電極表面的電子傳遞電阻。本發明利用金與巰基乙酸之間穩定的Au-S鍵作用，巰基乙酸的羧基又與anti-IL-6抗體的氨基通過EDC/NHS的醯胺化反應形成穩定的醯胺鍵，這樣固定的anti-IL-6抗體既穩定不會因衝洗脫落，而且組裝時間短。製備好的anti-IL-6探針電極用BSA作為封閉劑，封閉電極表面的非特異性活性位點。再通過抗原與抗體的特異性免疫結合捕獲目標IL-6抗原。由於碳納米管具有較好的電容性、導電率和比表面積，結合金納米粒子的信號放大作用及較好的生物相容性，使得該傳感器在目標抗原濃度極低時也有明顯的信號。電子傳遞電阻的變化值與免疫結合IL-6抗原的濃度對數之間成良好的線性關係(圖4)，這表明了該傳感器成功實現對目標IL-6抗原的檢測，其檢測限可達到I X IO-1Vml，這無疑解決了對IL-6抗原在人體內低濃度檢測難題。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在本發明的電化學免疫傳感器具有製備過程簡便、無需標記或夾心處理、成本低廉、檢測靈敏度高等優點，可廣泛用於各種免疫分析和檢測，且本發明製備的電化學免疫傳感器對目標IL-6抗原的檢測限可達到I X 10 17g/ml。


圖I是本發明的電化學免疫傳感器的製備原理示意圖； 圖2是實施例I中SWCNTs-Au電極的掃描電子顯微鏡(SEM)圖，其中a為SWCNTs的SEM圖；b為在SWCNTs上沉積納米金後得到的SWCNTs-Au雜化電極的SEM圖；c為SWCNTs-Au雜化電極局部放大圖；d為SWCNTs上沉積納米金後得到的SffCNTs-Au雜化電極的能譜圖；圖3是本發明電化學傳感器檢測不同濃度白細胞介素6(IL_6)的電化學阻抗圖，曲線a為SWCNTs-Au在含5mM[Fe (CN)4] 3_/4_和O. IM KCl的溶液中的電化學阻抗線；曲線b為自組裝巰基乙酸並用EDC/NHS處理後的SWCNTs-Au電極在含5mM[Fe (CN) 4] 條和O. IM KCl的溶液中的阻抗線，曲線c為自組裝anti-IL-6抗體後的電極在含5mM[Fe (CN) 4] 3_/4_和O. IMKCl的溶液中的阻抗線，曲線d為用BSA封閉電極上非特異性吸附位點後的電化學阻抗線，曲線 e-i 分別為與含有 I X l(T17g/ml、I X l(T16g/ml、I X l(T15g/ml、I X l(T14g/ml、I X l(T13g/ml的IL-6抗原發生免疫反應結合後在含5mM[Fe(CN)4Z]3_/4_和O. IM KCl的溶液中的電化學阻抗線；圖4為電化學傳感器工作的模擬電路圖；圖5是採用本發明的電化學免疫傳感器分別與不同濃度(lX10_17g/ml、lX10_16g/ml、I X 10_15g/ml、I X 10_14g/ml、I X 10_13g/ml)的IL-6抗原發生免疫結合後，電子傳遞電阻的變化值與免疫結合的IL-6抗原濃度的對數之間的線性關係圖，即抗原濃度-阻抗值的工作曲線，根據工作曲線擬合出計算公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C]，這為今後檢測IL-6抗原提供依據。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於此實施例I(I) SffCNTs-Au雜化電極的製備Fe/Mo 納米粒子的製備參見 Chem. Mater. 2001，13，1008-1014，本發明所用 Fe/Mo納米粒子的Fe/Mo物質的量之比為5 I。如圖I所示採用化學氣相沉積(CVD)法，首先將I X Icm矽基片浸入Fe/Mo納米粒子的庚烷溶液(Fe/Mo納米粒子的量以Fe物質的量計，5mmol/L)，IOs後取出，晾乾，轉移至石英管(長80cm，外徑25mm，厚度I. 5mm)中，然後用加熱爐將石英管升溫到1000°C，以乙醇作碳源，以200ml/min流速的氫氣作為碳源的載氣和保護氣，將乙醇蒸汽(碳源)帶入石英管中，1000°C下反應15min，在矽基片上獲得單壁碳納米管(SWCNTs)，電鏡掃描圖見圖2中a所示，所述單壁碳納米管為水平平行排列的陣列結構，陣列密度控制在每100 μ M區間有10 25根單壁碳納米管，每根單壁碳納米管的長度位於500 μ m Imm之間。然後將SWCNTs用銅絲連接作為工作電極，以IOml (ImM)的HAuCl4水溶液為電解液，以Pt片作為對電極，採用電流時間曲線法，調節電壓為-O. 5V，用兩電極體系沉積IOs後，關閉電源，工作電極用超純水淋洗，用洗耳球吹乾工作電極表面，得到單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極(SWCNTs-Au雜化電極)，電鏡掃描見圖2中的b和c所示，能譜圖見圖2中的d所示。
(2)電化學傳感器的製備將(I)中得到的SWCNTs-Au雜化電極浸泡在Iml的5mM的巰基乙酸水溶液中，在室溫(25°C)條件下浸泡5h進行自組裝，浸泡結束後，取出用超純水衝洗3次，吹乾後，再置於EDC/NHS混合水溶液Iml (所述EDC/NHS混合溶液中，EDC終濃度為400mM，NHS終濃度為IOOmM)中室溫下浸泡lOmin，取出，用水清洗，獲得修飾後的雜化電極，再將修飾後的雜化電極浸泡在Iml的10 μ g/ml的anti-IL-6捕獲抗體的PBS緩衝溶液(pH = 7. 2)中，在室溫條件下浸泡5h進行自組裝，然後用質量濃度O. 05%的Tween-20水溶液和pH = 7. 2的PBS緩衝液交替清洗5次，洗去電極表面的非特異性吸附的anti-IL-6捕獲抗體，再用超純水衝洗5次吹乾後，獲得結合捕獲抗體的雜化電極。最後將上述結合捕獲抗體的雜化電極置於質量濃度2%的牛血清蛋白(BSA)的PBS緩衝溶液(pH = 7. 2)中，室溫下浸泡Ih封閉電極表面的活性位點，取出，用質量濃度O. 05%的Tween-20水溶液和pH = 7. 2的PBS緩衝液5次衝洗後，獲得所述電化學傳感器，放在4°C條件下備用。將上述獲得的SWCNTs-Au雜化電極(圖3中的a所示)、修飾後的雜化電極(圖3中的b所示)、結合捕獲抗體的雜化電極(圖3中的c所示)、電化學傳感器(圖3中的d所示)分別作為工作電極，以鉬絲為對電極，以Ag/AgCl電極作參比電極，然後在電化學工作站(Autolab PGSTAT302)中進行電化學阻抗實驗，接通電路，控制電壓O. 17V，頻率IOOmHz 10kHz，得電化學交流阻抗曲線如圖3所示，電路擬合後記錄各自的電子傳遞阻抗，工作模擬電路圖如圖4所示。圖3(a，b，c，d)結果所示，在SWCNTs-Au雜化電極上修飾EDC和NHS，以及捕獲抗體之後的阻抗值增大，證明了在SWCNTs-Au雜化電極上已成功修飾相應的物種。(3)IL_6抗原的檢測將上述所得的電化學傳感器浸泡在濃度為I X 10_17g/ml的IL-6抗原的PBS緩衝溶液(pH = 7. 2)中，在37°C下免疫結合30min，取出，用質量濃度O. 05%的Tween-20水溶液和pH = 7. 2的PBS緩衝液交替衝洗5次後，再用超純水衝洗，洗去非特異性免疫吸附在電極表面的IL-6抗原,獲得結合抗原的電化學傳感器。把上述製作好的結合抗原的電化學傳感器浸入鐵氰化鉀和氯化鉀混合溶液的電解液中，所述的鐵氰化鉀終濃度為5mM，氯化鉀終濃度為O. lmM，25°C下浸泡時間為lh。在電化學工作站(Autolab PGSTAT302)中測試，以結合抗原的電化學傳感器為工作電極，以鉬絲為對電極，以Ag/AgCl電極作參比電極，然後進行電化學阻抗實驗，接通電路，控制電壓O. 17V，頻率IOOmHz 10kHz，得電化學交流阻抗曲線，電路擬合後記錄傳感器的電子傳遞電阻(如圖3中曲線e)，與未結合IL-6抗原的工作電極所獲得的交流阻抗曲線明顯不同(如圖3中曲線d)，計算其傳遞電阻變化值為21. 9k Ω (以傳遞電阻變化值為縱坐標，以抗原濃度對數為橫坐標，製作標準曲線，如圖5所示)。實施例2將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為I X 10_16g/ml的IL_6抗原的PBS緩衝溶液(pH = 7. 2)中，在37°C下免疫結合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線f)，與未結合IL-6抗原的工作電極所獲得的交流阻抗曲線明顯不同(如圖3中曲線d)，計算其傳遞電阻變化值為25. 7k Ω (以傳遞電阻變化值為縱坐標，以抗原濃度對數為橫坐標，製作標準曲線，如圖5所示)。實施例3將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為I X 10_15g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線g)，與未結合IL-6抗原的工作電極所獲得的交流阻抗曲線明顯不同(如圖3中曲線d)，計算其傳遞電阻變化值為28. 9k Ω (以傳遞電阻變化值為縱坐標，以抗原濃度對數為橫坐標，製作標準曲線，如圖5所示)。實施例4將按實施例I方法獲得電化學傳感器放入濃度為I X 10_14g/ml的IL-6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線h)，與未結合IL-6抗原的工作電極所獲得的交流阻抗曲線明顯不同(如圖3中曲線d)，計算其傳遞電阻變化值為30. 4k Ω (以傳遞電阻變化值為縱坐標，以抗原濃度對數為橫坐標，製作標準曲線，如圖5所示)。
實施例5將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為I X 10_13g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線i)，與未結合IL-6抗原的工作電極所獲得的交流阻抗曲線明顯不同(如圖3中曲線d)，計算其傳遞電阻變化值為34. IkQ (以傳遞電阻變化值為縱坐標，以抗原濃度對數為橫坐標，製作標準曲線，如圖5所示)。實施例6將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為5X 10_17g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線j)，計算出傳遞電阻變化值為24. 64k Ω，根據上述實施例I 5獲得的線性關係公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C為抗原濃度)，可以計算出其濃度為4. 91 X 10_17g/ml，與實際濃度5X10_17g/ml接近，相對誤差為1.8%。實施例7將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為5X 10_16g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線k)，計算出傳遞電阻變化值為27. 6kQ,根據上述實施例I 5獲得的線性關係公式R = 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C為抗原濃度)，可以計算出其濃度為5. 08X 10_16g/ml，與實際濃度5X10_16g/ml接近，相對誤差為1.6%。實施例8將按實施例I方法獲得的電化學傳感器放入濃度為5X 10_14g/ml的IL_6抗原的PBS溶液中，在37°C下免疫結合30min，其他操作同實施例1，記錄電化學阻抗曲線(如圖3中曲線I)，計算出傳遞電阻變化值為33. 4kQ,根據上述實施例I 5獲得的線性關係公 式R= 72. 19734+2. 91603*lg[C] (C為抗原濃度)，可以計算出其濃度為4. 96X 10_16g/ml，與實際濃度5X10_14g/ml接近，相對誤差為O. 8%。
權利要求
1.一種直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器，其特徵在於所述傳感器按下述方法製備(I)單壁碳納米管以矽片或石英片為基底，以Fe/Mo納米粒子為催化劑，以乙醇作碳源，以氫氣作為碳源的載氣和保護氣，於石英管中1000°C下反應15min，獲得單壁碳納米管；所述Fe/Mo納米粒子中Fe和Mo物質的量之比為5 I ； (2)單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極將單壁碳納米管用銅絲連接作為工作電極，以鉬作為對電極，以摩爾濃度0. I IOmMHAuCl4水溶液為電解液，在電壓為-0. IV -0. 5V下進行電化學沉積5 50s，獲得單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極；(3)單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極的修飾將單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極浸泡在I IOmM的SHCH2C00H水溶液中，室溫下浸泡3 10h，取出，用水清洗，得清洗後的電極置於EDC/NHS混合水溶液中，室溫下浸泡10 30min，取出用水清洗後，獲得修飾後的單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極；所述EDC/NHS混合水溶液為I-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺與N-羥基琥珀醯亞胺的混合水溶液；(4)電化學免疫傳感器將步驟(3)獲得的修飾後的單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極浸泡在10 100 u g/ml的IL-6捕獲抗體的PBS緩衝液中，室溫下浸泡2 8h，取出，用Tween-20水溶液和PBS緩衝液交替清洗，獲得結合抗體的雜化電極，然後再將結合抗體的雜化電極浸泡在質量濃度I 5%牛血清蛋白的PBS緩衝液中，室溫下浸泡0. 5 2h進行封閉，取出，用Tween-20水溶液和PBS緩衝液交替清洗，風乾，獲得所述的電化學免疫傳感器。
2.如權利要求I所述的直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器，其特徵在於步驟(3)所述EDC/NHS混合水溶液為I-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺、N-羥基琥珀醯亞胺與水混合，使I-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺終濃度為400mM，N-羥基琥珀醯亞胺終濃度為lOOmM。
3.如權利要求I所述的直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器，其特徵在於步驟(4)所述用Tween-20水溶液和PBS緩衝液交替清洗的方法為用質量濃度0. 01 0. 05% Tween-20水溶液和PH7. 0 7. 3的PBS緩衝液交替清洗5次，再用蒸餾水清洗5次。
4.一種如權利要求I所述的直接檢測IL-6抗原的電化學免疫傳感器在檢測IL-6抗原中的應用。
5.如權利要求4所述的直接檢測IL-6抗原的電化學免疫傳感器在檢測IL-6抗原中的應用，其特徵在於所述的應用包括以下步驟1)將電化學免疫傳感器置於IL-6抗原溶液中，37°C下浸泡0. 5 2h，反應結束後，取出傳感器用質量濃度0. 01 0. 05%的Tween-20水溶液和PH7. 0 7. 3的PBS緩衝液交替清洗，獲得結合抗原的電化學傳感器；2)以步驟I)獲得的結合抗原的電化學傳感器作為工作電極，以鉬絲為對電極，以Ag/AgCl電極作參比電極，在鐵氰化鉀和氯化鉀混合溶液的電解液中，採用電化學方法檢測電極表面上的電子傳遞電阻。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述IL-6抗原溶液為IX 10_17 I X 10_13g/ml的IL-6抗原的PBS緩衝溶液，所述PBS緩衝溶液pH值為7. 0 7. 3。
7.如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述鐵氰化鉀和氯化鉀混合溶液為鐵氰化鉀、氯化鉀和水的混合溶液，所述混合溶液中鐵氰化鉀終濃度為5mM，氯化鉀終濃度為0.ImM0
8.如權利要求5所述的應用，其特徵在於所述電化學方法檢測為在頻率為IOOmHz IOkHz ,電壓為0. 17V的條件下測試電極表面上的電子傳遞電阻。
全文摘要
本發明公開了一種直接檢測IL-6的電化學免疫傳感器及應用，所述傳感器以單壁碳納米管為基底，將金納米粒子沉積於單壁碳納米管上構成單壁碳納米管/金納米粒子雜化電極，雜化電極用巰基乙酸修飾，再在巰基乙酸上組裝IL-6捕獲抗體，再用質量濃度1～5％牛血清蛋白的PBS緩衝液封閉，獲得所述電化學免疫傳感器；本發明的電化學免疫傳感器具有製備過程簡便、無需標記或夾心處理、成本低廉、檢測靈敏度高等優點，可廣泛用於各種免疫分析和檢測，且本發明製備的電化學免疫傳感器對目標IL-6抗原的檢測限可達到1×10-17g/ml。
文檔編號G01N27/327GK102706939SQ20121007496
公開日2012年10月3日 申請日期2012年3月20日 優先權日2012年3月20日
發明者楊婷, 王舜, 金輝樂, 陳錫安 申請人:溫州大學