一種胰島素在製備抗膿毒症骨骼肌降解藥物中的應用的製作方法

2023-05-24 20:12:11

一種胰島素在製備抗膿毒症骨骼肌降解藥物中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種胰島素在製備抗膿毒症骨骼肌降解藥物中的應用，屬於膽管炎症藥物製備【技術領域】。該藥物為治療有效量的胰島素，注入量為2.4-4.8mU.kg-1.min-1，通過大量動物實驗，通過外源性的給予胰島素，可減少膿毒症時內毒素刺激下單核細胞TNF-a和IL-6的分泌，並抑制單核細胞核內NF-kB的表達，減少炎症介質的分泌，從而可有效降低嚴重膿毒症狀態下的骨骼肌蛋白降解率。
【專利說明】一種胰島素在製備抗膿毒症骨骼肌降解藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種胰島素在製備抗膿毒症骨骼肌降解藥物中的應用，屬於膽管炎症藥物製備【技術領域】。
【背景技術】[0002]急性膽管炎的重症類型(acute cholangitis severe type, ACST)是一種威脅生命的、起源於膽管的感染，存在著細菌易位和腸源性內毒素血症，其中，內毒素可直接或間接觸發機體的過度炎症反應，引起免疫功能紊亂，並造成機體高代謝狀態，最終導致多器官功能障礙甚至衰竭；且常伴發一個或多個臟器的功能障礙，容易發生膿毒性休克，及時解除膽道梗阻、通暢的膽汁引流、合理的抗生素應用是目前臨床治療ACST的三種基本方法。ACST時膿毒症發生率為100%，ACST發生膿毒症時，蛋白合成抑制和高分解代謝是其主要特點，骨骼肌蛋白作為人體最大氮庫，約佔機體細胞總重50%，其分解消耗對機體無疑會產生深遠的影響。膿毒症會涉及功能性厭食、貧血、脂肪及胰島素抵抗等非常複雜的代謝紊舌L使機體陷入負氮平衡，導致不良預後，膿毒症所引起的蛋白降解表現為「自噬性」和「強制性」特點，單純通過補充蛋白質或胺基酸並不能有效抑制骨骼肌蛋白的高降解。早期骨骼肌的分解代謝對機體有利，用於合成急性期蛋白，可為機體提供大量游離胺基酸，供肝臟合成功能蛋白和進行糖異生等，以使機體度過應激期；但後期大量的蛋白持續分解供能，引起負氮平衡及一系列併發症，導致全身炎症介質失控性「瀑布樣」釋放，多臟器功能受累，甚至死亡；ACST研究主要集中在如何更有效的阻斷或緩解嚴重的炎症反應，但對ACST所引起的機體高代謝研究甚少，僅僅停留在腸內或腸外營養支持方面，而膿毒症本身可導致外源性營養支持的不應性，嚴重影響病人預後。
[0003]膿毒症狀態下的骨骼肌高分解代謝是目前營養支持領域所面臨的一個難題，目前尚無一種有效的防治措施。80年代開始，調整分解代謝激素的分泌與改進合成代謝的代謝調理治療受到重視。生長激素等治療儘管可減少手術、創傷引起的中度分解代謝病人的骨骼肌蛋白降解，取得了一定的療效，但同時有較多的副作用，而且與創傷相比，膿毒症患者肌肉蛋白分解程度更加嚴重，生長激素並不能減輕這種傾向，為此，必須尋找更為有效的治療藥物。
[0004]目前有多項研究表明泛素一蛋白酶體通路(ubiquitin proteasomepathway ；UPP)是膿毒症骨骼肌蛋白降解的重要途徑之一。UPP是細胞質和細胞核內依賴於ATP、非溶酶體途徑的蛋白質降解通路，主要由三部分組成:①泛素:是標記靶蛋白降解的信號分子，由76個胺基酸殘基組成的多肽，相對分子質量約為8500，存在於所有細胞中；②泛素相關酶:包括泛素活化酶(El)、泛素偶聯酶(E2s)、泛素連接酶(E3s)、泛素鏈延長酶(E4)以及去泛素化酶，其中前三類負責活化，並介導泛素分子與特定靶蛋白結合，隨後在E4的作用下，形成能被蛋白酶體識別的降解信號一泛素鏈，其中E2 14k酶與骨骼肌蛋白降解關係密切；③蛋白酶體:泛素化蛋白的降解場所，其C2亞基為蛋白酶體的中心結構。當胰島素不足或胰島素抵抗將導致肌肉蛋白降解增加，且泛素-蛋白酶體的活性上調；泛素-蛋白酶體可通過降解胰島素受體底物(IRS)，從而產生胰島素抵抗；但對於糖尿病人，是胰島素的相對不足導致了泛素一蛋白酶體通路的激活，還是泛素蛋白酶體的活化引起或加重胰島素抵抗，或者二者互為因果，目前尚無定論。
[0005]胰島素的PI3K_Akt通路是胰島素髮揮生物學效應的關鍵通路，它不僅能調節細胞糖代謝，還可產生多種生物學效應，如糖原合成、蛋白質合成、葡萄糖轉運、抗脂肪分解、抑制細胞凋亡等，Akt/PKB為PI3K通路中的關鍵分子。最近有研究表明，在糖尿病大鼠中抑制PI3K途徑能增加泛素系統活性，導致肌肉蛋白分解，但膿毒症狀態下的胰島素PI3K路徑和泛素一蛋白酶活性間的作用尚無任何研究。
[0006]回顧80多年的胰島素研究的歷程，胰島素作用之多樣，機制之複雜，至今仍未完全闡明，現在所認識的胰島素的生理功能僅是其「冰山一角」，還存在諸多新功能等待人們發現與研究。探明胰島素對膿毒症狀態下泛素系統介導骨骼肌蛋白質分解的抑制作用及可能的信號傳導通路，將為胰島素在臨床膿毒症等嚴重應激狀態下的代謝調理治療提供理論依據。

【發明內容】

[0007]為了克服膿毒症中代謝調理治療過程中所存在的機理不明、蛋白分解程度嚴重的現狀，本發明提供一種應用胰島素調理並抵抗膿毒症機體尤其是骨骼肌高分解代謝治療方法，以滿足臨床膿毒症等嚴重應急狀態下的代謝調理治療。
[0008]本發明所述的藥物為治療 有效量的胰島素。
[0009]所述的胰島素的注入量為2.4-4.8mU.kg' mirT1。胰島素的注入量過低對骨骼蛋白降解影響較小，不能起到抗膿毒症骨骼肌蛋白降解，胰島素注入量多高，則會引起血糖含量過高，患者會出現不適症狀，因此，注入量控制在2.4-4.8mU.kg' mirT1，通過調節25%葡萄糖的輸注率(GIR)將血糖維持在5mmo/L左右；只有當血糖超過11.9mmol/L時才加用胰島素。
[0010]胰島素一直廣泛應用於臨床治療糖尿病，本發明通過大量動物實驗，通過外源性的給予胰島素，可減少膿毒症時內毒素刺激下單核細胞TNF-a和IL-6的分泌，並抑制單核細胞核內NF-kB的表達，減少炎症介質的分泌。內毒素、TNF-a等介質是直接或間接導致骨骼肌蛋白降解的重要誘導或調節因子，抑制炎症介質NF-kB途徑可有效降低嚴重膿毒症狀態下的骨骼肌蛋白降解率。
[0011]泛素-蛋白酶體通路是真核生物細胞質和細胞核內依賴於ATP、非溶酶體途徑的蛋白質降解通路，不僅能降解變性的、異常的或起短暫作用的蛋白質，而且能降解植物色素、轉錄因子、內膜蛋白和細胞周期蛋白等天然蛋白質，因而在轉錄水平的調節、蛋白質的降解、蛋白質穩定狀態的調節、程序性細胞死亡、細胞周期的控制和免疫介導等過程中起重要作用，其與膿毒血症所致肌肉萎縮等密切相關。膿毒症時細胞因子對骨骼肌蛋白合成起到抑制作用，如IL 一 6家族因子抑瘤素M通過UPP調節細胞周期蛋白Dl水平誘使骨骼肌細胞停滯在Gl期，抑制蛋白合成並誘導凋亡。膿毒症時骨骼肌蛋白降解增強，並多伴有嚴重的代謝性酸中毒，UPP上調是酸中毒時骨骼肌流失的蛋白質增加內在機制。
[0012]MG-132是最早用於研究的蛋白酶體抑制劑，其通過結構中的醛基和蛋白酶體催化中心20S的β I和β 2蘇氨酸殘基的-OH結合，形成一個半縮醛的結構，可逆性的抑制蛋白酶複合體的活性，應用MG-132後ACST膿毒症骨骼肌內UPP通路受到抑制，泛素、E2-14K、蛋白酶體C2亞基相關基因表達均降低，蛋白酶體C2亞基的蛋白表達亦降低，同時降低了骨骼肌蛋白降解率；而應用MG-132阻斷UPP通路後，再應用胰島素鉗夾ACST膿毒症大鼠正常血糖，結果骨骼肌蛋白降解得到進一步改善，UPP通路受到進一步抑制。蛋白酶體催化中心20S的β複合體酶分別具有類糜蛋白酶活性(ChTL)、類胰蛋白酶活性(TL)、蛋白酶樣活性，而目前蛋白酶體抑制劑主要抑制其中的一個或兩個來阻止蛋白的降解，如MG-132就只抑制類糜蛋白酶，對其他的兩個酶沒有影響。採用MG132對UPP進行幹預，發現MG132可以誘導人血管平滑肌細胞凋亡，凋亡率與MG132呈量效關係，泛素、E1、E2、E3、26S蛋白酶體mRNA的表達 均降低，與MG-132呈量效關係。低胰島素大鼠的UPP活性和骨骼肌蛋白分解顯著增加，蛋白酶體c2和c8亞基的表達也能被胰島素所抑制，從而使骨骼肌蛋白分解下降。經胰島素鉗夾正常血糖的ACST膿毒症大鼠，在基因水平上亦提示UPP活性受到抑制，且呈現出胰島素應用劑量上的依賴性。
[0013]胰島素髮揮生理作用的信號傳導通路中，IRS-1磷酸化是胰島素大部分生物學效應的啟動步驟，它下遊主要存在三條信號偶聯繫統，包括PI3K信號通路、G蛋白信號通路和大鼠肉瘤基因(RAS)信號連接通路。其中，胰島素的PI3K通路是胰島素髮揮生物學效應的關鍵通路，它不僅能調節細胞糖代謝，還可產生多種生物學效應，如糖原合成、蛋白質合成、葡萄糖轉運、抗脂肪分解、抑制細胞凋亡等，Akt/PKB為PI3K通路中的關鍵分子。膿毒症時Akt活性下降，而胰島素能激活Akt，從而抑制UPP活性表達。這一影響可能來源於胰島素受體水平、或胰島素受體底物-1水平；也可能是在Akt水平直接影響。而應用LY294002特異阻斷胰島素PI3K路徑後，完全阻斷了胰島素激活Akt的作用，ρ-Akt蛋白表達水平下降，而UPP活性明顯增強，骨骼肌蛋白降解增強，這表明激活PI3K-Akt通路是胰島素影響UPP活性的主要機制。
[0014]因此，胰島素是通過抑制UPP活性來降低ACST膿毒症大鼠骨骼肌降解率，通過本發明首次揭示了胰島素抑制膿毒症骨骼肌蛋白降解的機制，ACST膿毒症狀態下，胰島素能抑制骨骼肌降解，該作用可能是通過在基因和蛋白水平激活PI3K-Akt信號轉導通路，從而抑制UPP表達和活化而實現的。
【具體實施方式】
[0015]1.藥物製備
[0016]膜島素的給予量為2.4mU.kg-1.min_l和4.8mU.kg-1, min-1兩種規格。
[0017]2.建立動物實驗模型並分類
[0018]⑴實驗動物
[0019]選用二級清潔健康SD大鼠(浙江省實驗動物中心提供)40隻，雄性，體重227~385g，標準顆粒混合飼料(浙江省實驗動物中心提供)餵養，所有大鼠實驗期間禁食，靜脈給予葡萄糖 4.5mg.kg-1.min-1。
[0020]選用人外徑約0.9mm的硬膜外麻醉導管(規格F3，購於浙江海聖醫療器械有限公司)，並從近端(即鈍頭，含側孔)剪下長約5cm—段，遠端連接帶有封帽的注射組件，以用於頸外靜脈及膽總管置管。所餘另一段用於頸內動脈置管，其近端加熱並略拉長，使其變軟為平口，防止刺穿血管壁，遠端組件接微電腦數字式注射泵。[0021](2)大鼠正常血糖鉗夾模型製備
[0022]大鼠在ACST模型建立前6天，行右頸外靜脈、左頸內動脈置管備用。所有大鼠置管前禁食6小時，自由飲水。1%的戊巴比妥(50mg/kg)腹腔內注射麻醉，解剖出右頸外靜脈後，遠端結紮；剪開頸外靜脈，用眼科鉗夾住血管壁後置入外徑約0.9mm的硬膜外麻醉導管，深度約3~4cm，雙線固定不可拔出，導管由頸背部皮膚引出固定。300uL等滲鹽水(肝素40U/mL)氨節青黴素5g/L衝洗導管,後用80%?\^-1(含肝素30011/11^)充滿導管防止血液返流，肝素帽封口，為血糖檢測採血用。另一麻醉導管置入左頸內動脈直至主動脈弓，並經皮下延續至頸背，穿行於彈簧螺旋管內，彈簧一端用蝴蝶夾固定於頸背部皮膚，另一端固定於飼養籠外的支架上。導管外端接微電腦數字式注射泵，為造模術中輸液備用。待ACST模型建立後，將胰島素、25%葡萄糖分別用二個微電腦數字式注射泵由頸內動脈泵入，每30min經頸外靜脈抽血用血糖儀測定血糖濃度，並通過調節25%葡萄糖的輸注率(GIR)將血糖維持在5mmo/L左右；只有當血糖超過11.9mmol/L時才需加用胰島素。
[0023](3) ACST膿毒症大鼠模型建立
[0024]1%的戊巴比妥(50mg/kg)腹腔內注射麻醉，無菌條件下進人腹腔後，在膽總管距左右肝管匯合處Icm處離斷膽管，遠端結紮，近端插入直徑0.9mm的麻醉導管，插入深度6_，妥善固定矽膠管後經皮膚穿一小孔置於體外，逐層關腹。確定膽汁排出通暢後，嚮導管內緩慢注入大腸桿菌內毒素(055B5) 10mg/kg,再注射空氣0.2ml，然後用封帽封閉導管，隨即關腹。而對於假手術組，僅在無菌條件下進入腹腔，鈍性剝離膽總管周圍組織後即關閉腹腔。
[0025](4)動物分組
[0026]40隻SD大鼠按月齡、體重同窩飼養，隨機分為假手術組、ACST模型組、低劑量胰島素ACST模型組(胰島素給予量為2.4mU.kg-1.min-1)、高劑量胰島素ACST模型組(胰島素給予量4.8mU.kg-1.min-1), MG132 +高胰島素ACST模型組、MG132ACST模型組、LY294002 +高胰島素ACST模型組、LY294002ACST模型組，每組5隻。其中阻斷泛素一蛋白酶通路方法為，在內毒`素注射30分鐘後腹腔注射泛素一蛋白酶體特異性抑制劑MG132 (30mg/kg) (merck公司德國)；阻斷PI3K_Akt通路的方法為，在內毒素注射30分鐘後頸外靜脈注射PI3K特異性阻斷劑LY294002 (0.3mg/kg) (merck公司德國)。
[0027]3.檢測標本和方法
[0028]模型建立用藥後12小時分離雙側伸趾長肌、股四頭肌，進行離體-80°C冰箱凍存待測。主要指標檢測:高效液相一色譜分析法檢測伸趾長肌內3 -甲基組氨酸含量；real-time PCR法檢測伸趾長肌內編碼泛素、E2_14k和蛋白酶體C2亞基的mRNA表達變化。蛋白免疫印跡法檢測股四頭肌內蛋白酶體C2亞基的蛋白表達變化，以及胰島素信號傳導PI3K-Akt通路中p-Akt蛋白表達的變化。
[0029](I)高效液相一色譜分析法檢測伸趾長肌內3 -甲基組氨酸
[0030]①儀器、試劑美國安捷倫(Aglient Technologiesl200Series)高效液相色譜儀，486紫外檢測器，冷凍真空抽吸系統(北京博醫康實驗儀器有限公司)，Waters PICO-TAG分析柱(3.9X300mm)。甲醇、乙腈為德國Merck公司產品，乙酸鈉為英國BDH公司產品，3-MH為美國Sigma公司產品。
[0031]②樣品處理大鼠雙側伸趾長肌稱重後，分別移入含500ul3%三氯乙酸的2ml勻漿管內，高速勻漿，勻漿液移入0.5ml離心管，14000r (4°C )離心25min，吸取上清液，待用。取上清液30ul冷凍乾燥，再加50ul衍生試劑，在室溫下衍生反應20min後繼續冷凍真空乾燥，進樣前以50ul流動相A液稀釋，進樣20ul。
[0032]③色譜條件流動相A:1000ml超純水內含9.54g乙酸鈉，25ml乙腈，250ul IOmmolEDTA，用10%乙酸調pH值為6.50。流動相B:450ml乙腈加400ml超純水和150ml甲醇。衍生試劑:異硫氰酸苯酯(PITC):甲醇:乙醇:三乙胺:水=1:6:1:1:1。紫外波長254nm，柱溫 46°C。
[0033](2)Real-time PCR檢測伸趾長肌內編碼泛素、E2_14k和蛋白酶體C2亞基的mRNA表達變化
[0034]①肌組織內總RNA的提取
[0035]將50mg伸趾長肌在液氮中磨成粉末後，加入1ml RNA提取液(Trizol:北京艾德萊生物科技有限公司)內高速(32000r / min)勻漿，4°C、10000Xg離心lOmin，取上清液按Iml Trizol液加入0.2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒，4°C、12000Xg離心15min,取上層水相,按每ImlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇，4°C、12000 Xg離心IOmin0棄上清液，按每ImlTrizol液加入至少Iml的比例加入75%乙醇進行洗滌，4°C、7500X g離心lOmin，洗滌沉澱，棄上層75%的乙醇溶液。讓沉澱的RNA在室溫下自然乾燥5min，加50ul的0.01%焦碳酸二乙酯(DEPC，美國Genview公司)溶解RNA沉澱60°C IOmin, _70°C保存備用。
[0036]②反轉錄成cDNA
[0037]根據RT-PCR試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)說明書進行反轉錄，每樣本均加入lug RNA，將混合好的液體放置在PCR儀中，輕輕混勻，42°C孵育50min，65°C加熱15min失活TUREscript H—Rtase，將反轉錄產物cDNA置於一 20°C冰箱保存備用。
[0038]③PCR反應
[0039]實時螢光定量PCR在羅氏ROCHE實時螢光定量PCR儀上進行，採用real_timePCR試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)說明書進行操作。PCR擴增體系50ul，雙蒸水50ul，Tag DNA聚合酶0.5ul，上下遊引物各lul，cDNA模板2ul。PCR引物:參閱相關文獻，並通過Genebank檢索，以Primer5.0軟體設計大鼠泛素引物序列、作為內參照的大鼠管家基因GAPDH引物序列、大鼠E2-14k和蛋白酶體C2亞基的引物序列，由上海激活生物科技公司合成。引物序列分別如下:(1)泛素(ubiquitin, Ub):擴增片段為156bp,5』 -TAAGAC CAT CAC CCT CGA TT-3』(正義鏈)；5』 -TGG ATG TTG TAG TCA GAC AGG G-3』(反義鏈)；(2)三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH);擴增片段為309bp，5』-TCC CTC AAG ATT GTC AGCAA』-3(正義鏈);5，-AGA TCC ACA ACG GAT ACA TT-3，(反義鏈);(3) E2_14k:擴增片段為 251bp，5』-TTATGAAGGTGGCTATTATC-3』(正義鏈)，5』 - TCGTGAAGTCCGATGTCT-3』(反義鏈)；(4)蛋白酶體C2亞基:其擴增片段為234bp:5』 -AGCAAGGCTCAGCGACAG-3』(正義鏈)，5』 -GGCGAGATACGGGAAGTG-3』(反義鏈)。將PCR反應體系置手掌型離心機內數秒鐘離心混勻後，置PCR儀(羅氏ROCHE實時螢光定量PCR儀)內。反應參數為94°C預變性2min ;然後進行40個循環的反應，每一循環包括變性94°C，30sec，退火60°C，30sec,延伸72°C，30sec,最後72°C IOmin結束反應。以假手術組大鼠肌肉組織各mRNA表達量為參照量，採用2_AAc;t法計算各模型組肌肉組織對應mRNA相對表達量ΛΛ Ct= (Ct目的基因一 Ct管家基因)模型組一(Ct目的基因一 Ct管家基因)假手術組。表示模型組目的基因的表達相對於假手術組的變化倍數，使用Iightcycler 480 sofeware 1.5軟體分析。
[0040](3) Western blot測定骨骼肌組織C2亞基蛋白的表達以及胰島素信號傳導PI3K-Akt通路中p-Akt蛋白表達的變化。
[0041]①蛋白樣本的製備
[0042]將股四頭肌組織塊稱重，利用液氮、研缽粉碎組織，每克組織加入3ml RIPA蛋白裂解液，超聲波粉冰浴勻漿破碎。然後4°C、13000r / min離心15min，將上清液移至1.5mlEP管中，一 80°C冰箱中儲存待用。
[0043]②蛋白定量取IOOul股四頭肌蛋白樣品通過BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。
[0044]③蛋白質聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PAGE)電泳與轉膜參照文獻。
[0045]電泳:配製10%分離膠10ml，灌注分離膠至玻璃夾層中，室溫聚合60min。配製4%的積層膠，灌注積層膠置玻璃夾層中，插入梳子至積層膠溶液中，室溫聚合30min。用5XSDS-PAGE蛋白上樣緩衝液按1:4稀釋蛋白樣品，100°C沸水浴中變性5min。以IXTAE電泳緩衝液充滿電泳槽，將玻璃板放入電泳槽，小心拔出梳子。加樣孔中加入蛋白樣品(固定蛋白總量)後連接電源，調節電壓90V，電泳約Ih後，當溴酚藍染料從積層膠進入分離膠，調節電壓至120V，繼續電泳至溴酚藍到達凝膠底部為止關閉電源，取出凝膠。
[0046]轉膜:電泳結束後將取下的凝膠在適量的轉移緩衝液中室溫平衡30min。裁剪一張與凝膠大小一樣的聚偏氟乙烯(PVDF)膜及4張3麗濾紙，並以適量的轉移緩衝液平衡lOmin。電轉裝架，從負極到正極方向依次為:濾紙一凝膠一PVDF膜一濾紙，逐層疊放，壓平並排除氣泡。
[0047]④免疫化學發光法檢測目的蛋白質
[0048]I XTBST洗滌PVDF膜3次，每次lOmin，室溫輕柔搖動。用微型臺式真空泵吸盡洗滌液，加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60分鐘。用含5%的脫脂奶粉溶液稀釋純化的一抗(工作濃度1:2500，abeam公司，英國)，與PVDF膜孵育，4°C振蕩孵育過夜。I X TBST洗滌PVDF膜3次，每次lOmin，室溫輕柔搖動。用含5%的脫脂奶粉溶液稀釋HRP標記的二抗(工作濃度1:5000，Jackson公司，美國)，與PVDF膜孵育2h，室溫輕柔搖動。I X TBST洗滌PVDF膜3次，每次lOmin，室溫輕柔搖動。應用UltraECL底物化學發光檢測試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)進行蛋白檢測，於暗室中將顯色劑A、B各0.5ml混勻室溫平衡lmin，加入PVDF膜。用平頭鑷子將膜取出，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，以去除膜上多餘的液體。膜的蛋白面朝上，置於潔淨保鮮膜。用吸管將配製的發光檢測液轉移到蛋白膜上，使其均勻覆蓋，室溫孵育1-2分鐘。用平頭鑷夾持蛋白膜，膜的下緣輕輕接觸吸水紙，以去除膜上多餘的液體。膜的蛋白面朝上，包裹於潔淨保鮮膜內。輕輕趕出其間的氣泡，固定在X片暗盒內。在暗室中取一張X片直於包裹的I旲上，合上暗盒，曝光I分鐘。將曝光後的X線片置於顯影液中，輕輕晃動數十秒後放人定影液中，稍後開燈觀察結果，掃描膠片，結果應用IMAGE J2X軟體分析WB條帶，根據電泳條帶的面積和平均灰度，計算樣本的灰度值(面積X平均灰度)，計算目的蛋白相對表達量:目的蛋白條帶灰度值/內參GAPDH灰度值。
[0049]4.統計學結果分析
[0050]採用SPSS11.0軟體進行多組間單因素方差分析，計量資料以表示，各組間兩兩比較採用LSD-t檢驗；而1111?^相對表達量數據呈偏態分布，故採用中位數結合範圍表示，組間比較採用Mann-Whitney U檢驗。P〈0.05或P〈0.01表示差異具有統計學意義。
[0051](I)伸趾長肌內3-MH含量的變化(見表1)
[0052]ACST模型組大鼠伸趾長肌內3-MH含量為(3.69 土 0.20)nmol/g，較假手術組(2.07 士 0.13)nmol/g顯著升高(P=0.000);顯著高於高胰島素ACST模型組(2.39 土 0.21)nmol/g(P=0.000)和低胰島素 ACST 模型組(2.87 土 0.19) nmol/g (P=0.000)。MG132 +高胰島素ACST模型組大鼠伸趾長肌內3-MH含量為(2.09 土 0.19) nmol/g和MG132ACST模型組(2.32 土 0.18)nmol/g 較 ACST 模型組均顯著降低(P=0.000,0.000) ? LY294002 + 高胰島素 ACST 模型組為(3.63 土 0.11) nmol/g、LY294002ACST 模型組為(3.62 土 0.17) nmol/g,與ACST模型組相比，差異均無統計學意義(P=0.607,0.546)。MG132 +高胰島素ACST模型組、LY294002 +高胰島素ACST模型組以及LY294002ACST模型組大鼠伸趾長肌內3-MH含量較高胰島素ACST模型組均顯著降低(P=0.011,0.000,0.000)。MG132ACST模型組骨骼肌內3-MH含量與高胰島素ACST模型組相比，差異無統計學意義(P=0.523)。而MG132+高胰島素ACST模型組與MG132ACST模型組比較有統計學差異(P=0.049)。
[0053]表1大鼠伸趾長肌內3-MH含量(Ι±^，n=5)
[0054]
【權利要求】
1.一種胰島素在製備抗膿毒症骨骼肌降解藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於:所述的藥物為治療有效量的胰島素。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於:所述的胰島素的注入量為2.4-4.8mU.kg—1.mirf1。
4.一種抗膿毒症骨骼肌降解的藥物，其特徵在於:所述的藥物為治療有效量的胰島 素。
5.如權利要求4所述的一種抗膿毒症骨骼肌降解的藥物，其特徵在於:所述的胰島素的注入量為 2.4-4.8mU.kg' mirT1。
【文檔編號】A61P29/00GK103721246SQ201310694178
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月17日 優先權日:2013年12月17日
【發明者】魯葆春 申請人:紹興市人民醫院