處置病毒感染的方法

2023-05-24 20:27:31 3

專利名稱：處置病毒感染的方法
技術領域：
本發明涉及病毒感染的處置。因此，本發明涉及在製備處置病毒感染的物質或組合物方面的一種化合物、物質或組合物的用途;涉及用於病毒感染處置的化合物、物質或組合物;涉及用作病毒感染處置的藥品或藥劑的化合物、物質或組合物;涉及用作病毒感染處置的活性治療劑的化合物、物質或組合物;涉及用來製備處置病毒感染的組合物、藥品或藥劑而使用的化合物、物質或組合物;涉及適宜用在病毒感染處置方面的新化合物、涉及病毒感染處置的藥品或藥劑;涉及製備化合物的新方法和該方法製備的化合物。本發明尤其涉及適合處置人體免疫缺乏病毒感染(HIV)，呼吸道融合病毒感染(RSV)和細胞巨化病毒感染(CMV)的所說的用途，所說的化合物、物質或組合物;所說藥品或藥劑;所說的製備方法。
按照本發明，在製備處置人或動物治療體內病毒感染，尤其是人體治療體內HIV;RSV或CMV感染的物質或組合物方面提供化合物、物質或組合物的用途，該物質或組合物包括含至少一種通式(1)的化合物
其中R1、R2、R3和R4可相同或不同並選自-H，-OH，A，B，C和D，而其中A ＝
B ＝
(其中-OSO
基團的任意1-3個可選地用-OH取代)
C ＝
;及D ＝ -OSO
尤其是，每個式(1)化合物中，R2和R3選自-OH，-H和D;且每個式(1)化合物中，R1和R4選自-OH，A，B，C和D。
更具體的，每個所說的式(1)化合物可選自R1，R2，R3和R4是列於下面表1的化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ)，這些化合物是按所說式(Ⅰ)的優選化合物。表1中某些化合物存在於下文詳述的植物提取物中(化合物Ⅴ-Ⅷ)，而另一些是其代謝物(化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-ⅩⅩⅧ)。代謝物Ⅰ-Ⅳ是在人體腸中生成的，而代謝物Ⅸ-ⅩⅩⅧ是在人體內通過Ⅱ階段生體轉化來生成。Ⅱ階段生體轉化意指生物合成反應，從而使一種取代基加到前體分子中，一般使前體分子增大水溶性和/或減少生物反應性。
(表1化合物Ⅸ，Ⅺ和Ⅻ內R2和R3位置的任何羥基可用D取代)。
至少一種所說的通式(1)的化合物可以形成取自為仙茅科(Hypoxidaceae)植物成員的至少一種植物種的部分提取物，優選形成自至少一種為選自如下植物屬的一種植物屬成員的植物種的部分提取物Hypoxis、Spiloxene、Curculigo和Campynema。
本發明使得處置人或動物治療體內病毒感染，尤其是處置人體治療體內的HIV、RSV或CMV感染的方法成為可能，該方法包括向治療體投用一種物質或組合物，該物質或組合物包括一種來自為仙茅科植物成員的至少一種植物種的提取物，或者該方法包括向治療體給用一種物質或組合物，它們具有包括至少一種上述式(1)化合物的一種活性成分。
該提取物可是乾燥提取物。該提取物可為選自如下的至少一種植物種的提取物Hypoxisnitida，H.obtusa，H.rigidula，H.villosa，H.interjecta，H.multiceps，H.nyasica且特別是H.rooperi(也叫作H.hemerocallidea)，H.acuminata及H.latifolia(也叫作H.colchicifolia或H.oligotricha)，Spiloxeneschlechteri及其雜交物。
由於化合物Ⅴ-Ⅷ產生在上述植物提取物中，那麼，在按照本發明的上述用途中，每個通式(1)的化合物(形成部分所說植物提取物)可選自化合物Ⅴ-Ⅷ，所具有的R1、R2、R3和R4列於前面的表1中。自然，作為替代，每個所述的通式(1)的化合物(當它不形成部分植物提取物時)可選自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-XXⅧ，所具有的R1、R2、R3和R4列於前面的表1。因此，每個式(1)化合物可選自化合物Ⅰ-Ⅴ，或者作為替代，每個化合物可選自化合物Ⅸ-XXⅧ。
上述用途可用於的病毒感染選自人體的免疫缺乏病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染，特別是HIV感染。
化合物E-1，5-雙(3′-羥基-4′-O-β-D-吡喃葡糖苯基)戊-4-烯-1-炔(也叫作hypoxoside)是R2及R3為-OH而R1及R4為A的式(1)化合物之中的化合物Ⅴ。上述自仙茅科植物的提取物含有一種或多種化合物Ⅰ-Ⅷ，特別是Ⅴ-Ⅶ。Hypoxoside和有關的自仙茅科植物的1，5-二取代戊-4-烯-1-炔化合物的分離公開在Marini-Bettolo等人的文章Tetrahedron，1982，38，1683-1687，而其合成則公開在南非專利86/4482中。
按照上面所示，應當注意，在B中任何1-3個硫酸根基團可任選地用-OH取代;而在化合物Ⅸ、Ⅺ和Ⅻ中的任何羥基可用D取代。
化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的製備詳述如下。
植物提取物，或所說的式(1)化合物，尤其是化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ可口服或腸胃外給藥。
在腸胃外給藥的情況下，植物提取物或化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ可溶在合適的如鹽水的水溶液中靜脈注射給藥。靜脈給藥可連續或間歇地進行，並可以使血漿中的化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ和/或其代謝物(如其Ⅱ階段生體轉化產物)的平均含量達到0.1-400μg/ml(如25-200μg/ml)且優選達到50-150μg/ml(如100μg/ml)的方式進行。
對靜脈給藥而言，期望化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ以濃度為1-100mg/ml(典型為50-100mg/ml)的滅菌溶液形式和一定速率給藥，使得上面所說的血漿中化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的含量達到最高達400μg/ml血漿的穩定狀態。
在口服給藥的情況下，植物提取物或化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ可呈片劑，或粉劑或溶液形式，也可包在膠囊中。溶液可為水溶液，且這種溶液可為一種或多種化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的純態混和物溶液，或者是植物提取物的溶液。同樣，片劑、粉劑或膠囊可包含植物提取物或者一種或多種化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ。每個片劑或膠囊可含有作為混和物的一種或多種所說化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ20-500mg，優選50-300mg，例如200mg。
對志願人員的試驗顯現出，將無水甲醇的植物提取物以3200mg/天的速率口服給藥可很好地容許治療體內血漿中含藥濃度達到200μg/ml的程度。僅有的付作用只限於小部分治療體(25人中有3人)的某些程度的噁心、嘔吐及腹瀉。
另個試驗中所述無水甲醇的植物提取物以靜脈給藥，溶於鹽水溶液後給藥於羊，其劑量速率是200mghypoxoside/Kg/天，至少給藥30天且至多60天，除增重下降和在給藥部位結締組織有些變色外，沒有明顯的與藥物相關的作用。因而將該方法擴展到植物提取物特別是高壓液色譜純化餾分的腸胃外用藥，且尤其是靜脈給藥;所述餾分含有甲醇植物餾分的化合物Ⅴ-Ⅷ，將其溶在水溶液(優選鹽水溶液)中。此外，當發現經人體口服攝入化合物Ⅴ-Ⅷ後，化合物Ⅸ-XXⅧ在血漿中的加合濃度或總的濃度水平已達400μg/ml血漿時化合物Ⅸ-XXⅧ特別適宜溶在鹽水溶液內直接靜脈輸注。
本發明的另個方面是提供一種化合物、物質或組合物，它可用來處置人或動物治療體內病毒感染，特別是處置人體治療體內的HIV、RSV或CMV感染，該化合物、物質或組合物包括至少一種上面限定的通式(1)的化合物。
本發明的另個方面是提供用途藥品或藥劑的化合物、物質或組合物，用來處置人或動物治療體病毒感染，特別是人體治療體內HIV、RSV或CMV感染，該化合物、物質或組合物包含至少一種如上限定的通式(1)的化合物。
本發明的另個方面是提供用作活性治療劑的化合物、物質或組合物，用來處置人或動物治療體內的病毒感染，尤其是人體治療體內的HIV、RSV或CMV感染，該化合物、物質或組合物包含如上限定的通式(1)的化合物。
本發明的另個方面是提供一種化合物、物質或組合物，用來製備一種組合物、藥品或藥劑來處置人或動物治療體內的病毒感染，特別是人體治療體內的HIV、RSV或CMV感染，該化合物、物質或組合物包含至少一種如上限定的通式(1)的化合物。
本發明進而擴展到如上限定的通式(1)的化合物的新化合物，其附加條件是當R2和R3兩者選自-OH和-H時，那麼，R1和R4不是兩個-OH並且R1和R4不是兩個A。
本發明又一個方面是提供一種藥品或藥劑來處置人或動物治療體內的病毒感染，特別是人體治療體內的HIV、RSV和CMV感染，該藥品或藥劑包含作為活性治療劑的至少一種如上限定的通式(1)的化合物，同時受到上面附加條件限制。
藥品或藥劑的形式可選自含活性治療劑的片劑，膠囊，粉劑和液體，片劑和膠囊每個含活性治療劑20-50mg，而粉劑和液體每種含活性治療劑4-10mg/ml。
本發明還擴展到本文所述化合物Ⅸ-ⅩⅩⅧ的製備的新方法，特別是採用將其從化合物Ⅰ-Ⅷ或從化合物Ⅰ-Ⅷ的衍生物的局部合成的方法。
R1、R2、R3和R4如上文表1所示的，選自化合物Ⅰ-Ⅳ的通式(1)的化合物其製備方式可為將選自化合物Ⅴ-Ⅷ的通式(1)的化合物從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取，將所說的提取的化合物進行酶水解，從而得到作為產物的選自化合物Ⅰ-Ⅴ的所述化合物。
本發明進而擴展到製備通式(1)化合物的方法，該化合物選自化合物Ⅸ-Ⅻ，其中的R1、R2、R3和R4如上文表1所示，該方法包括將選自化合物Ⅴ-Ⅷ的通式(1)的化合物從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取，將該提取的化合物過硫酸化，得到選自化合物Ⅸ-Ⅻ的作為產物的所述化合物。
本發明還擴展到R1、R2、R3和R4如上表1所示，選自化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ的通式(1)的化合物的製備方法，包括將選自化合物Ⅴ-Ⅷ的通式(1)的化合物從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取，將所述提取的化合物進行酶水解來得到選自化合物Ⅰ-Ⅴ的化合物，該方法還包括將選自化合物Ⅰ-Ⅳ的所述化合物硫酸化來得到作為產物的選自化合物ⅩⅦ-XX的所述化合物。
本發明還擴展到製備通式(1)化合物中化合物ⅩⅢ的方法，其中R1、R2、R3和R4如上表1所示，該方法包括將通式(1)化合物中化合物Ⅴ從為仙茅科植物成員的一種植物種中提取，對化合物Ⅴ進行酶水解得到化合物Ⅰ，將所述化合物Ⅰ進行葡糖苷酸化，從而得到作為產物的所述化合物ⅩⅢ。
本發明還擴展到為選自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-XXⅧ的通式(1)的化合物的製備方法，其中的R1、R2、R3和R4如上文表1所示，該方法包括將選自化合物Ⅴ-Ⅷ的至少一種通式(1)的化合物從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取，使人或動物治療體攝入提取的化合物，收集攝入之後的治療體的尿，該尿中含有作為選自化合物Ⅴ-Ⅷ的化合物代謝物的選自化合物Ⅰ-Ⅴ和ⅩⅢ-XXⅧ的所述化合物，並從尿中提取作為產物化合物的所述代謝物。
當然，該方法包括每種化合物產物的分離及提純步驟。
當利用如上限定的本發明方法製備時，本發明還擴展到所獲得的選自化合物Ⅰ-Ⅳ及Ⅸ-XXⅧ的通式(1)化合物，其中R1、R2、R3和R4如上文表1中所列。
試驗時出乎意料地發現，植物提取物特別是自植物提取物得的化合物Ⅴ，尤其在過硫酸化時表現了HIV的體外活性。而且還出乎意料地發現，當這些以純體形式或作為植物提取物的一部分的化合物生體轉化時(Ⅱ階段生體轉化)，在體外和體內都顯示抗HIV的活性。化合物Ⅸ-XXⅧ的實用性尤其不可預料且另人驚奇，因為化合物的Ⅱ階段生體轉化(肝的和/或肝外的)通常導至其生物失活。這些代謝物的抗病原或抗病毒作用因而完全不能予料。在這些試驗中，被處置的治療體與未被處置的治療體在HIV感染的特性平均值方面相比較時，P24HIV核蛋白含量表現為平均降低而特定淋巴細胞亞群的含量表現為平均增加。
現在詳述本發明，利用實施例，結合參照所進行的說明活體外的抗病毒活性，抗HIV活性的試驗，結合參照臨床試驗，結合參照製備新化合物Ⅸ-XXⅧ的實施例，並結合參照附圖來詳述，其中

圖1表明標示Hypoxisrooperi球莖中化合物Ⅴ-Ⅷ的甲醇提取物的mAU(毫吸收單位)對時間(分)的色譜圖，說明提取物中化合物Ⅴ、化合物Ⅵ和化合物(Ⅶ+Ⅷ)的相對量，使用的信號波長是260nm，帶寬20nm，而參照波長是550nm，帶寬50nm;
圖2表示類似於圖1的H.latifolia球莖中化合物Ⅴ-Ⅷ的甲醇提取物的色譜圖，說明提取物中化合物Ⅴ、化合物Ⅳ和化合物(Ⅶ+Ⅷ)的相對量，通過化合物Ⅴ-Ⅷ的酶去糖苷作用分別得到的(非糖部)配基，即分別是化合物Ⅰ-Ⅳ，為對比目的而將其共同色譜分析，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅰ12.18Ⅱ14.84(Ⅲ+Ⅳ)13.55Ⅴ8.25Ⅵ8.76(Ⅶ+Ⅷ)8.50圖3表示類似於圖1的以HPLC法將H.rooperi甲醇提取物純化的化合物Ⅴ-Ⅷ的色譜圖，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅴ8.28Ⅵ8.79(Ⅶ+Ⅷ)8.54
圖4是類似於圖1的色譜圖，表示攝入1g純化的化合物Ⅴ-Ⅷ(其色譜在圖3中顯示)之前人體血清分析色譜，且在其中疊加有同樣治療體在攝入所述化合物90分鐘後的血清色譜圖，化合物Ⅴ-Ⅷ的代謝物在攝入後色譜圖上具有三個主峰，分別相似於下文圖5和圖6中的餾分A、B和C;
圖5為類似於圖1的色譜圖，是攝入純化的化合物Ⅴ-Ⅷ(其色譜在圖3中顯示)三小時之後人尿的色譜圖，其說明在圖6中被說明的三種尿餾分A、B和C;
圖6示出類似於圖1的三個色譜圖，疊加部分說明用HPLC法從尿(其色譜示於圖5)中製備分離的純化代謝物的三種餾分(即餾分A、B和C)，它們的保留時間是餾分保留時間(分鐘)A7.19B7.90C9.03;
圖7表示二極體系統檢測器紫外吸收光譜圖，說明圖6純化尿代謝物餾分A的吸收光譜，其為mAU對波長(nm)的繪製圖，該光譜圖的吸收波長最大分別是在206.5-210.5nm和258.5-262.5nm，而吸收波長最小處在230.5-234.5nm;
圖8表示類似於圖7的光譜圖，為圖6餾分B的吸收光譜，該光譜圖的吸收波長最大處分別在206.5-210.5nm和258.5-262.5nm，最小處在228.5-232.5nm;
圖9表示類似於圖7的光譜圖，為圖6餾分C的吸收光譜，該吸收光譜的吸收波長最大處分別在204.5-208.5nm和256.5-260.5nm，吸收波長最小處在228.5-232.5nm;
圖10表示類似於圖1的純化的尿餾分A的一種結合體的HPLC色譜圖，該結合體是餾分A用β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶在pH＝5.5時水解衍生的，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅰ12.35Ⅱ14.91(Ⅲ+Ⅳ)13.58在這些保留時間數據與化合物Ⅰ，化合物Ⅱ和化合物(Ⅲ+Ⅳ)(由β-葡糖苷酶對H.latifolia的乙醇提取物(如圖2所示)的作用而衍生)的那些相應數據間發現對應性，尿和植物衍生的結合體的吸收光譜也可疊合;
圖11表示類似於圖10的由純化尿餾分B以類似形式衍生的所述結合體的色譜圖;
圖12表示類似於圖10的由純化尿餾分C以類似方式衍生的所述結合體的色譜圖;
圖13表示類似於圖1的化合物Ⅰ的葡糖苷酸化產物的色譜圖，該產物即為以改型的Koenigs-Knorr合成方法得到化學合成的化合物Ⅰ的β-D-吡喃葡糖苷酸酯，該產物可用選擇溶劑分配法純化，化合物Ⅰ的化學β-D-葡糖苷酸化產生兩種產物，其保留時間和光譜和圖5的尿代謝物餾分A的相一致，所討論的光譜圖疊加在圖13中;
圖14表示類似於圖7的化合物Ⅰ的光譜圖，但將mAU軸標度(標準化)，吸收波長最大處分別在210.5-214.5nm，258.5-262.5nm和290.5-294.5nm，吸收波長最小處分別在234.5-238.5nm和282.5-286.5nm;
圖15表示類似圖14但對化合物Ⅱ的光譜圖，吸收波長最大處分別在200.5-204.5nm和258.5-262.5nm，吸收波長最小處在222.5-226.5nm;
圖16表示類似圖14但對化合物(Ⅲ+Ⅴ)的光譜圖，吸收波長最大處分別在202.5-206.5nm和258.5-262.5nm，而吸收波長最小處在228.5-232.5nm;
圖17表示類似圖14但對化合物Ⅴ的光譜圖，吸收波長最大處分別在210.5-212.5nm，254.5-258.5nm以及288.5-292.5nm，而吸收波長最小處分別在232.5-234.5nm和278.5-282.5nm;
圖18表示類似圖14的對化合物Ⅵ的光譜圖，吸收波長最大處分別在200.5-204.5nm和256.5-260.5nm，而吸收波長最小處在220.5-224.5nm處;
圖19表示類似圖14的化合物(Ⅵ+Ⅷ)的光譜圖，吸收波長最大處分別在204.5-208.5nm和256.5-260.5nm，而吸收波長最小處在226.5-230.5nm;
圖20表示類似圖14但顯示化合物Ⅰ和Ⅴ的疊合吸收光譜的光譜圖;
圖21表示類似圖14但顯示化合物Ⅱ和Ⅵ的疊合吸收光譜的光譜圖;
圖22表示類似圖14但顯示化合物(Ⅲ+Ⅳ)和(Ⅶ+Ⅷ)的疊合吸收光譜的光譜圖;
圖23表示類似圖1的疊合的色譜圖，是分別從天然和合成來源得到的化合物Ⅱ的色譜，天然化合物是將得自H.rooeri的HPLC純化的化合物Ⅴ進行酶去糖苷化而得到，而合成的化合物是照Drewes等人的SyntheticCommunications，1990，20，1671-1679所述方法合成的;
圖24表示類似圖14的光譜圖，為合成和天然型化合物Ⅱ(其中色譜圖示於圖23)的疊合的吸收光譜;
圖25表示類似圖1的色譜圖，其為通過化合物Ⅴ-Ⅷ的混和物過硫酸化獲得的化合物Ⅸ-Ⅻ的混和物的色譜;
圖26的表示類似圖7的光譜圖，其為化合物Ⅸ-Ⅻ(其色譜示於圖25)的混合物的光譜圖;
圖27表示類似圖1的色譜圖，其為由H.rooperi衍生的化合物Ⅰ-Ⅳ的色譜，該化合物是化合物Ⅴ-Ⅷ(其色譜見圖3)通過β-D-葡糖苷酶在PH＝5.5時水解的產物，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅰ12.31Ⅱ14.88(Ⅲ+Ⅳ)13.53圖28表示類似圖1的色譜圖，其為化合物Ⅰ和它的半合成二硫酸化產物化合物ⅩⅦ的混和物的色譜，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅰ12.29ⅩⅦ8.95圖29表示類似圖14光譜圖，其為化合物Ⅰ和ⅩⅦ的(其色譜見圖28)的光譜，化合物Ⅰ吸收波長最大處分別在210.5-214.5nm，258.5-262.5nm和290.5-294.5nm，而吸收波長最小在234.5-238.5nm和282.5-286.5nm，而化合物ⅩⅦ吸收波長最大在204.5-208.5nm和254.5-258.5nm，且吸收波長最小在226.5-230.5nm;
圖30表示類似圖1色譜圖，其為化合物Ⅱ與半合成的化合物ⅩⅧ(為化合物Ⅱ的二硫酸化結合產物)的混和物的色譜，保留時間是化合物保留時間(分鐘)Ⅱ14.86ⅩⅧ9.07圖31表示類似圖14光譜圖，其為化合物Ⅱ和ⅩⅧ(其色譜見圖30)的光譜，化合物Ⅱ的吸收波長最大分別在200.5-204.5nm和258.5-262.5nm，吸收波長最小在222.5-226.5nm，而化合物ⅩⅧ吸收波長最大在198.5-202.5nm和254.5-258.5nm，吸收波長最小在220.5-224.5nm，與化合物Ⅱ相比較，二硫酸化產物-化合物ⅩⅧ的吸收光譜呈現出較短波長方面位移;
圖32表示類似圖1色譜圖，其為化合物Ⅰ-Ⅳ和它們半合成二硫酸化結合物化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ的混和物的色譜，將化合物Ⅰ-Ⅳ的混和物二硫酸化即得其結合物，該圖說明化合物Ⅰ-Ⅳ的二硫酸酯即化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ共洗脫，保留時間是
化合物保留時間(分鐘)Ⅰ12.14Ⅱ14.80(Ⅲ+Ⅳ)13.51(ⅩⅦ+ⅩⅩ)9.00圖33表示HIV試驗研究結果的條形圖表，顯示經處置的治療體(本發明)和未經處置的治療體(對比)組內以Pg/ml表示的P24核蛋白含量的平均絕對變化情況;
圖34表示如圖33試驗性研究的條形圖表，但其為以細胞/μl表示的所述的處置及未處置組內選擇性淋巴細胞亞群的絕對平均變化狀況;及圖35表示如圖33試驗性研究的條形圖表，但其為所述組內所述細胞亞群的平均改變百分比。
實施例1化合物Ⅰ-XXⅧ的分析、定性及製備分離方法概要化合物的製備分離進行化合物的製備分離是採用製備性高效液體色譜法。
裝置使用Shimadzu儀器(Kyoto，Jopan)。它含有下列部件SCL-8A系統控制器，2XLC-8A流動相輸送泵，SPD-6AVUV-Vis分光光度檢測器，FCV-130AL容器注入控制器和FCV-100B餾分收集器。
用C8鍵合矽石(PartisilBioprep20μmC875A)填充製備色譜柱(50×300mm)，該矽石由Whatman購得(Fairfield，NewJorsey，U.S.A)。
操作條件包括流動相(水中15%的乙腈，V/V)的ioscratic輸送，其流速溶為100ml/min。檢測器設定在260nm波長，餾分收集設定為收集250ml等分試樣。進行樣品裝載時將樣品(5g)溶在水(50ml)中直接泵送到柱上，色譜柱已予裝載有水。Hypoxoside(化合物Ⅴ)和Hypoxoside的同種物[化合物(Ⅶ+Ⅷ)和Ⅵ]被依次洗脫，其起始是在8.5L的保留體積，獲得的餾分富集各自化合物達80-100%的質量純度。
半製備性分離和定性分析將標準的高效液體色譜(HPLC)技術(Kruger等人，J.Chromatography，1993，612，191-198)用於所有化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ的分析、定性和半製備性分離。
裝置使用HewlettPackard儀器(Waldbron，德國)。它含有下列部件HP1090M液色譜儀，它帶有二元DR5溶劑輸送系統和手動閥門注入器;HP1040二極體系統檢測器;HP79994A工作檯;HP310SPU帶彩色監視的程序處理儀器;HP9153C20MB溫徹斯特磁碟驅動器;AP2225Athinkjet印表機和HP7440AX-Y繪圖儀。
分析(色譜)柱(4.6×250mm)用5μm規則顆粒尺寸的尾端加蓋的C8鍵合二氧化矽(Whatman，Maidstone，英國)來填充，同時用薄膜的C18鍵合二氧化矽(Whatman)填充保護柱(2.1×75mm)。在線使用的提取前置柱(2.1×30mm)則用40μm顆粒尺寸的製備級C18鍵合二氧化矽來填充(AnalytichemInternational，HarborCity，CA)。
操作條件包括流速程控在1.5ml/min的線性溶劑梯度，起始時用的流動相A(0.05M KH2PO4)中加入10%V/V的流動相B(乙腈-異丙醇80∶20V/V)。將這種混和物保持1分鐘後形成流動相A和B的線性梯度，16分鐘後以70%V/V的B結束。柱溫度維持在50℃。
在線提取前置柱用樣品混合物(溶於50μl乙醇或至多200μl的水相)裝載並用含硫酸鈲鹽(8.05M)和硫酸銨(1.02M)的水溶液充至500μl。樣品引入前後用500μl的硫酸銨水液(0.5M)衝洗提取柱。然後將在線提取柱上截留的溶質在分析柱上以基於起始分析的流動相來洗脫。
程控二極體系統檢測器參數以監視260nm的信號並且也給出200-400nm的吸收光譜。
實施例2製備Hypoxis物種的無水甲醇提取物將洗滌後的Hypoxis種球莖切碎，切碎物置於乾燥託盤並於70℃經3.5小時在對流烘箱中脫水。將切碎物磨成200目細粉，得棕色細粉末(12.5Kg球莖得大約5.0Kg乾粉)。幹磨粉(5.0Kg)用甲醇(25L)於室溫經30分鐘攪拌來提取。過濾淤漿，真空蒸發棕色清液得1.25Kg淺棕色Hypoxis種球莖提取物，其始終含有45-50%m/m的Hypoxoside和其同種物[化合物(Ⅴ-Ⅷ)]，而其中Hypoxoside(化合物Ⅴ)是主要成分(90-95%m/m)，其含量依所用的具體Hypoxis物種而定。
實施例3化合物Ⅴ-Ⅷ的製備分離(見圖1-2)化合物Ⅴ由Hypoxisrooperi的甲醇提取物中分離，然後用實施例1所述的製備性HPLC純化(見圖1)。
化合物Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)由Hypoxislatifolia的乙醇提取物中分離，然後，用實施例1所述製備性的HPLC技術提純。若必須進行這些化合物的進一步提純則採用使用實施例1所述標準化分析性HPLC系統(見圖2)的半製備性HPLC法進行。
實施例4化合物Ⅰ-Ⅳ的分離(見圖2)化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)分別作為化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)的酶水解產物的分離如下化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)(每種100mg)分別溶於乙酸鹽緩衝水液(10ml，0.1M，PH＝5.5)，且各加入β-葡糖苷酶(100mg)。該混和物於37℃培育4小時，之後將水解產物用乙醚(5ml)提取。用碳酸氫鈉水液(5ml，0.5M)洗滌乙醚提取液而後用無水硫酸鈉乾燥。氮氣流保護蒸發乙醚相分別得到5-10mg的化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)。每種產物用實施例2所述校準的分析HPLC系統以半製備性HPLC方法來提純。通過標準反相吸著技術從HPLC餾分中去除HPLC溶劑緩衝鹽並以低壓升華乾燥法獲得各種最終粉末產物。
實施例5化合物ⅩⅢ-XXⅧ的分離(見圖3-12)用製備性HPLC(見實施例1)技術純化Hypoxisrooperi球莖的甲醇提取物得一混和物，該混和物含有主要成分的化合物Ⅴ(90-95%m/m)，還得到少量的化合物Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)(見圖3)。將這種產物(1g)溶在於(200ml)中，並讓成年男性治療對象以單一劑量口服。隨後收集尿液並處置如下經柱床用甲醇和水對C18鍵合二氧化矽吸著劑材料(200g，40μm)進行予處理。使過濾的尿液(5L)流經吸著劑床，隨後依次用下列物洗脫水(400ml)，甲醇水液(10%V/V，400ml)，甲醇水液(30%V/V，800ml)，最後用甲醇(400ml)隨後用水(400ml)。
將甲醇水液餾分(30%V/V，800ml)用水(1600ml)稀釋，使其再次流經吸著劑床，該床隨後用水(400ml)最後用甲醇(400ml)洗脫。
真空下於50℃蒸發最終的甲醇溶液至含水剩餘物，將其低壓升華乾燥得代謝物ⅩⅢ-XXⅧ和內生的尿成分的混和物(1g)。取合適體積的這種剩餘物的過濾水溶液(10ml/ml)注入校準HPLC系統(見實施例1)的在線前置柱上，這樣便在柱的輸出端收集餾分A、B和C(見圖5-6)。採用標準反相吸著技術使這些餾分去除流動相緩衝鹽，再將其低壓升華乾燥為乾燥產物，即化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ混和物樣品。
實施例6化學合成硫酸鹽結合物硫酸吡啶鎓作為硫酸化試劑用於部分合成化合物Ⅸ-Ⅻ和化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ。
製備硫酸吡啶鎓試劑向無水乙酸乙酯(1L)和濃硫酸(25L，0.469mol)的混和物伴隨攪拌緩慢加入無水吡啶(50ml，0.620mol)。冷卻混和物，通過潷析從乙酸乙酯中分離生成的硫酸吡啶鎓沉澱，將其用部分無水乙酸乙酯漂洗並於60℃真空乾燥得85g產物(產率100%)。使該產物(85g，0.480mol)溶於無水二甲基甲醯胺(250ml)中得1.921M的硫酸吡啶鎓溶液，本文稱做硫酸吡啶鎓試劑。該試劑置於無水硫酸鈣(25g)上貯存在氣密的琥珀瓶內。Hypoxoside(化合物Ⅴ)和Hypoxoside同種物[化合物Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)]的過二硫酸化來分別製備化合物Ⅸ、Ⅹ和(Ⅺ+Ⅻ)向Hypoxoside(2g，0.0033mol)(見實施例3及圖1)的無水二甲基甲醯胺(130ml)溶液加入硫酸吡啶鎓試劑(70ml，0.135mol)，無水硫酸鈣(4g)和乙酐(13.2ml，0.14mol)，在氮氣氛下於25℃攪拌該混和物24小時。將反應混和物過濾得清液，攪拌清液並加入甲醇和異丙醇的混和物(600ml，1∶2V/V)，隨後加異丙醇(250ml)。連續攪拌使所形成的沉澱凝固並洗析除去溶劑混和物。將凝固的沉澱用異丙醇淋洗，然後溶於水(40ml)。向這個溶液攪拌加入甲醇(100ml)，隨後加氫氧化鈉的甲醇溶液(50ml，1M)使PH為7-11。所得沉澱通過過濾分離，用甲醇洗滌後溶於水(200ml)。將此溶液流經C18鍵合二氧化矽吸著劑顆粒床(顆粒尺寸40μm，床尺寸為內徑50mm長50mm)，該床已用甲醇和水作予調理。將另一份200ml水流經吸著劑床並與前面的洗脫液合併，得400ml硫酸化Hypoxoside的清澈的鈉鹽溶液。發現這一溶液能夠被低壓升華乾燥成白色產物(2g)。還發現通過添加乙醇(400ml)和乙酸乙酯(1200ml)可從洗脫液中沉澱出硫酸化Hypoxoside的鈉鹽。經過濾收集該沉澱，真空乾燥得白色乾燥產物。硫酸化Hypoxoside的鈉鹽易溶於水，與Hypoxoside(即化合物Ⅴ)不一樣，其對諸如C18鍵合二氧化矽顆粒的反相色譜介質幾乎或根本沒有親合力，甚至有水存在時亦是如此。以類似方式將化合物Ⅵ及(Ⅶ+Ⅷ)過硫酸化。
化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)硫酸化來分別製備化合物ⅩⅦ、ⅩⅧ和(XIX+XX)向化合物Ⅰ(100mg，0.00355mol)(見實施例4及圖2)的無水二甲基甲醯胺(2.2ml)溶液加入硫酸吡啶鎓試劑(1.5ml，0.00288mol)和乙酐(0.3ml，0.00318mol)。令該混和物於無水條件下在90-100℃保持30分鐘，冷卻，之後將其傾入冷水(40ml)並同時攪拌。隨後使該溶液流經C18-鍵合矽石吸著劑床(顆粒尺寸40μm)，該床已用甲醇和水依次進行予處理。
依次分別用下列物流經吸著劑床水(40ml)，碳酸氫鈉水液(40ml，0.1M)，水(40ml)和甲醇(10ml)，個別地收集甲醇餾分。真空下於50℃蒸發甲醇洗脫液得到含水剩餘物，將其低壓升華乾燥得0.07g的化合物ⅩⅦ。以同樣步驟從化合物Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)分別製備化合物ⅩⅧ和(XIX+XX)。
實施例7化學合成化合物ⅩⅢ(見圖13)將化合物Ⅰ經葡糖苷酸化而衍生化合物ⅩⅢ。化合物Ⅰ的二-β-葡糖苷酸通過傳統的Koenigs-Knorr反應而衍生，該反應包括在碳酸銀存在下將保護的溴代葡糖苷酸偶聯於糖苷配基。該保護的溴代葡糖苷酸，即(2，3，4-三-O-乙醯基-α-D-吡喃葡糖基-1-溴化物)糖醛酸甲酯，是按Bollenback等人所述方法製備的，見J.Amer.Chem.Soc.1955，77，3310-3315。
考慮到微量產量，產物不必製備性分離，但可按下文實施例8所示進行定性。
實施例8標準化HPLC工藝和酶水解(見實施例1)將化合物定性的一般工藝化合物的定性基於它們的絕對色譜保留時間，它們的保留時間彼此相關，還基於標準分析參數下所得到它們的二極體系統檢測器吸收光譜。發現在同一製造商的系列分析(色譜)柱上的大約30秒以內的保留時間可重複再現。二極體系統檢測器吸收光譜在檢測器分辨限度範圍內表面，且最大和最小吸收以波長範圍來表示，該範圍為4-6nm。
苯被用作參照化合物。甲醇內苯的分析以如下的關於標準化HPLC法來定性。
保留時間＝13.84分鐘最大吸收＝198.5-202.5nm和252.5-256.5nm最小吸收＝220.5-224.5nm化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的另一定性基於用β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶的選擇性酶水解來推斷。D-葡糖二酸-1，4-內酯(σ50375)(1mg/mg)和硫酸鈉(0.01M)用來分別選擇性抑制β-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶的活性，其中在大規模的酶製備中發現交叉反應。水解在乙酸鹽緩衝液(0.1M，PH5.5)中進行。
化合物Ⅰ-Ⅷ的定性(見圖1-2和圖14-22)由Hypoxisroopri甲醇提取物(見實施例2)製備的化合物Ⅴ(見實施例3)水溶液用標準HPLC方法(見實施例1)進行分析。化合物Ⅴ(見圖1)作為主要成分被分離，其保留時間是8.25分鐘，具有UV最大處分別在210.5-212.5;254.5-258.5和288.5-292.5nm(見圖17)。Marini-Bettolo等人在Tetrahedron，1982，38，1683-1687中援引的值是UV最大分別在258、291、298和310nm，這是在甲醇中測得的。化合物Ⅴ與鹼經歷不可逆反應，而酚基與鐵氰化鐵則進行正向反應。化合物Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)在Hypoxiolatifolia的乙醇提取物中更普遍存在，因此在由Hypoxiolatifolia得到的分離物中被較好地定性(見圖2)。
化合物Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)的UV光譜與化合物Ⅴ的光譜(見圖17-19)的類似性暗示出它們在結構上與化合物Ⅴ相關。
化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)通過PH＝5.5時被β-D-葡糖苷酸酶水解分別產生化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)，見圖2說明。
化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)及其同種物化合物Ⅰ，Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)的洗脫次序仍是分別相同的(見圖2)。從這點可推斷，就它們同種物上取代基而論，化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)彼此並不相同。因而從化合物Ⅴ到化合物(Ⅶ+Ⅷ)，然後到化合物Ⅵ保留時間的增加，以及分別從化合物Ⅰ到化合物(Ⅲ+Ⅳ)然後到化合物Ⅱ保留時間的增加，都與同種物上羥基數目減少是一致的。
由Hypoxislatifolia衍生的化合物Ⅱ與按照Drewes等人(Phytochemistry，1989，28，153-156)所述合成的E-1，5-雙(4′-羥苯基)戊-4-烯-1-炔相比較，考慮到保留時間和光譜特性的一致性(見圖23-24)，證實化合物Ⅱ中二對位羥基的存在。
化合物(Ⅲ+Ⅳ)的保留時間居於化合物Ⅰ和Ⅱ的中間意味著有三個羥基，可能的結構可由化合物Ⅲ和Ⅳ來代表，但還未在色譜上辨別(見圖2)。這種由Hypoxisrooperi衍生的三羥基化合物最可能的構型會是化合物Ⅲ的那一種構型，因Drewes等人在Phytochemistry，1989，28，153-156中給出了很好的證據，即當化合物由Hypoxisrooperi衍生時烯烴一側的酚環是個兒茶酚。
在圖14-22中分別說明的化合物Ⅰ-Ⅷ的光譜特性與一般的中央部位戊-4-烯-1-炔結構相一致。
比較光譜表明(見圖20-22)，通常的分析條件去糖苷會導至譜線向較短波長位移。
由水解帶來的保留位移和這些化學衍生物的羥基化程度可依據反相色譜保留機理來推斷。
化合物Ⅸ、Ⅹ和(Ⅺ+Ⅻ)的定性(見圖25-26)化合物Ⅴ-Ⅷ的部分硫酸化會導致大量的羥基硫酸化物，給出複雜的洗脫圖。然而在全部硫酸化的情況下，可以期待每種化合物具有充分確定三個洗脫峰。明顯的三峰圖樣確實在圖25中顯而易見，因此化合物Ⅸ、Ⅹ和(Ⅺ+Ⅻ)可認為分別是化合物Ⅴ、Ⅵ和(Ⅶ+Ⅷ)的十-、八-和九-硫酸化物。然而部分硫酸化產物通過降低關於被硫酸化的化合物的硫酸化試劑的摩爾比製備，可觀察到如所予料的複雜洗脫圖樣。
化合物Ⅸ、Ⅹ和(Ⅺ+Ⅻ)不易根據它們的色譜或光譜性質區分，這些化合物的混和物的定性反映在圖25和26中。這些化合物的初期洗脫與其增強的水溶性相關，同時它們保留了化合物Ⅴ-Ⅷ的光譜特性。可以預料，按實施例6方法製備的化合物Ⅹ和(Ⅺ+Ⅻ)將具有類似於化合物Ⅸ的硫酸化程度。
化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的定性(見圖3-12和27-32)化合物Ⅷ-ⅩⅩⅧ表示化合物Ⅴ-Ⅷ的生體轉化產物。它們被發現於攝入了化合物Ⅴ-Ⅷ後人體治療體的血清和尿中(見圖4-6)。能夠從下列觀察中注意到一定質量和數量的生化作用和活體內形成的結合化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ有關。這與通過合成和特定的酶水解證實結合物類型的方式合在一起，將有助於鑑別和定性這些化合物。
化合物Ⅴ-Ⅷ已表明在人體治療體腸道內被水解成化合物Ⅰ-Ⅳ，因為這些糖苷配基可在人的面容上檢測出來。因此化合物Ⅰ-Ⅳ自腸道吸收後可能是化合物ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的代謝前體。
從圖3和27中應注意到化合物Ⅴ-Ⅷ的相對量代表了它們水解產物即化合物Ⅰ-Ⅳ的相對量。示於圖27中化合物Ⅰ-Ⅳ的相對量則代表這些對腸吸收有用的糖苷配基的相對量。
以HPLC法將尿代謝物分離成餾分A、B和C已在圖6中說明，化合物Ⅰ-Ⅷ的吸收光譜特徵保留在代謝物的餾分中(圖7-9)。這就證明尿代謝物的餾分A、B和C有個共同的來源，即化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)。
代謝物餾分A、B和C在PH＝5.5時用β-D-葡糖苷酸酶和芳基硫酸酯酶完全水解產生了它們的結合物的圖形(見圖10-12)。化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)的保留時間和吸收光譜依然不變，不管其是植物提取物的水解產物還是代謝物提取物的水解產物。這可再次確定結合物基團的類型植物配基的β-D-葡糖醛酸和硫酸化物，即化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)。
餾分A、B和C的選擇性酶水解(見圖6)意示(ⅰ)餾分A主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ的二-β-D-葡糖苷酸，即分別是化合物ⅩⅢ-ⅩⅥ。
(ⅱ)餾分B主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ單硫酸化物-單-β-D-葡糖苷酸，即分別是化合物ⅩⅪ-ⅩⅩⅣ。
(ⅲ)餾分C主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ的二硫酸化物，即分別是化合物XⅦ-XX。
因此，結合物基團的類型似乎在反相色譜中是代謝物保留時間的主要決定因素。因而餾分B，化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)的混和結合物(為單-β-D-葡糖醛酸單硫酸化物)在保留時間方面居於它們的二-β-D-葡糖醛酸(餾分A)和它們的二硫酸化物(餾分C)的中間是合適的。
尿餾分A、B和C(見圖10-12)的結合物圖形並不含有作為攝入物質的相同相對量的化合物Ⅰ-Ⅴ(見圖3和27)，這就意示化合物Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)的選擇性吸收超過化合物Ⅰ，和/或意示化合物Ⅰ生體轉化成化合物(Ⅲ+Ⅳ)，然後隨著後來的結合作用生體轉化成化合物Ⅱ。
化合物Ⅰ(見圖28-29)、化合物Ⅱ(見圖30-31)和二硫酸化的化合物Ⅰ-Ⅳ的混和物(見圖32)的化學硫酸化作用產物產物的保留時間在尿代謝物餾分C(見圖6)的保留時間區域內，這一點由芳基硫酸酯酶使得主要含有化合物Ⅰ-Ⅳ的二硫酸化物的作用來表明。
芳基硫酸酯酶的化學合成二硫酸化物的水解產生它們各自的結合物，化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)。
化合物Ⅰ的化學葡糖苷酸作用(見圖13)產生兩種產物，其保留時間和吸收光譜相應於餾分A的兩個尿代謝物(吸收)峰(見圖5-6)。化合物Ⅰ的半合成葡糖苷酸可被β-D-葡糖苷酸水解。兩個化合物Ⅰ的葡糖醛酸產物可以代表或者間位或者對位的葡糖苷酸化作用，這點未經檢驗。
化合物Ⅰ、Ⅱ和(Ⅲ+Ⅳ)的所有結合物在它們的吸收光譜上與它們的結合物在通常分析參數條件下相比較顯示出向較低波長的位移。這一點，與它們是否是葡糖苷，葡糖苷酸或硫酸化物無關，也與是否為半合成或生物衍生無關。這些對照光譜可見於圖20-22，29和31。
化合物Ⅰ和(Ⅲ+Ⅳ)的代謝的和/或合成的結合作用發生在苯環間位的羥基上，導至更加多的結合產物的結合。然而可以確信，由於化學縮合作用，對位取代是優選的。
實施例9使化合物Ⅰ-XXⅧ經受體外試驗，用來抑制人體免疫缺乏1型病毒(HIV-1)增生，具體如下取血庫中健康志願者的血液經密度梯度離心沉澱得到人體外周血液淋巴細胞(PBL′s)，將它積存並用來體外繁殖HIV-1。
用植物凝血素(PHA)將PBL′s多克隆激活並使其經受質量控制，從而可用錐蟲蘭排除法和活化抗原的表達來檢驗它們的生存性，CD4+和CD25+用免疫螢光來測量。加入試驗物質之前，活化的PBL′s要接觸校準滴定度的HIV-1病毒液，培育60分鐘後洗滌細胞兩次並以2×106細胞/井的濃度鋪入微量滴定板。第4天介質含有中間白細胞-2並且在對比井內產生的病毒在50-100ng/ml的P24核心蛋白之間。將試驗物質根據其溶解特性或在水中或在二甲亞碸(DMSO)中加到這些培養體內。如用DMSO其最終的濃度總是1%V/V。
HIV複製的測量在第2、3和4天或第3、4、5和6天P24核心蛋白和HIVRNA的產生時進行。核心蛋白P24的測量用SandwichELISA技術，其中尤其使用抗P24核心蛋白的單克隆抗體。HIVRNA的測量使用特性標記的抗HIVRNA的DNA探針和雜交工藝。
結果以第3、4或第6天抑制HIV-1P24核心蛋白生成或RNA生成的百分數來表達。
試驗物質可能的毒性作用在實驗開始後第4天或第6天以用錐蟲蘭的生存性測試或用3-(4，5-二甲噻唑-2-基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓溴化物(MTT)的增生試驗來測量(Borenfreund等人Toxicol.lnVitro，1988，2，1-6)。
應當注意，以1%V/V的DMSO的劑量不能抑制HIV-1的複製。
藥物的毒性通過以MTT測量並與接受病毒但無藥物的對照組進行比較而表達為抑制淋巴細胞增生的百分數。
在每個試驗裡，細胞也要接觸HIV-1和3′-疊氮基-3′-脫氧胸苷(也叫作Zidovudine或AZT)，其濃度為100、10、1和0.1ng/ml。這是個陽性對照物並且試驗的化合物要和10ng/mlAZT的抑制作用相比較。
下列所有表格中，抑制百分數指的是相比於感染的對照物時對P24核心蛋白生成和HIVRNA生成的抑制。AZT抑制百分數指的是在實驗結束時即大約4或6天後以10ng/mlAZT所造成的抑制。
粗提取物將Hypoxisrooperi的無水甲醇提取物(見圖1)溶於二甲亞碸並加到試驗細胞中，其最終濃度為70μg/ml(DMSO的最終濃度是1%V/V)。培育4天後，P24核心蛋白的生成被100%的抑制而HIVRNA的生成則抑制85%。細胞增生在對比物的76%。10ng/ml的AZT使得P24核心蛋白的生成100%地抑制，而HIVRNA的生成則96%地抑制。
純化的化合物Ⅴ為了證實粗甲醇提取物的哪一成分參與了HIV-1增生的抑制，將HPLC提純的hypoxoside(見圖3)自身溶在水中進行試驗。下列結果是6天後用標準的HIV-1滴定度所獲得的表2
10ng/mlAZT對P24核心蛋白的生成抑制20%而對HIV-RNA的生成抑制68%。
使用同樣化合物Ⅴ樣品但將病毒滴定度降低十倍得到下列結果表3
10ng/mlAZT對P24核心蛋白和HIV-RNA的生成抑制99%。
化合物Ⅴ-Ⅷ在另個試驗中，使由Hypoxislatifolia分離的化合物Ⅴ-Ⅷ(見圖2)溶於水後進行試驗，培育3天和6天後所得結果如下表4(三天後)
10ng/mlAZT使P24核心蛋白的生成抑制50%而使HIV-RNA的生成抑制46%。
表5(6天後)
10ng/mlAZT對P24核心蛋白的生成抑制50%而對HIV-RNA的生成抑制46%。
化合物Ⅸ-ⅫHypoxoside(化合物Ⅴ)和它的結構相關化合物經硫酸化得化合物Ⅸ-Ⅻ，(見圖25)，試驗其抑制HIV-1的增生，6天後得結果如下表6(標準病毒滴定度)
10ng/mlAZT造成20%地抑制P24核心蛋白的生成且68%地抑制HIV-RNA的生成。
表7(稀釋10倍的標準病毒滴定度)
10ng/mlAZT造成99%地抑制P24核心蛋白和HIV-RNA的生成。
化合物ⅩⅦ化合物Ⅰ經硫酸化得化合物ⅩⅦ(見圖28-29)，試驗其對HIV-1體外增生的抑制，得如下結果表8(培育3天)
10ng/mlAZT造成5%地抑制P24核心蛋白生成且46%地抑制HIV-RNA生成。
續表8(培育6天)
10ng/mlAZT造成96%地抑制P24核心蛋白生成且96%地抑制HIV-RNA生成。
化合物Ⅰ-Ⅳ的混和物經硫酸化分別得化合物XⅦ-ⅩⅩ(見圖32)並將其培育6天得如下結果。
表9
10ng/mlAZT造成96%地抑制P24核心蛋白生成且92%地抑制HIV-RNA生成。
化合物ⅩⅧ化合物Ⅱ硫酸化得出化合物ⅩⅧ(見圖30-31)6天後得出如下結果。
表10
10ng/mlAZT造成96%地抑制P24核心蛋白生成且92%地抑制HIV-RNA生成。
活體內產生的化合物Ⅴ-Ⅷ的代謝產物口服攝入的Hypoxide(化合物Ⅴ)在大腸內被細菌的β-葡糖苷酶轉換成化合物Ⅰ。化合物Ⅰ排洩在糞便裡並也被吸收及由Ⅱ相型生體轉化成為硫酸化物和葡糖醛酸結合物(圖6中的餾分A、B和C)。餾分A主要含化合物Ⅰ-Ⅳ的二葡苷酸化物，即化合物Ⅷ-XVI，得出如下結果表11
10ng/mlAZT造成100%地抑制P24核心蛋白生成且97%地抑制HIV-RNA生成。
餾分A-C對化合物Ⅴ-Ⅷ的尿代謝物的餾分A，B和C(即化合物ⅩⅢ-ⅩⅥ(餾分A);化合物ⅩⅪ-ⅩⅩⅧ(餾分B)和化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ(餾分C)(見圖5-6)進行試驗，得到培育三天後的如下結果。
表12
10%ng/mlAZT造成50%地抑制P24核心蛋白的生成且46%地抑制HIV-RNA生成。
化合物Ⅴ-Ⅷ的尿代謝物餾分B(見圖6)被細分餾成兩個餾分。餾分V1是餾分B的上行半部而餾分V2是餾分B的下行半部。對這些餾分分別進行抑制HIV複製的測試，得到經4天和6天培育的如下結果。
表13
(ND＝未測定)10%ng/mlAZT抑制P24核心蛋白生成和HIV-RNA生成在4天和6天後為100%。
實施例10物料和方法治療體加入此項研究的所有治療體都呈HIV陽性，這是以通用的酶連接免疫吸附劑試驗(ELISA)所測定的，且其ELISA陽性結果已經過Western印跡技術證實。
被研究的人員包括18名兩種性別的治療體，其中7名志願者作為處置組(Hypoxis物種提取物處置，見實施例2)，而其餘11名治療體作為對比的非處置組。研究中的任何治療體皆不使用其他的抗反轉病毒試劑。在(為基準的)初診時抽取靜脈血樣(凝塊和全血EDTA)並以一個月的間隔再次抽取。
膠囊每個膠囊含200mg的Hypoxis種提取物(大約100mg的化合物Ⅴ-Ⅷ)並告知患者吞服這種膠囊每天三次每次兩個，即吞服總量為1200mg/天的提取物。
血液分析凝血用這種血樣藉助通常的捕獲ELISA藥具來定量血清HIV抗原血症。所用培育條件包括用甘氨酸-鹽酸緩衝液對每種血清樣品進行予處理，以便分離免疫復體。這就保證了所謂的總P24核心蛋白的測量。且使不僅是留在循環中的該核心蛋白因抗P24核心蛋白抗體而不呈複合態。結果以按照校準曲線確定的絕對值Pg/ml血清來表達。EDTA全血全血被用來通過單克隆抗體識別和定量淋巴細胞亞群。簡而言之，用單克隆抗體的混和物培育100μl血液，該抗體以如下所示的不同螢光染料標記CD3-FITC/CD4-PECD3-FITC/CD8-PECD3-FITC/CD19-PECD3-FITC/CD16+CD56-PECD8-FITC/HLA-Dr-PE這些混和物檢測下列細胞亞群名為T-輔助細胞;T-抑制因子;B-細胞;NK-細胞和激活的抑制因子細胞。
培育20分鐘後用溶胞溶液(FACS溶胞緩衝液)對血紅細胞溶胞，將細胞聚成球粒並用磷酸鹽緩衝鹽溶液(PBS)洗滌一次。細胞凝固在含0.5%V/V甲醛的500μlPBS內。
使用FACS筒形血細胞計數器評定細胞螢光。用530/30nm通頻濾光器測量FL1(螢光素)並且用585/42nm通頻濾光器測FL2(藻紅素)。使用Simulset軟體程序進行分析，該程序從分析門排除粒性細胞和單核細胞而自動設定淋巴細胞門。
所有結果皆以陽性淋巴細胞(即CD3和CD4或CD3和CD8共同表達的細胞)的百分數來表示。在這種方式中，CD4陽性單核細胞被排除在CD4+T-細胞的計算之外。同樣，CD8+天然殺傷(NK)細胞被排除在CD3+，CD8+T-抑制因子亞群之外。
絕對細胞數是根據用於全血的等分試樣的基礎血液學來進行計數的。從淋巴細胞不同計數的百分數中可計算陽性細胞的絕對值。這樣進行所有亞群的分析。
對這些亞群的基準值和接續值之間觀察到的變化可以如下方式分析患者的特殊亞群的絕對值為基線值＝X，測量同樣參數的第一個接續值＝X1，因此在這個參數的變化＝X1-X。
X1-X為正值表示所測參數增加。反之負值表示該參數在接續值和基線之間是減少。
計算兩個組內所有治療體的這個參數的平均變化，其結果或以平均絕對變化值或以相對於基線值的平均變化值百分數來表達。
結果血清病毒抗原血症(P24核心蛋白含量)血清P24核心蛋白的測定揭示出和經同樣的一個月周期時其平均P24核心蛋白含量升高17.9Pg/ml的對照組即未處置群體(n＝11)相比較，處置組(n＝7)顯示平均降低為-13.8Pg/ml。與之類似，分析2個月接續的P24核心蛋白含量時，處置組(n＝6)顯示平均增加2.5Pg/ml，這與非處置組(n＝4)平均增加31.4Pg/ml形成了有利的對比。這些結果以繪圖方式表現在圖33中。
應當注意，在處置持續較長周期的四個患者中採用該方法未檢測到P24核心蛋白含量，與此同時在未處置的任何治療體中這種降低或轉成負值的現象也不明顯。與此相反，未處置治療體顯現P24核心蛋白含量隨時間不斷增長。
淋巴細胞亞群照圖1所示，處置組患者(n＝7)的所分析的所有淋巴細胞亞群顯出非常有利的增加。確實，一個月後淋巴細胞總數的平均增加伴隨有下列細胞的一般性增加CD3+細胞(T細胞)，T-輔助細胞(CD4+)，T-抑制因子細胞(CD8+)，B細胞和NK細胞，以及表達細胞活性標記物的CD8+細胞(CD8+Dr細胞)餾分。在細胞亞群測量中的平均增加量有利地與用其他諸如AZT(在實施例9中陳述)和Didanosine的抗反轉病毒劑進行臨床診斷公布的結果形成比較。確實，Fiscd等人(NewEng.J.Med.1990，323，1009-1014)報導在他們用標準劑量(250mg/4hr)和減少劑量(100mg/4hr)的AZT處置30個月的處置組中，暫時平均增加25CD4+細胞/mm3血液。
另一方面，未處置組(n＝11)經同樣時期顯示了惡化的免疫參數(表14)。顯然可見，持續一個月後顯出絕大多數細胞亞群減少，這似乎是證實，這些患者的免疫狀態隨著如上報導的P24核心蛋白含量的明顯化而衰退。
表14持續1月後細胞亞群中平均絕對改變(對照各組)該值以絕對細胞/μl血液來表示。
正值結果表示相對基線值是增加的，而負值表示相對基線值是減少的。
組間差別不僅明顯地發生在比較平均絕對變化的時候，也反映了相對於基線值平均百分比的變化。為容易比較，這些數據列在圖34中。
用2個月持續的參數可以得類似結果。如從表15中所見，未處置組(n＝4)總是顯示CD4+、B細胞和NK細胞數的減少。其他細胞亞群稍示增加。然而在處置組，測量的所有參數在平均絕對變化以及平均百分比變化兩個方面都顯示恆定的顯著的增大(表15)。再者，在我們的處置組觀察到的平均絕對值變化可有利地與用AZT進行的其他臨床診斷所公開的數據形成對比。
表15持續2月後比較各組間細胞亞群的平均絕對變化該值以絕對細胞/μl血液來表示。
正值表示相對於基線值的增加，而負值表示相對於起始值的減少。
從實施例10中已顯出來自Hypoxis物種的提取物有抗HIV的體外活性，其可抑制HIV複製(P24核心蛋白生成)和HIV-RNA生成。
患者每日吞服1200mg的Hypoxis物種提取物，處置一個月以及兩個月後顯示出改進的免疫狀態，這個結果是大有希望的。所測量的免疫參數包括T-細胞(T-輔助細胞和T-抑制因子細胞兩者)，B-細胞和NK細胞增大的數目。與此同時，治療體血清中測量的P24核心蛋白的生成發生遲滯以及明顯減少。
另一方面，經相同時期的對照的未處置的治療體表現出總是惡化的免疫參數和P24核心蛋白血清含量的增大。這些治療體的CD4+細胞以及其他細胞亞群呈現持續減少，如同在其他抗HIV臨床診斷的表現一樣(Foulds等人，Drugs，1992，44，94-116和Prince等人;J.Acq.Immuno.Def.，1991，4，1227-1232)。
實施例11化合物ⅩⅧ抑制呼吸道融合病毒(RSV)將化合物ⅩⅧ加到在塑料管內以傾斜培養生長的Hep-2細胞中，分別獲得的最終濃度是50、100和200μg/ml。然後將培養液分別用高標準病毒劑量，十分之一的所說標準劑量，以及百分之一的所說標準劑量的呼吸道融合病毒(RSV)來接種。於33℃培育4天後用反相反差顯微鏡視覺觀測細胞，並記錄合胞體生成的程度，即含有三個或多個細胞核的單個細胞，其表示如下a＝0-25%，b＝25-50%，c＝50-75%和d＝75-100%的細胞含有三個或多個細胞核。
所得結果列於下面的表16中
表16存在和不存在化合物ⅩⅦ培育4天後合胞體生成程度
實施例12化合物ⅩⅦ對細胞巨化病毒(CMV)的作用將化合物ⅩⅦ加到初級胎兒纖維細胞的組織培養液中，分別獲得的最終濃度為50、100和200μg/ml。然後分別用高的標準病毒劑量的、十分之一所說標準劑量的和五十分之一所說標準劑量的細胞巨化病毒(CMV)接種這些培養液並培育4天。
以顯微鏡目視檢查培養液來測定CMV的細胞發病作用，根據是細胞全膨脹的程度，其中為a＝0-25%，b＝25-50%，c＝50-75%和d＝75-100%的受全膨脹影響的細胞。結果列於下面的表17。
表17培育4天後化合物ⅩⅦ對細胞巨化病毒的細胞治療效果程度的影響
在200μg/ml時8個培養液中有5個顯示了因化合物引起的毒性徵候。
權利要求
1.在製備處置人或動物治療體病毒感染的物質或組合物方面的一種化合物、物質或組合物的用途，該物質或組合物包含至少一種相應於通式(1)的化合物
其中R1、R、R3和R4可相同或不同並且選自-H，-OH，A，B，C和D，而且其中A=
B=
(其中任意1-3個-OSOθ3基團可選地用-OH取代)C=
和D=-OSOθ3，
2.根據權利要求1的用途，其特徵在於每個所說的通式(1)化合物中的R2和R3選自-OH，-H和D。
3.按權利要求1或2的用途，其特徵在於每個所說的通式(1)化合物中R1和R4選自-OH，A，B，C和D。
4.按權利要求1-3的任一項用途，其特徵在於每個所說通式(1)的化合物選自化合物Ⅰ-ⅩⅩⅧ，其具有的R1，R2，R3和R4按前文表1中所述。
5.按權利要求1-4所包括的任一項用途，其特徵在於至少一種所說通式(1)的化合物構成至少一植物物種的提取物的一部分，該植物物種是仙茅科(Hypoxidaceae)植物成員。
6.按權利要求5的用途，其特徵在於每個所說通式的(1)化合物構成自為仙茅科植物成員的至少一種植物物種的提取物的一部分。
7.按權利要求5或6的用途，其特徵在於提取物是來自至少一種植物物種，所說植物種為選自Hypoxis，Spiloxene，Curcuglio和Campynema植物屬的成員。
8.按權利要求7的用途，其特徵在於提取物來自至少一種植物種，該植物種選自Hypoxisnitida，H.obtusa，H.rigidula，H.villosa，H.interjecta，H.multiceps，H.nyasicaH.rooperiH.acuminata，H.latifolia，Spiloxeneschlechteri和其雜交物。
9.按權利要求5-8之任一用途，其特徵在於每個通式(1)的化合物選自化合物Ⅴ-Ⅷ，其中的R1、R2、R3、R4列於上文的表1。
10.按權利要求4的用途，其特徵在於每個通式(1)的化合物選自化合物Ⅰ-Ⅳ，其中的R1、R2、R3和R4列於上文表1。
11.按權利要求4的用途，其特徵在於每個通式(1)的化合物選自化合物Ⅴ-Ⅷ，其中R1、R2、R3和R4列於上文表1。
12.根據權利要求4的用途，其特徵在於每個通式(1)的化合物選自化合物Ⅸ-ⅩⅩⅧ。其中R1、R2、R3和R4列於上文表1。
13.根據權利要求1-12的任一項用途，其特徵在於病毒感染選自人體免疫缺乏症病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染。
14.根據權利要求13的用途，其特徵在於病毒感染是HIV感染。
15.一種用於處置人或動物治療體病毒感染的化合物、物質或組合物，該化合物、物質或組合物的特徵是其包括至少一種按照通式(1)的化合物
其中R1、R2、R3和R4可相同或不同並選自-H，-OH，A，B，C和D，其中A ＝
B ＝
(其中任意1-3個-OSO
基團可選地用-OH取代)C ＝
;以及D ＝-OSO
16.根據權利要求15的化合物、物質或組合物，其特徵在於其包括的至少一種化合物選自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列於上文表1。
17.根據權利要求16的化合物、物質或組合物，其特徵在於其包括的至少一種化合物選自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列於上文表1。
18.根據權利要求15-17的化合物、物質或組合物，其特徵在於其中的病毒感染選自人體免疫缺乏症病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染。
19.根據權利要求18的化合物、物質或組合物，其特徵在於病毒感染是HIV感染。
20.一種用作藥劑或藥品處置人或動物治療體病毒感染的化合物、物質或組合物，其特徵在於其包括至少一種按通式(1)的化合物
其中R1、R2、R3和R4可相同或不同且選自-H，-OH，A，B，C和D，而其中
B ＝
(其中任意1-3個-OSO
基團可選地用-OH取代)C ＝
;以及D ＝ -OSO
21.根據權利要求20的化合物、物質或組合物，其特徵在於其包括的至少一種通式(1)的化合物選自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列於上文的表1。
22.根據權利要求21的化合物、物質或組合物，其特徵在於其包括的至少一種化合物選自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列於上文表1。
23.根據權利要求20-22之任一項的化合物、物質或組合物，其特徵在於該病毒感染選自人體免疫缺乏病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染。
24.根據權利要求23的化合物、物質或組合物，其特徵在於病毒感染是HIV感染。
25.一種用作活性治療劑處置人或動物治療體病毒感染的化合物、物質或組合物，其特徵在於其包括至少一種按照通式(1)的化合物
其中R1、R2、R3和R4可相同或不同且選自-H，-OH，A，B，C和D，而其中A ＝
B ＝
(其中任意1-3個-OSO
基團可選地用-OH取代)C ＝
以及D ＝ -OSO
26.根據權利要求25的化合物、物質或組合物，其特徵在於它包括的至少一種通式(1)的化合物選自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列於上文的表1。
27.根據權利要求26的化合物、物質或組合物，其特徵在於它包括的至少一種化合物選自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R1、R2、R3和R4列於上文表1。
28.根據權利要求25-27之任一項的化合物、物質或組合物，其特徵在於所說病毒感染選自人體免疫缺乏病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染。
29.根據權利要求28的化合物、物質或組合物，其特徵在於病毒感染是HIV感染。
30.一種用於製備組合物、藥品或藥劑來處置人或動物治療體病毒感染的化合物、物質或組合物，其特徵在於它包括至少一種相應於通式(1)的化合物
其中R1、R2、R3和R4可相同或不同且選自-H，-OH，A，B，C和D，而其中A ＝
B ＝
(其中任意1-3個-OSO
基團可選地用-OH取代)C ＝
;以及D ＝ -OSO
31.根據權利要求28的化合物、物質或組合物，其特徵在於它包括的至少一種通式(1)的化合物選自化合物Ⅰ-XXⅧ，其中R1、R2、R3和R4列於上文表1。
32.根據權利要求31的化合物、物質或組合物，其特徵在於它包括的至少一種化合物選自化合物Ⅸ-XXⅧ，其中R1、R2、R3和R4列於上文表1。
33.根據權利要求30-32之任一項的化合物、物質或組合物，其特徵在於所說病毒感染選自人體免疫缺乏病毒(HIV)感染，呼吸道融合病毒(RSV)感染和細胞巨化病毒(CMV)感染。
34.根據權利要求33的化合物、物質或組合物，其特徵在於該病毒感染是HIV感染。
35.一種化合物，具有如下通式(1)
其特徵在於R1、R2、R3和R4相同或不同且選自-H，-OH，A，B，C及D，而其中
A＝
B ＝
(其中任意1-3個-OSO
基團可選地用-OH取代)C ＝
;以及D ＝ -OSO
條件是當R2和R3兩者選自-OH和-H時，R1和R4不是兩個-OH且R1和R4不是兩個A。
36.根據權利要求35的化合物，其特徵在於R2和R3選自-OH，-H和D。
37.根據權利要求35或36的化合物，其特徵在於R1和R4選自-OH，A，B，C和D。
38.根據權利要求35-37的化合物，其特徵在於該化合物選自按照式(1)的化合物Ⅸ-XXⅧ，其中的R1，R2，R3和R4列於上文表1。
39.一種處置人或動物治療體病毒感染的藥品或藥劑，其特徵在於它包括作為一種活性治療劑的至少一種如權利要求35-38之任一項所限定的化合物，與之一起的稀釋劑或載體。
40.根據權利要求39的藥品或藥劑，其特徵在於其存在的形式選自含有活性治療劑的片劑，粉劑，膠囊和液體，所述片劑和膠囊每個含20-50mg的活性治療劑，而粉劑和液體每劑含4-10mg/ml的活性治療劑。
41.一種通式(1)化合物的製備方法，該化合物選自化合物Ⅸ-Ⅻ且其中的R1、R2、R3和R4列於上文表1，該方法的特徵是它包括從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取選自化合物Ⅴ-Ⅷ的一種通式(1)的化合物，將提取的化合物過硫酸化，得到作為產品的所述的選自化合物Ⅸ-Ⅻ的化合物。
42.選自化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ且其中R1、R2、R3和R4列於上文表1的通式(1)的化合物的一種製備方法，其特徵在於它包括從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取選自化合物Ⅴ-Ⅷ的一種通式(1)的化合物，將所述提取化合物進行酶水解，得到選自化合物Ⅰ-Ⅴ的一種化合物，該方法進而包括將選自化合物Ⅰ-Ⅳ的所說化合物進行硫酸化，得到作為產物的選自化合物ⅩⅦ-ⅩⅩ的所說化合物。
43.一種為化合物ⅩⅢ且其中R1、R2、R3和R4列於上文表1的通式(1)化合物的製備方法，其特徵在於它包括從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取具有通式(1)的化合物Ⅴ，將化合物Ⅴ進行酶水解得到化合物Ⅰ，將所說化合物Ⅰ進行葡糖苷酸化，得到作為產物的所說化合物ⅩⅢ。
44.選自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅺ-XXⅧ且其中R1、R2、R3和R4列於上文表1的通式(1)的化合物的一種製備方法，其特徵在於它包括從為仙茅科植物成員的至少一種植物種中提取選自化合物Ⅴ-Ⅷ的至少一種通式(1)化合物，使人或動物治療體攝入該提取的化合物，收集攝入後治療體的尿，該尿含有作為選自化合物Ⅴ-Ⅷ的代謝物的選自化合物Ⅰ-Ⅴ和ⅩⅢ-ⅩⅩⅧ的所說化合物，自尿中提取所述的代謝物作為產物化合物。
45.根據權利要求44的方法，其特徵在於所說產物化合物作為所說化合物Ⅸ-XXⅧ部分多元混合物從尿中提取，選自化合物Ⅴ-Ⅷ的化合物作為化合物Ⅴ-Ⅷ的部分混和物從植物物種中提取。
46.根據權利要求41-45之任一項的方法，其特徵在於它包括每種產物化合物的分離和提純步驟。
47.一種選自化合物Ⅰ-Ⅳ和Ⅸ-XXⅧ且其中的R1、R2、R3和R4列於上文表1的通式(1)化合物，其特徵在於該化合物是採用權利要求41-46之任何一個方法而得到的。
全文摘要
本發明提供處置人或動物治療體病毒感染的化合物、物質和組合物，以及含有它們的藥品及藥劑。公開了處置這種病毒感染及用於製備處置病毒感染(特別是HIV感染)的物質和組合物的這種化合物、物質和組合物的用途。公開了新化合物，即1，5-雙取代的戊-4-烯-1-炔，其製備方法和用於處置人或動物治療體病毒感染的方法。該化合物可用通式(1)代表。
文檔編號C07H15/203GK1091291SQ93119070
公開日1994年8月31日 申請日期1993年9月7日 優先權日1992年9月7日
發明者R·W·裡賓堡, P·B·克魯格, P·J·D·布易克, C·F·迪沃斯阿爾布雷特 申請人:懷羅斯塔特(Na)有限公司