一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料及其製備方法

2023-05-24 08:54:46 3

專利名稱：一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料及其製備方法，具體地說是一種通過調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素材料的自內而外由緻密漸變至疏鬆的梯度結構而製得中空異型細菌纖維素人造血管支架材料及其製備方法。
背景技術：
人體血液循環系統包括血液、血管和心臟三個部分，血管作為橋梁將各個器官和心臟串聯起來，並為血液的流動提供通道，將血液中的營養物質和養分輸送到身體的各個部分，因此往往又將稱其為心血管系統，在這些部位發生的病變被稱為心血管疾病。心血管疾病是威脅人類健康的最常見疾病，其發病率在全世界各類疾病中居於首位，目前我國每年因心腦血管疾病死亡的人數約有260萬人，平均每小時死亡約300人，並且隨著我國人口 進入老齡化，這類疾病的發生率、復發率和死亡率將不斷上升，給社會和家庭造成了沉重的經濟和精神負擔。目前人造血管移植是治療心血管疾病的基本方法，因此人造血管被廣泛地應用於外科領域。目前使用較廣泛的人造血管主要有以下幾種類型。(I)紡織型人造血管，主要是利用滌綸單絲纖維或復絲纖維通過機織或針織的方式製備得到人造血管。CN201341972Y, CN201341971Y, CN102296415A, CN1142932A 等專利均公開了利用滌綸纖維製備的單層紡織型人造血管的製備方法；CN101069757A，CN101069756, CN101066476A等專利則公開了利用滌綸纖維製備的雙層紡織型人造血管的製備方法。滌綸材料表面光滑，內部分子排列緊密，耐磨性、耐光性好,耐酸鹼腐蝕,並且強度高、彈性好、耐熱性和熱穩定性均優於其他合成纖維。大中口徑的滌綸人造血管已經成功應用臨床數十年，創造了非常可觀的經濟利益和良好的社會利益。但是紡織型人造血管的缺點也十分明顯利用機織的方式製備的滌綸人造血管孔隙率過小，雖然可以避免血管壁滲血，但是過於緻密的管壁不利於細胞的粘附生長；針織製備的方式可以提高人造血管的孔隙率，製備出具有良好柔性的人造血管，但是針織方式難以保證人造血管結構的均勻性，空隙分布也不均勻，且較粗糙的血管內壁也會增加血管內壁出現內膜增生(Intimalhyperplasia)的機率,誘發血栓；此外，還有很多研究表明漆糹侖的低親水性結構對人體體液具有高抗滲透性，容易引起凝血、血栓等不良反應，因此利用滌綸無法製備小口徑(外徑<6mm)的人造血管。紡織人造血管由於加工和後整理方面的原因還會造成臨床上多種併發症，如滲血嚴重、抗脫散性能差、自我支持結構不良、易塌陷、縱向和徑向的順應性差等。(2)合成高分子型人造血管，主要是以膨體聚四氟乙烯、聚氨酯、腈橡膠或它們的共聚物等合成高分子材料為基材製備人造血管。CN101785875A公開了一種納米超細纖維人工血管的製備方法，是利用靜電紡的方法將聚氨酯製備成人造血管；CN102702555A公開了一種聚四氟乙烯納米化新型人造血管及其製備方法，通過自組裝將多壁碳納米管與聚四氟乙烯相結合製備了可以提高血液通暢率的人造血管。以合成高分子材料為基材的人造血管具有良好的機械強度以及柔性，受壓後不易變形或扭轉成角。但是合成高分子的降解性差，尤其是部分降解產物有致癌毒性一直受到普遍爭議。這些缺陷使得合成高分子型人造血管的使用受到了限制。(3)天然高分子型人造血管，主要是以細菌纖維素、阿拉伯膠、纖維素、膠原蛋白等天然高分子材料為基材的人造血管。天然分子型人造血管具備良好的生物相容性，細胞黏附性能出色。與紡織型人造血管相比，其內壁更光滑，解決了紡織型人造血管工藝不適用於製備小口徑血管的難題。因此開發出新型的天然高分子型人造血管以及成為今年來的研究執佔。細菌纖維素(Bacterial Cellulose，也稱微生物纖維素)是一種納米纖維材料。其以細菌細胞內部作為生物合成反應器，將葡萄糖小分子在酶催化作用下經過一系列複雜的 變構過程最終通過β -1, 4-糖苷鍵結合形成β -1, 4-葡萄糖鏈由細菌系細胞側面的催化位點擠出。β -1, 4-葡萄糖鏈彼此之間通過分子內與分子間氫鍵作用，逐步、分層地形成脂多糖層、類晶團聚體、纖維素微纖並最終形成纖維素。這一系列的細胞外(Extracellular)成形過程被稱為「纖維素的自組裝」。正是這個獨特的微生物參與的過程賦予了細菌纖維素良好的理化性能超細三維網狀結構；良好的吸溼、保溼以及透氣性能；超高的持水性與溼態強度；高抗張強度與彈性模量等等。大量研究表明細菌纖維素材料具有良好的體內、體外生物相容性，加上其優異的形狀可調控性與形狀維持性使其在構建體內、體外組織工程支架材料具有得天獨厚的優勢。利用細菌纖維素材料作為組織工程管狀支架的研究近年來成為研究的熱點。關於中空異型細菌纖維素材料的製備也取得了一些成果。CN102657561A公開了一種複合結構人造血管的靜態製備方法。採用針織，機織以及編織的方法將纖維材料，主要是指高分子聚合物類，包括棉，紗，聚乙烯纖維，聚丙烯纖維等製成中空管狀支架。將支架浸沒在接入菌液的發酵培養液中並向支架內部通入空氣或氧氣，使細菌消耗糖源代謝纖維素絲包覆支架外壁形成管狀細菌纖維素材料。CN102641161A公開了一種複合結構人造血管及其動態製備方法。同樣採用針織，機織和編織的方法製備中空管狀支架材料。培養階段，採用緩慢轉動支架或緩慢上下移動支架的方式，使細菌消耗糖源代謝纖維素絲，在動態過程中包覆支架外壁形成管狀細菌纖維素材料。CN101348813A公開了一種具有抑菌性能的細菌纖維素管的製備方法。利用聚乙醇酸管、矽橡膠管以及膠片管作為透氧支架。靜置培養階段向支架內部通入空氣或氧氣使細菌消耗糖源代謝纖維素絲包覆支架外壁形成管狀細菌纖維素材料。CN101914434A公開了一種製備中空異形細菌纖維素材料的裝置以及方法。將矽膠，陶瓷，無紡布，尼龍，膨體聚乙烯等材料製成中空異型透氧支架並浸沒在接入菌液的培養液中。培養階段使電機帶動的透氧支架進行緩慢轉動，使使細菌消耗糖源代謝纖維素絲，在動態過程中包覆支架外壁形成中空異形細菌纖維素材料。目前已經公開的中空異型細菌纖維素材料的製備技術主要通過向中空透氧支架中通入空氣或氧氣，利用菌種賴氧生存的這一生物特性，人為創造氣/液兩相界面，使細菌消耗糖源代謝纖維素絲，包覆支架外壁形成中空異型細菌纖維素材料。現有公開技術製備中空透氧支架的工藝主要為機械織造與一次成型兩種。其中機械織造是指通過針織、機織或編織的方法將高分子聚合物纖維如棉、紗、聚乙烯纖維、聚丙烯纖維、PET纖維等製成中空多孔材料；一次成型是指將矽橡膠、膨體聚四氟乙烯、乳膠、陶瓷等透氧材料通過模具一次成型製成中空透氧支架。但是，現有技術所得到的中空異型細菌纖維素材料由於製備工藝的局限性而普遍存在材料壁厚不均一，內部結構疏密程度無規律，與所替換的人體組織內部結構相似度低，製備周期長等缺陷，大大限制了細菌纖維素這種新型生物質納米纖維材料在組織工程支架上的應用。這其中有一部分原因是由於透氧支架材料的孔隙、壁厚不均勻而導致氧氣滲透程度不均一造成的。CN101584882A公開了一種組織工程血管支架材料及其生產方法。專利中指出了透氧材料本身孔隙分布均一性對氧氣通入模具內部，並在模具外壁表面形成有氧界面均勻性的影響，並最終影響包覆在透氧模具外壁的細菌纖維素管狀材料的結構均一性。雖然這在一定程度上能夠改善現有技術製備得到產品的個體間差異很大、規格不一、出品率低的缺陷，但是卻忽略了製備中空細菌纖維素組織工程支架材料的核心應當圍繞目標組織的結構。專利中指出在製備單獨目標組織的細菌纖維素組織工程血管材料時，通入透氧模具內部的氧氣濃度在整個培養過程中須精確控制，不能發生變化，而理想人造血管支架應在實驗條件允許的前提下，最大程度上模仿目標血管組織的內部結構。人體內部血管、膽管、尿道、輸精管、十二指腸等中空異型組織都具備內壁緻密光滑、內部彈性、外壁疏鬆的梯度結構，而在培養過程中不同氧氣分壓以及氧氣濃度對於得到細菌纖維 素材料內部結構的疏密程度是有很大影響的。因此CN101584882A中所描述的實施方案並沒有緊密圍繞人造血管的要求來設計，所得到的基於細菌纖維素的組織工程支架材料理論上是無法達到合格人造血管材料的要求。

發明內容
本發明涉及一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素組織工程支架材料，選擇透氧材料作為模具材料，根據血管、膽管、尿道管、輸精管等人體中空異型組織的實際形狀、直徑及大小製作外周直徑與目標內徑相一致的中空異型模具。結合現有公開技術製備中空透氧支架的工藝，通過針織、機織或編織的方法將高分子聚合物纖維如棉、紗、聚乙烯纖維、聚丙烯纖維、PET纖維等製成中空多孔材料；或將矽橡膠、膨體聚四氟乙烯、乳膠、陶瓷等透氧材料通過模具一次成型製成中空透氧支架。培養階段通過精確控制培養條件，使所得到的中空異型細菌纖維素材料的內壁緻密光滑，利於人體內皮細胞識別與黏附，能夠在較短時間內大面積增殖形成抗凝血界面；內部區域纖維素微纖絲排列有序，基本沿支架軸向取向，利於平滑肌細胞識別與黏附，能夠大面積增殖形成連續相使中空異型細菌纖維素材料壁具有良好的力學彈性，外部區域纖維素分布鬆散，由纖維素微纖絲通過分子內與分子間氫鍵作用而無序交錯形成的多孔結構的平均孔徑增大，利於成纖維細胞黏附，同時利於毛細血管、微血管生長，使營養物質能夠順利滲透至人造血管支架材料內部。除此之外，本發明涉及的一種具有梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料在培養階段通過添加脈衝，使透氧支架內部氣體壓力呈周期性變化，透氧支架壁呈周期性收縮/舒張交替變化，從而確保材料在模擬人體血管組織周期性收縮/舒張的環境下形成，在結構上更接近人體組織。所述的梯度結構由三層結合緊密的中空細菌纖維素構成的中空管狀支架材料；所述的三層結合緊密的中空細菌纖維素為沿徑向由內而外分別為緻密層，彈性層與疏鬆層所述的結合緊密是指所述緻密層的纖維素微纖絲與所述彈性層的纖維素微纖絲以及所述的彈性層纖維素微纖絲與所述的疏鬆層的纖維素微纖絲彼此之間通過β -1, 4-葡萄糖鏈中的分子內與分子間氫鍵結合，形成脂多糖分子層，層與層之間也通過分子內與分子間氫鍵結合，無明顯物理分層；組成細菌纖維素的基本單元並非單根β_1，4-葡萄糖鏈，而是預微纖絲(premicrofibril),其由β _1，4-葡萄糖鏈組成,每9根β _1，4-葡萄糖鏈相互平行,通過分子內與分子間氫鍵結合，呈左手三螺旋狀，是組成微纖絲(miCTofibril)的基本單位，直徑為1. 5nm。微纖絲(microfibril)直徑為3. 5nm,微纖與微纖之間通過分子內與分子間氫鍵結合，β_1，4-葡萄糖鏈呈平行排布，形成纖維素I型結晶結構。其中所述緻密層中的纖維素含量0.7Χ1(Γ2 1. 0Xl(T2g/cm3，所述彈性層中的纖維素含量O. 3X10_2 O. 6X10_2g/cm3，所述疏鬆層中的纖維素含量O. 1X10_2 O. 2X 10 2g/cm3。作為優選的技術方案 如上所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料，所述的具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的壁厚為O. 3 3mm，其中所述緻密層的厚度為O.1 Imm,彈性層的厚度為O.1 Imm,疏鬆層的厚度為O.1 1mm。所述的中空透氧模具是由透氧材料根據所替換人體組織的實際形狀、直徑以及大小製作得到的；所述的中空透氧模具在外形上與人體乳內動脈、隱靜脈、尿道、十二指腸、膽管的形狀一致。所述的透氧材料是指在常溫常壓下的氧氣透過速率為100 IOOOmL. m_2. s—1，孔隙均一度偏差〈±0. 3的材料。所述的周期性的舒張/收縮交替性變化是指通過調節中空透氧模具內部氣體壓力，充氣使中空透氧模具發生膨脹、放氣使中空透氧模具恢復原狀，以充/放氣交替實施的方式，使中空透氧模具外徑在每分鐘60 165次的頻率範圍內，每次充氣膨脹使中空透氧模具外徑產生I 5%的變化。本發明還提供了一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，包括以下步驟I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白腖O. 05 O. 5，酵母膏O. 05 O. 5，檸檬酸O. 01 O. 1，磷酸氫二鈉O. 02 O. 2，磷酸二氫鉀O. 01 O.1,餘量為水；發酵培養液的pH為4. O 6. O ;將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X IO5 2X IO7 個/ml。3)培養階段；將擴培後的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，28 32°C培養；通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現中空異型細菌纖維素材料的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構；a.細菌纖維素生長誘導期I 2天控制中空透氧模具內部空氣壓力為1. O 1.1個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素；b.細菌纖維素快速生長期2 3天，即疏鬆層形成階段所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生I 5%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1 1. 2個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10 15%範圍內；至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到O.1 Imm ;
c.細菌纖維素平穩生長期3 5天所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生I 5%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；平穩生長期分兩個階段彈性層形成階段2 3天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1.1 1. 2個標準大氣壓，同時提高氧氣濃度，最高不超過40%，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到O.1 2謹；緻密層形成階段I 2天，加壓使中空透氧模具內部空氣壓力在1. 2 1. 5個標準大氣壓範圍內，同時提高氧氣濃度，最高不超過100%;直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到O.1 3mm，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料；4)後處理；靜置培養結束後，將上述的具備具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為I 10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2 10小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的細菌纖維素薄膜高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。如上所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，所述的高壓蒸汽滅菌後紫外輻照是指將上述發酵培養液置於高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘後取出置於紫外燈下輻照冷卻至室溫。如上所述的一種具備疏密結構的多孔細菌纖維素皮膚修復材料，其特徵在於，所述的菌種是指能夠生物合成纖維素的微生物，包括木醋桿菌、產醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的一種或幾種。如上所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，所述的通純氧是指將醫用氧以lL/min的速度通入上述的培養液中，並維持30分鐘；所述的接種是指用滅菌後的接種環鉤取適量保存於4°C下試管中的菌種，並轉移至上述的發酵培養液中；所述的擴培是指將接入菌種後的發酵培養液於28 32°C下搖床培養8 24小時。如上所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，所述的加壓為連續增壓或階段性增壓。如上所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，所述的連續增壓是指每分鐘向透氧模具內充入壓力百分數不超過2. 083X 10_2%的空氣，基數是1. 2個標準大氣壓，維持中空透氧模具內空氣壓力在1. 2 1. 5個標準大氣壓範圍內，最大不超過1. 5個標準大氣壓；所述的階段性增壓是指每小時向透氧模具內充入壓力百分數不超過1. 25%的空氣，基數是1. 2個標準大氣壓，維持中空透氧模具內空氣壓力在1. 2 1. 5個標準大氣壓範圍內，最大不超過1. 5個標準大氣壓。如上所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，所述的提高氧氣濃度為連續增加或階段性增加；彈性層形成階段，所述的連續增加是指氧氣濃度每分鐘增加O. 00463
0.00694%，直至氧氣濃度達到40%時不再增加；所述的階段性增加是指氧氣濃度每小時增加O. 278 O. 417%，直至氧氣濃度達到40%時不再增加； 緻密層形成階段，所述的連續增加是指氧氣濃度每分鐘增加O. 0174 O. 0347%，直至氧氣濃度達到100%時不再增加；所述的階段性增加是指氧氣濃度每小時增加
1.042 2. 083%，直至氧氣濃度達到100%時不再增加。如上所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的高壓滅菌是指將所述後處理後的具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料浸泡在純淨水中置於高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘後取出冷卻至室溫；所述的低溫封存是指將高壓滅菌後的具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料於4°C下保存。細菌纖維素作為一種新型的天然水凝膠具有其獨特的物理、化學和機械性質超細網狀結構；高抗張強度和彈性模量；高親水性，良好的透氣、吸水、透水性能，並有非凡的持水性和高溼強度。細菌纖維素的微纖絲束直徑為3 4nm，而由微纖維束連接成的纖維絲帶寬度為70 80nm,長度為I 9 μ m,是目前最細的天然纖維。細菌纖維素水凝膠的納米三維網狀結構為細胞、組織的重建提供了必要的三維空間和力學支持，起到模擬細胞外基質(Extra cellular matrix, ECM)的作用。具有良好的組織相容性；適合的孔徑和孔隙率，利於細胞的增殖和黏附，以及營養物質的滲入和細胞代謝產物的排出；生物可降解性和適合的降解率。其中生物材料對於結構和功能的仿生是組織工程支架最重要的性能要求。大量研究表明細菌纖維素具有良好的體內、體外生物相容性。極好的形狀維持性能和原位成型性。同時，人體體內中空管狀組織或中空異型組織如血管、膽管、尿道、輸精管、十二指腸等都由內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞以及一些細胞外基質、結締組織組成。內皮細胞主要提供組織的抗凝血界面，而平滑肌細胞主要賦予組織良好的力學強度與力學彈性。這兩點是組織工程重建人體體內中空管狀組織或中空異型組織所必需滿足的要求。研究表明，人體內皮細胞更傾向於在光滑的生物材料表面黏附並能夠在相對較短的時間內形成連續細胞層；內部結構規整、存在縫隙的生物材料則更利於平滑肌細胞進入其內部並增殖形成連續細胞層。本專利發明的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料能夠根據目標組織的實際結構，在最大程度上模仿自體組織的生物結構，可以在很大程度上縮短體外細胞培養的時間，明顯降低人體對外來移植物的排異現象，大大提高移植成功率。有益效果
與現有技術先比，本發明的有益效果是(I) 一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料成型過程連續，緻密層與彈性層之間、彈性層與疏鬆層之間均由納米微纖絲通過分子內與分子間氫鍵結合。使β_1，4-葡萄糖鏈構成的纖維素微纖絲在通過分子內與分子間氫鍵結合併結晶成型的過程中，自發、有序地形成疏鬆到緻密漸變的結構。結合程度更深，不僅局限於材料表面。(2) 一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料無明顯物理分層，結構連續性十分良好，由內向外的緻密層、彈性層、疏鬆層呈梯度變化；其次，疏鬆層與緻密層內也存在結構的梯度變化，使得材料在最大程度上模仿了人體組織自內向外由緻密到疏鬆的漸變梯度結構，縮短體外細胞培養的時間，明顯降低人體對外來移植物的排異現象，大大提高移植成功率。(3) 一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料在現有技術基礎上，通過增加培養過程中透氧模具內的空氣壓力，使得包覆在透氧模具外壁的細菌纖維素內部有氧區面積增加；同時精確控制壓力，不使細菌纖維素脫離模具產生明顯物理分層。同 時，通過在培養過程中改變透氧模具內的氧氣分壓來有目的地構造緻密層、彈性層與疏鬆層結構，改善了現有技術中僅向透氧模具內通純氧且模具內壓力恆定不變的單一工藝，同時也解決了氧氣分壓過高所導致纖維素增長速度變緩的缺陷。(4) 一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料在現有技術基礎上，在培養過程中加入脈衝，使中空透氧模具外徑呈收縮/舒張交替變化，從而確保材料在模擬人體血管組織的收縮/舒張的交替變化環境下形成，在結構上更接近人體組織。(5) 一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料成型過程簡單，支架材料製備周期短，製備過程綠色環保、簡便快速、製備成本低廉，是一種理想的人造血管支架材料。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。本發明涉及一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素組織工程支架材料，選擇透氧材料作為模具材料，根據血管、膽管、尿道管、輸精管等人體中空異型組織的實際形狀、直徑及大小製作外周直徑與目標內徑相一致的中空透氧模具。培養階段通過精確控制培養條件，使所得到的中空異型細菌纖維素材料的內壁緻密光滑，利於人體內皮細胞識別與黏附，能夠在較短時間內大面積增殖形成抗凝血界面；內部區域纖維素微纖絲排列有序，基本沿支架軸向取向，利於平滑肌細胞識別與黏附，能夠大面積增殖形成連續相使中空異型細菌纖維素材料壁具有良好的力學彈性，外部區域纖維素分布鬆散，由纖維素微纖絲通過分子內與分子間氫鍵作用而無序交錯形成的多孔結構的平均孔徑增大，利於成纖維細胞黏附，同時利於毛細血管、微血管生長，使營養物質能夠順利滲透至人造血管支架材料內部。除此之外，本發明涉及的一種具有梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料在培養階段通過添加脈衝，使中空透氧模具呈收縮/舒張交替變化，從而確保材料在模擬人體血管組織收縮/舒張的交替變化環境下形成，在結構上更接近人體組織。所述的梯度結構由三層結合緊密的中空細菌纖維素構成的中空管狀支架材料；所述的三層結合緊密的中空細菌纖維素為沿徑向由內而外分別為緻密層，彈性層與疏鬆層所述的結合緊密是指所述緻密層的纖維素微纖絲與所述彈性層的纖維素微纖絲以及所述的彈性層纖維素微纖絲與所述的疏鬆層的纖維素微纖絲彼此之間通過β -1, 4-葡萄糖鏈中的分子內與分子間氫鍵結合，形成脂多糖分子層，層與層之間也通過分子內與分子間氫鍵結合，無明顯物理分層；組成細菌纖維素的基本單元並非單根β -1, 4-葡萄糖鏈,而是預微纖絲(premicrofibril),其由β-1，4-葡萄糖鏈組成，每9根β-1，4-葡萄糖鏈相互平行，通過分子內與分子間氫鍵結合，呈左手三螺旋狀，是組成微纖絲(microfibril)的基本單位,直徑為1. 5nm。微纖絲(microfibril)直徑為3. 5nm,微纖與微纖之間通過分子內與分子間氫鍵結合，β-1，4-葡萄糖鏈呈平行排布，形成纖維素I型結晶結構。其中所述緻密層中的纖維素含量0.7Χ10_2 1. 0X10_2g/cm3，所述彈性層中的纖維素含量O. 3X10_2 O. 6X10_2g/cm3，所述疏鬆層中的纖維素含量O. 1X10_2 O. 2X 10 2g/cm3。實施例1I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2，蛋白腖O. 05，酵母膏O. 05，檸檬酸O. 01，磷酸氫二鈉O. 02，磷酸二氫鉀O. 01，餘量為水；發酵培養液的pH為4. O ;將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X105個/ml。3)培養階段；將擴培後的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，28°C培養；通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現中空異型細菌纖維素材料的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構；a.細菌纖維素生長誘導期2天控制中空透氧模具內部空氣壓力為I個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素；b.細菌纖維素快速生長期3天，即疏鬆層形成階段所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生1%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ；至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到O.1mm ；c.細菌纖維素平穩生長期5天所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生1%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；
平穩生長期分兩個階段彈性層形成階段3天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，同時提高氧氣濃度，最高不超過40%，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到O. 2mm ；緻密層形成階段2天，加壓使中空透氧模具內部空氣壓力在1. 2個標準大氣壓，同時提高氧氣濃度，最高不超過100% ;直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到O. 3mm，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料；4)後處理；靜置培養結束後，將上述的具備具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為lwt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持10小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的細菌纖維素薄膜高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的 中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。實施例2I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白腖O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O.1，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O.1，餘量為水；發酵培養液的pH為6. O ;將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/ml。3)培養階段；將擴培後的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，32°C培養；通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現中空異型細菌纖維素材料的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素；b.細菌纖維素快速生長期2天，即疏鬆層形成階段所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生5%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；控制中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在15% ；至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到1_ ；c.細菌纖維素平穩生長期3天所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生5%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；平穩生長期分兩個階段彈性層形成階段2天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時提高氧氣濃度，最高不超過40%範圍，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到2mm ；緻密層形成階段I天，加壓使中空透氧模具內部空氣壓力在1. 5個標準大氣壓範圍內，同時提高氧氣濃度，最高不超過100%範圍；直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到3mm，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料；4)後處理；靜置培養結束後，將上述的具備具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的細菌纖維素薄膜高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。實施例3
I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇3，蛋白腖O. 3，酵母膏O. 3，檸檬酸O. 05，磷酸氫二鈉O. 1，磷酸二氫鉀O. 05，餘量為水；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/ml。3)培養階段；將擴培後的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，30°C培養；通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現中空異型細菌纖維素材料的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素；b.細菌纖維素快速生長期2天，即疏鬆層形成階段所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生3%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在12. 5% ;至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到O. 5mm ；c.細菌纖維素平穩生長期4天所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生3%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；平穩生長期分兩個階段彈性層形成階段2天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，同時提高氧氣濃度，最高不超過40%，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到Imm ；緻密層形成階段2天，加壓使中空透氧模具內部空氣壓力在1. 3個標準大氣壓範圍內，同時提高氧氣濃度，最高不超過100%;直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到1. 5mm，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料；4)後處理；靜置培養結束後，將上述的具備具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為2wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持4小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的細菌纖維素薄膜高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。實施例4I)發酵培養液的調配；
發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白腖O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O.1，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O.1，餘量為水；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/ml。3)培養階段；將擴培後的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，30°C培養；通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現中空異型細菌纖維素材料的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素；b.細菌纖維素快速生長期2天，即疏鬆層形成階段所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；控制中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ；至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到1_ ;c.細菌纖維素平穩生長期5天所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；平穩生長期分兩個階段彈性層形成階段3天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時採用連續增加的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 00463%，直至氧氣濃度達到40%時不再增力口，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到2_ ；緻密層形成階段2天，採用連續加壓的方式，每分鐘向透氧模具內充入壓力百分數不超過2. 083X 10_2%的空氣，直至中空透氧模具內部空氣壓力達到1. 2個標準大氣壓不再加壓，同時採用連續增加的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 0174%，直至氧氣濃度達到100%時不再增加；直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到3mm，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料；4)後處理；靜置培養結束後，將上述的具備具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為2wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持4小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的細菌纖維素薄膜高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。實施例5I)發酵培養液的調配；
發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白腖O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O.1，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O.1，餘量為水；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/ml。3)培養階段；將擴培後的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，30°C培養；通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現中空異型細菌纖維素材料的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構；a.細菌纖維素生長誘導期2天控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素；b.細菌纖維素快速生長期3天，即疏鬆層形成階段所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；控制中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ；至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到1_ ；c.細菌纖維素平穩生長期3天所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；平穩生長期分兩個階段彈性層形成階段2天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時採用連續增加的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 00694%，直至氧氣濃度達到40%時不再增力口，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到2_ ；緻密層形成階段I天，採用連續加壓的方式，每分鐘向透氧模具內充入壓力百分數不超過2. 083X10_2%的空氣，直至中空透氧模具內部空氣壓力達到1. 5個標準大氣壓時不再加壓，同時採用連續增加的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 0347%，直至氧氣濃度達到100%時不再增加；直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到3mm，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料；4)後處理；靜置培養結束後，將上述的具備具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為2wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持4小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的細菌纖維素薄膜高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。實施例6I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋 白腖O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O.1，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O.1，餘量為水；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/ml。3)培養階段；將擴培後的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，30°C培養；通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現中空異型細菌纖維素材料的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素；b.細菌纖維素快速生長期2天，即疏鬆層形成階段所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ；至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到1_ ；c.細菌纖維素平穩生長期5天所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；平穩生長期分兩個階段彈性層形成階段3天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時採用階段性增加的方式，使氧氣濃度每小時增加O. 278%，直至氧氣濃度達到40%時不再增力口，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到2_ ；緻密層形成階段2天，採用階段性加壓的方式，每小時向透氧模具內充入壓力百分數不超過1. 25%的空氣，直至中空透氧模具內部空氣壓力達到1. 2個標準大氣壓時不再加壓；同時採用階段性增加的方式，使氧氣濃度每小時增加1. 042%，直至氧氣濃度達到100%時不再增加；直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到3mm，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料；4)後處理；靜置培養結束後，將上述的具備具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為2wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持4小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的細菌纖維素薄膜高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。實施例7I)發酵培養液的調配；
發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋白腖O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O.1，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O.1，餘量為水；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/ml。3)培養階段；將擴培後的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，30°C培養；通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現中空異型細菌纖維素材料的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素；b.細菌纖維素快速生長期2天，即疏鬆層形成階段所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；控制中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ；至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到1_ ；c.細菌纖維素平穩生長期3天所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；平穩生長期分兩個階段彈性層形成階段2天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時採用階段性增加的方式，使氧氣濃度每小時增加O. 417%，直至氧氣濃度達到40%時不再增力口，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到2_ ；緻密層形成階段I天，採用階段性加壓的方式，每小時向透氧模具內充入壓力百分數不超過1. 25%的空氣，直至中空透氧模具內部空氣壓力達到1. 5個標準大氣壓時不再加壓，同時採用階段性增加的方式，使氧氣濃度每小時增加2. 083%，直至氧氣濃度達到100%時不再增加；直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到3mm，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料；4)後處理；靜置培養結束後，將上述的具備具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為2wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持4小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的細菌纖維素薄膜高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。實施例8I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋 白腖O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O.1，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O.1，餘量為水；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X10個/ml。3)培養階段；將擴培後的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，30°C培養；通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現中空異型細菌纖維素材料的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素；b.細菌纖維素快速生長期2天，即疏鬆層形成階段所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；控制中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ；至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到1_ ;c.細菌纖維素平穩生長期5天所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；平穩生長期分兩個階段彈性層形成階段3天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時採用連續增加的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 005%，直至氧氣濃度達到40%時不再增加，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到2_ ；緻密層形成階段2天，採用連續加壓的方式，每分鐘向透氧模具內充入壓力百分數不超過2. 083X10_2%的空氣，直至中空透氧模具內部空氣壓力達到1. 5個標準大氣壓時不再加壓，同時採用連續增加的方式，使氧氣濃度每分鐘增加O. 025%，直至氧氣濃度達到100%時不再增加；直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到3mm，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料；4)後處理；靜置培養結束後，將上述的具備具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為2wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持4小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的細菌纖維素薄膜高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。實施例9I)發酵培養液的調配；發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇5，蛋 白腖O. 5，酵母膏O. 5，檸檬酸O.1，磷酸氫二鈉O. 2，磷酸二氫鉀O.1，餘量為水；發酵培養液的pH為5. O ;將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液；2)菌種擴培；將所述的發酵培養液接入菌液和擴培；擴培程度菌種細胞數目在2X107個/ml。3)培養階段；將擴培後的菌液轉移至裝有發酵培養液的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，30°C培養；通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現中空異型細菌纖維素材料的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構；a.細菌纖維素生長誘導期I天控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素；b.細菌纖維素快速生長期2天，即疏鬆層形成階段所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；控制中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10% ；至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到1_ ;c.細菌纖維素平穩生長期5天所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生2%的變化，所述的收縮是指恢復原狀；平穩生長期分兩個階段彈性層形成階段3天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1. 2個標準大氣壓，同時採用階段性增加的方式，使氧氣濃度每小時增加O. 3%，直至氧氣濃度達到40%時不再增加，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到2_ ；緻密層形成階段2天，採用階段性加壓的方式，每小時向透氧模具內充入壓力百分數不超過1. 25%的空氣，直至中空透氧模具內部空氣壓力達到1. 5個標準大氣壓時不再加壓，同時採用階段性增加的方式，使氧氣濃度每小時增加1. 5%，直至氧氣濃度達到100%時不再增加；直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到3_，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料；4)後處理；靜置培養結束後，將上述的具備具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為2wt%的氫氧化鈉 溶液中，煮沸保持4小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的細菌纖維素薄膜高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。
權利要求
1.一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料，其特徵是所述的具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料是由三層結合緊密的細菌纖維素構成的中空管狀支架材料，所述的三層結合緊密的細菌纖維素膜由內向外依次為緻密層、彈性層與疏鬆層；所述的結合緊密是指所述緻密層纖維素微纖絲與所述疏鬆層纖維素微纖絲、所述彈性層纖維素微纖絲與所述疏鬆層纖維素微纖絲通過β -1, 4-葡萄糖鏈中的分子內與分子間氫鍵結合，形成分子層，層與層之間也通過分子內與分子間氫鍵結合，無明顯物理分層； 其中所述緻密層中的纖維素含量O. 7Χ 10_2 1. OX 10_2g/cm3，所述彈性層中的纖維素含量O. 3 X Kr2 O. 6 X l(T2g/cm3，所述疏鬆層中的纖維素含量O.1 X 1(Γ2 (λ 2 X l(T2g/cm3。
2.根據權利要求1所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料，其特徵在於，所述的細菌纖維素膜是由菌種消耗糖源，分泌纖維素微纖絲通過分子內與分子間氫鍵結合形成；所述的菌種是指能夠生物合成纖維素的微生物，包括木醋桿菌、產醋桿菌、醋化桿菌、巴氏醋桿菌、葡萄糖桿菌、農桿菌、根瘤菌、八疊球菌、洋蔥假單胞菌、椰毒假單胞菌或空腸彎曲菌中的一種或幾種。
3.根據權利要求1所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料，其特徵在於，所述的具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的壁厚為O.3 3mm,其中所述緻密層的厚度為O.1 Imm,所述彈性層的厚度為O.1 Imm,所述疏鬆層的厚度為O.1 1mm。
4.如權利要求1所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，其特徵是包括以下步驟 1)發酵培養液的調配； 發酵培養液組分，以質量百分數計，單位為wt% :葡萄糖、果糖、蔗糖或甘露醇2 5，蛋白腖O. 05、. 5，酵母膏O. 05、. 5，檸檬酸O. 0Γ0. 1，磷酸氫二鈉O. 02、. 2，磷酸二氫鉀ο. οΓο. 1，餘量為水； 發酵培養液的pH為4. O 6. O ; 將上述組分混合後經高壓蒸汽滅菌後紫外輻照並冷卻至室溫，通純氧，即得發酵培養液； 2)囷種擴Jfl; 將所述的發酵培養液接種和擴培； 擴培程度菌種細胞數目在2 X IO5 2 X IO7個/ml ; 3)靜置培養； 將擴培後的菌液轉移至灌滿發酵培養液，內部有中空透氧模具的培養容器中，放置於恆溫培養箱中，28 32°C靜置培養，所述的中空透氧模具內部通入空氣； 所述的中空透氧模具是由透氧材料根據所需修復的人體組織的實際形狀、直徑以及大小製作得到的；所述的中空透氧模具在外形上與人體乳內動脈、隱靜脈、尿道、十二指腸、膽管的形狀一致； 通過分步調節透氧模具內部空氣整體氣壓以及氧氣分壓來實現細菌纖維素材料的內腔緻密、內部彈性和外壁疏鬆的由內向外逐漸由緻密變疏鬆的梯度結構； a.細菌纖維素生長誘導期I 2天控制中空透氧模具內部空氣壓力為1. O 1.1個標準大氣壓，直至細菌將培養液中溶解的氧氣消耗殆盡後慢慢聚集在中空透氧模具外表面，透氧模具外壁包覆一層半透明的細菌纖維素； b.細菌纖維素快速生長期2 3天，即疏鬆層形成階段 所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生I 5%的變化，所述的收縮是指恢復原狀； 控制中空透氧模具內部空氣壓力為1.1 1. 2個標準大氣壓，同時保持氧氣濃度在10 15%範圍內；至透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到O.1 Imm ; c.細菌纖維素平穩生長期3 5天 所述的中空透氧模具的外壁呈周期性的舒張/收縮交替性變化；所述的舒張是指中空透氧模具外徑產生I 5%的變化，所述的收縮是指恢復原狀； 平穩生長期分兩個階段 彈性層形成階段2 3天，維持中空透氧模具內部空氣壓力為1.1 1. 2個標準大氣壓，同時提高氧氣濃度，在不超過40%範圍內，直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到O. 2 2mm ; 緻密層形成階段I 2天，加壓使中空透氧模具內部空氣壓力在1. 2 1. 5個標準大氣壓範圍內，同時提高氧氣濃度，在不超過100%範圍內；直至中空透氧模具外壁包覆的細菌纖維素壁厚達到O. 3 3mm，將其取出，即得到具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料； 4)後處理； 靜置培養結束後，將上述的具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料浸泡至濃度為I 10wt%的氫氧化鈉溶液中，煮沸保持2 10小時，用純淨水清洗至pH為7. 0，材料內毒素〈O. 5EU/ml，再將處理後的具備梯度結構的中空異型細菌纖維素材料高壓滅菌並包裝低溫封存，即為具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料。
5.根據權利要求4所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的高壓蒸汽滅菌後紫外輻照是指將所述發酵培養液置於高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘後取出置於紫外燈下輻照冷卻至室溫。
6.根據權利要求4所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的通純氧是指將醫用氧以lL/min的速度通入上述的培養液中，並維持30分鐘；所述的接種是指用滅菌後的接種環鉤取適量保存於4°C下試管中的菌種，並轉移至上述的發酵培養液中；所述的擴培是指將接入菌種後的發酵培養液於28 32°C下搖床培養8 24小時； 所述的加壓為連續增壓或階段性增壓；所述的提高氧氣濃度為連續增加或階段性增加。
7.根據權利要求6所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的連續增壓是指每分鐘向透氧模具內充入壓力百分數不超過2. 083X10-2%的空氣，基數是1. 2個標準大氣壓，維持中空透氧模具內空氣壓力在1.2 1. 5個標準大氣壓範圍內，最大不超過1. 5個標準大氣壓；所述的階段性增壓是指每小時向透氧模具內充入壓力百分數不超過1. 25%的空氣，基數是1. 2個標準大氣壓，維持中空透氧模具內空氣壓力在1. 2 1. 5個標準大氣壓範圍內，最大不超過1. 5個標準大氣壓； 彈性層形成階段，所述的連續增加是指氧氣濃度每分鐘增加O. 00463 O. 00694%，直至氧氣濃度達到40%時不再增加；所述的階段性增加是指氧氣濃度每小時增加O. 278 .O.417%，直至氧氣濃度達到40%時不再增加；緻密層形成階段，所述的連續增加是指氧氣濃度每分鐘增加O. 0174 O. 0347%，直至氧氣濃度達到100%時不再增加；所述的階段性增加是指氧氣濃度每小時增加1. 042 .2.083%，直至氧氣濃度達到100%時不再增加。
8.根據權利要求4所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的高壓滅菌是指將所述後處理後的具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料浸泡在純淨水中置於高壓滅菌鍋內121°C滅菌處理30分鐘後取出冷卻至室溫；所述的低溫封存是指將高壓滅菌後的具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料於4°C下保存。
9.根據權利要求4所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的透氧材料是指在常溫常壓下的氧氣透過速率為100 IOOOmL. m_2. s_S孔隙均一度偏差〈±0. 3的材料。
10.根據權利要求4所述的一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料的製備方法，其特徵在於，所述的周期性的舒張/收縮交替性變化是指通過調節中空透氧模具內部氣體壓力，充氣使中空透氧模具發生膨脹、放氣使中空透氧模具恢復原狀，以充/放氣交替實施的方式，使中空透氧模具外徑在每分鐘60 165次的頻率範圍內，每次充氣膨脹使中空透氧模具外徑產生I 5%的變化。
全文摘要
本發明涉及一種具備梯度結構的中空異型細菌纖維素人造血管支架材料及其製備方法。通過控制細菌纖維素的培養條件製備出一種具有類似人體血管組織「內腔緻密、內部彈性、外壁疏鬆」的生物結構的人造血管支架，生物相容性以及細胞活性良好。緻密層與彈性層、彈性層與疏鬆層之間結合程度更深，不僅局限於材料表面。無明顯物理分層，結構連續性良好，緻密層、彈性層與疏鬆層內存在結構的梯度變化，最大程度模仿了人體血管組織內密外疏的漸變梯度結構，縮短體外細胞培養的時間，明顯降低人體對外來移植物的排異現象，大大提高移植成功率，支架成型過程簡單，培養周期短，製備過程綠色環保、簡便快速、製備成本低廉。
文檔編號C12P19/04GK103007344SQ201210575870
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月26日 優先權日2012年12月26日
發明者楊敬軒, 李喆, 鄭羿, 王利群, 王華平, 陳仕豔, 張雲 申請人:東華大學