一種抗柯薩奇病毒a16型的單克隆抗體的製備及其應用的製作方法

2023-05-24 04:24:21

一種抗柯薩奇病毒a16型的單克隆抗體的製備及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗柯薩奇病毒A16型的單克隆抗體的製備及其應用。揭示了一種鼠源的抗CA16的單克隆抗體，其具有良好的結合特異性，能夠應用於靈敏地檢測柯薩奇A16型病毒，具有強大的抗病毒感染能力。
【專利說明】-種抗柯薩奇病毒A16型的單克隆抗體的製備及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物技術和免疫學領域；更具體地，本發明涉及一種抗柯薩奇病毒 A16型的單克隆抗體的製備及其應用。

【背景技術】
[0002] 柯薩奇病毒A16型（Coxsackievirus A16, CA16)屬於小RNA病毒科腸道病毒屬， CA16是手足口病化and, foot and mouth disease, HFMD)的主要致病原之一，CA16感染的 多數患者臨床病症較輕微，大多能自愈，包括發熱、口腔潰瘍、手足部紅色瘡疹。但越來越多 的證據顯示CA16感染也能引起神經系統損傷等重症，甚至導致死亡。目前尚未有治療CA16 感染的抗病毒藥物，疫苗也還處於研發階段。部分原因是因為缺乏可用於CA16定性和定量 分析的試劑，如CA16特異性抗體。
[0003] 近期，本發明人製備了基於病毒樣顆粒的CA16新型疫苗，該疫苗能在小鼠體內引 起較好的中和抗體反應，所產生的抗血清在CA16病毒攻擊實驗中能夠有效保護小鼠（Liu Q等，Vaccine20120ctl9; 30(47) : 6642-8)。其他研究小組報導了 CA16滅活病毒免疫小鼠 所產生的中和性抗血清也能使小鼠在一定程度上抵抗致死劑量的病毒攻擊Ofao Q等，J Virol. 2012NOV; 86 (22) : 11967-76)。該些結果表明中和抗體在體內可W抵抗CA16病毒感 染，提示可W通過製備中和性單克隆抗體的策略來開發針對CA16感染的預防和治療性藥 物。但是，目前現有技術中並沒有針對CA16的單克隆抗體，只有多克隆抗體，即抗血清。
[0004] 綜上，製備出特異性良好的抗CA16單克隆抗體，對於開發針對CA16感染的檢測試 劑盒W及治療性單抗藥物是必不可少的，將為有效預防和控制手足口病提供重要幫助。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在於提供一種結合分子，其特異性結合柯薩奇病毒A16型；並且，其 完全抑制細胞病變的濃度低於Ing/ml。
[0006] 在本發明的第一方面，提供一種分離的結合分子，所述結合分子包含W下的氨基 酸序列記69 10^:8所示的重鏈〔031，569 10^:9所示的重鏈〔01?2和569 10^:10所 示的重鏈CDR3, SEQ ID NO: 14所示的輕鏈CDR1，SEQ ID NO: 15所示的輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16所示的輕鏈CDR3。
[0007] 在一個優選例中，所述的結合分子包含重鏈可變區，所述的重鏈可變區具有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。
[0008] 在另一優選例中，所述的結合分子包含輕鏈可變區，所述的輕鏈可變區具有SEQ ID NO:4所示的胺基酸序列。
[0009] 在另一優選例中，所述的結合分子包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其重鏈可變區 和輕鏈可變區分別具有SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4所示的胺基酸序列。
[0010] 在另一優選例中，所述的結合分子包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，其重鏈恆定區 具有SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列；或其輕鏈恆定區具有SEQ ID N0:20所示的胺基酸 序列。
[0011] 在另一優選例中，所述的結合分子結合柯薩奇病毒16型的E顆粒和F顆粒。
[0012] 在本發明的另一方面，提供編碼所述的結合分子的核酸分子。
[0013] 在本發明的另一方面，提供所述的結合分子在製備用於檢測、治療和/或預防柯 薩奇病毒A16型感染的藥物中的用途。
[0014] 在另一優選例中，所述的結合分子識別的是構象表位。
[0015] 在本發明的另一方面，提供一種表達載體，所述表達載體中含有編碼所述的結合 分子的DNA。
[0016] 在本發明的另一方面，提供一種宿主細胞，所述宿主細胞中含有所述的表達載體。
[0017] 在本發明的另一方面，提供一種組合物，它含有所述的單克隆抗體，W及藥學上可 接受的載體。
[0018] 在另一優選例中，所述的組合物中，所述的單克隆抗體是有效量的。
[0019] 在本發明的另一方面，提供一種檢測柯薩奇病毒A16型的試劑盒，其包括所述的 結合分子。
[0020] 在本發明的另一方面，提供一種抑制柯薩奇病毒A16型的方法，所述的方法包括 給予患者有效量的所述的結合分子。
[0021] 在本發明的另一方面，提供一種檢測柯薩奇病毒A16型的方法，利用所述的結合 分子與待測樣品進行接觸，通過檢測所述的結合分子與受試樣品的結合情況，獲得柯薩奇 病毒的存在情況W及存在量。
[0022] 本發明的其它方面由於本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1、10%還原SDS-PAGE鑑定從腹水中純化的單抗9B5的純度和分子量，其中，重 鏈約為50邸a,輕鏈約為25邸a。
[0024] 圖2、免疫英光染色，9B5可W如CVLP抗血清（Liu Q等， Vaccine20120ctl9; 30 (47) : 6642-8) -樣特異性地檢測到感染細胞的CA16,而且綠 色英光信號定位在細胞質。無關的抗皿sAg單抗2G9(參見Ku Z，化i J等，J Virol Methods2012Dec ; 186 (1-2) : 193-7)則檢測不到相應的信號。
[00巧]圖3、50ng的9B5包板，可W捕獲滅活的CA16病毒和病毒樣顆粒。9B5-Biotin稀 釋兩萬倍可W檢測到低至0. 〇25ng/ul的CA16滅活病毒和病毒樣顆粒，對EV71卻無任何交 叉反應。
[0026] 圖4、9B5可W特異檢測出5#26#血清中的CA16-IgM抗體，而未與被EV71特異 性抗體血 5(參見 Ku Z，aii J 等，J Virol Methods2012Dec;186(l-2):193-7)檢測出的 38#53#64#173#EV71-IgM血清出現交叉反應。
[0027] 圖5、注射2ug和lOug的9B5均可W預防小鼠被CA16感染，對照抗體和PBS組在 小鼠攻毒後H天開始出現臨床症狀，並逐步嚴重，繼而開始痛疾及死亡，存活率分別為43% 和29%，而9B5單抗組，不但未出現小鼠死亡，而且所有小鼠未出現任何症狀。
[002引圖6、小鼠感染CA1624小時後，注射9B5及對照抗體2G9來治療，對照抗體和PBS 組在小鼠攻毒後四天後開始反應遲緩，第五至六天出現共濟失調、腿無力症狀繼而開始痛 疾及死亡，存活率分別為43%和29%，而9B5組未出現小鼠死亡，僅個別小鼠在第7天有輕微 反應遲純症狀，但很快消失。
[0029] 圖7、小鼠感染CA1672小時後，注射9B5及對照抗體2G9來治療，對照抗體和PBS組 在小鼠攻毒後出現共濟失調、腿無力症狀繼而開始痛疾及死亡，存活率分別為37%和42%， 而9B5組未出現小鼠死亡，亦未出現臨床症狀。
[0030] 圖8、小鼠感染CA16120小時後，出現2級及3級症狀的小鼠再注射9B5及對照抗 體2G9來治療，9B5組小鼠症狀得到緩解並逐漸消除，存活率也提高至85%，而對照抗體和 PBS組小鼠的症狀未緩解，出現痛疾及死亡，存活率分別為37%和28%。
[0031] 圖9、9B5重鏈序列。
[0032] 圖10、9B5輕鏈序列。
[0033] 圖11A、重組表達的單抗9B5 (9B5重組表達）與從腹水純化出的9B5 (9B5腹水純 化）一樣，可W特異性結合CA16滅活病毒，而表達的對照抗體（陰性對照；血5 (Ku Z，化i J 等，J Virol Methods2012Dec; 186 (1-2): 193-7)上清沒有結合信號。
[0034] 圖11B、重組表達的單抗9B5 (9B5重組表達）與從腹水純化出的9B5 (9B5腹水純 化）一樣，可W特異性識別感染細胞的CA16病毒，而對照單抗2G9卻檢測不到結合信號。 [00巧]圖11C、重組表達的單抗9B5 (9B5重組表達）與從腹水純化出的9B5 (9B5腹水純 化）一樣，可W中和CA16病毒，阻止細胞出現病變，而對照單抗上清不能中和病毒，細胞出 現嚴重病變。
[0036] 圖12、對照單抗2G9與CA16賠育後，不能阻止病毒結合至祀細胞上，而單抗9B5與 病毒賠育後，可W成濃度依賴性抑制病毒結合到細胞上。
[0037] 圖13、最低3. 125ug/ml的9B5即可完全阻止結合到祀細胞上的病毒感染細胞。

【具體實施方式】
[0038] 本發明人經過深入研究和篩選，獲得一種鼠源的抗CA16的單克隆抗體，命名為 9B5。本發明的單克隆抗體具有良好的結合特異性，能夠應用於靈敏地檢測柯薩奇A16型病 毒（CA16)，具有強大的抗病毒感染能力。
[00測結合分子
[0040] 本發明提供了能特異性結合柯薩奇病毒（較佳地位A16型病毒）的結合分子。
[0041] 在本發明的實施例中，經驗證，本發明的單克隆抗體能夠特異性結合CA16病毒的 E顆粒和F顆粒，能夠特異性檢測CA16感染的細胞，能夠檢測到低至0. 05ng/ul的CA16病 毒或病毒樣顆粒，可W特異性檢測出病人血清中的CA16特異性IgM抗體。並且，本發明的 單克隆抗體具有強大的抗病毒感染能力，體外中和實驗顯示其IC95為Ing/ml ;在致死劑量 CA16病毒感染小鼠前一天，腹腔注射9B5單抗能夠100%保護小鼠，顯示出很好的預防效果； 在致死劑量CA16病毒感染小鼠後一天及H天，腹腔注射9B5單抗也能夠100%保護小鼠，在 致死劑量CA16感染小鼠五天後，9B5依然可W減輕小鼠的臨床症狀並提高其存活率，表明 9B5具有很強的治療作用。綜上所述，9B5單抗不僅可W用來開發針對CA16的診斷試劑，而 且可W用於構建人源化單抗，W用於CA16感染所引起手足口病的預防和治療。
[0042] 本發明的結合分子可W是完整的免疫球蛋白分子，所述結合分子可W是抗原結合 片段，包括但不限於。油^(油'）^(油'）2、。￥、(1413、^1、互補決定區（〔0時片段、單鏈抗體 (scFv)、二價單鏈抗體、單鏈瞻菌體抗體、雙特異雙鏈抗體、H鏈抗體、四鏈抗體W及至少含 有足W賦予與柯薩奇病毒毒株的特異性抗原結合免疫球蛋白的片段的（多）膚或其片段。
[0043] 對於治療和/或預防柯薩奇病毒的方法而言，所述結合分子優選能特異性結合柯 薩奇病毒的表面可及蛋白質。在特定的實施方案中，本發明的結合分子能特異性結合柯薩 奇病毒的E顆粒和F顆粒。
[0044] 本發明還提供了所述的結合分子在製備診斷、預防和/或治療柯薩奇病毒感染的 藥物中的應用。本發明提供了可W中和導致柯薩奇病毒感染的結合分子。
[0045] CDR區是免疫學感興趣的蛋白質的序列。在本發明的實施方案中，結合分子可包含 本文掲示的二、H、四、五或者所有六個CDR區。優選地，本發明的結合分子包含本文掲示的 至少兩個CDR區。
[0046] 本發明的另一方面包括本文所述結合分子的功能變體。如果變體能與親代結合分 子競爭特異性結合柯薩奇病毒，則認為該變體分子是本發明結合分子的功能變體。換句話 說，所述功能變體仍能結合柯薩奇病毒。功能變體包括但不限於一級結構序列基本相似、但 是含有例如在親代結合分子中未發現的體外或體內化學和/或生物化學修飾的衍生物。該 種修飾包括己駄化、駄化、核巧酸或者核巧酸衍生物的共價附著、脂質或者脂質衍生物的共 價附著、交聯、二硫鍵形成、糖基化、輕基化、甲基化、氧化、聚己二醇化、蛋白酶解加工、磯酸 化等。換句話說，親代結合分子的胺基酸和/或核巧酸序列中的修飾不顯著影響或改變由 所述核巧酸序列編碼的或者含有所述胺基酸序列的所述結合分子的結合特性，即所述結合 分子仍能識別並結合其祀位。
[0047] 所述功能變體可W具有保守序列修飾，包括核巧酸和胺基酸取代、添加和缺失。該 些修飾可W通過本領域己知的標準技術導入，例如定向誘變和隨機PCR介導的誘變，並且 可包含天然W及非天然核巧酸和胺基酸。
[0048] 保守胺基酸取代包括其中胺基酸殘基由具有相似結構或者化學性質的另一氨基 酸殘基置換的取代。具有相似側鏈的胺基酸殘基的家族己經在本領域中限定。該些家族包 括具有鹼性側鏈的胺基酸（例如賴氨酸、精氨酸、組氨酸）、酸性側鏈胺基酸（例如天冬氨 酸、穀氨酸）、無電荷極性側鏈胺基酸（例如天冬駄胺、穀氨駄胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、 半膚氨酸、色氨酸）、非極性側鏈胺基酸（例如甘氨酸、丙氨酸、額氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、 脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸）、分支側鏈胺基酸（例如蘇氨酸、額氨酸、異亮氨酸）W及芳香 側鏈胺基酸（例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸）。本領域技術人員明白也可W使用除了上述 家族之外的其它胺基酸殘基家族分類方式。另外，變體可具有非保守的胺基酸取代，例如氨 基酸由具有不同結構或者化學性質的另一胺基酸殘基置換。相似的小變異也可包括胺基酸 缺失或者插入，或者該二者。使用本領域熟知的電腦程式可W發現確定哪些胺基酸殘基 可W被取代、插入或者缺失而不消除免疫學活性的指導。
[0049] 此外，功能變體可包含胺基酸序列在氨基末端或者駿基末端或者該兩端的截短 體。本發明的功能變體與親代結合分子相比可具有相同或不同的、更高或更低的結合親和 性，但是仍能結合柯薩奇病毒。優選地，可變區包括但不限於構架區、高變區或CDR區的氨 基酸序列被修飾。通常，輕鏈和重鏈可變區包含H個高變區，包括H個CDR，W及更保守的區 域，即所謂的構架區（(FR)。高變區包含來自CDR的胺基酸殘基和來自高變環的胺基酸殘 基。在本發明範圍內的功能變體與本文所述親代結合分子具有至少大約50%至大約99%、優 選至少大約60%至大約99%、更優選至少大約70%至大約99%、甚至更優選至少大約80%至 大約99%、最優選至少大約90%至大約99%、特別是至少大約95%至大約99%，W及特別是至 少大約97%至大約99%的胺基酸序列同源性。本領域技術人員已知的計算機算法如Gap或 者Bestfit可用於最佳地排列胺基酸序列W進行對比W及明確相似或相同的胺基酸殘基。 功能變體可W通過使用本領域己知的普通分子生物學方法改變親代結合分子或其一部分 而獲得，所述方法包括但不限於易錯PCR、寡核巧酸指導的誘變、定點誘變W及重鏈和/或 輕鏈改組法。在一個實施方案中，本發明的功能變體對於柯薩奇病毒具有中和活性。所述 中和活性與親代結合分子相比可W相同或者更高或更低。此後，當使用術語結合分子時，其 也涵蓋所述結合分子的功能變體。
[0050] 抗體的抗原結合特性可由位於重鏈和輕鏈可變區的3個特定的區域來描述，稱為 互補決定區（complementarity determining region，CDR),所述的CDR區將可變區間隔成 4個框架區域（FR)，4個FR的胺基酸序列相對比較保守，不直接參與結合反應。該些CDR形 成環狀結構，通過其間的FR形成的目摺疊在空間結構上相互靠近，重鏈上的CDR和相應輕 鏈上的CDR構成了抗體的抗原結合位點。可W通過比較同類型的抗體的胺基酸序列來確定 是哪些胺基酸構成了 FR或CDR區域。
[0051] 作為本發明的優選方式，所述的結合分子是單克隆抗體。所述的抗柯薩奇病毒 單克隆抗體的重鏈可變區、輕鏈可變區W及位於重鏈可變區和輕鏈可變區的互補決定區 (CDR)均具有獨特的不同於現有技術的結構。
[0052] 本發明包括；具有所述結合分子的相應胺基酸序列的單克隆抗體，具有所述結合 分子可變區鏈的單克隆抗體。本發明還包括具有含所述的互補決定區（CDR)的輕鏈和重鏈 的任何抗體，W及CDR區與本發明的CDR具有90% W上（較佳地95% W上）的同源性的任 何抗體。
[0053] 對於本發明的單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可W用常規方法測定。
[0054] 經驗證，本發明的抗柯薩奇病毒單克隆抗體的CDR區是全新的，其針對的是一個 獨特的柯薩奇病毒E顆粒或F顆粒上的抗原表位，技術構思不同於現有的抗柯薩奇病毒抗 體。
[00巧]另一方面，本發明包括免疫綴合物，即包含本文所述至少一個結合分子W及進一 步包含至少一個標記如可檢測的部分/物質的分子。本發明還涉及本發明免疫綴合物的混 合物或者至少一種本發明免疫綴合物與另一分子的混合物，所述另一分子如治療劑或者另 一結合分子或免疫綴合物。本發明的免疫綴合物可包含一個W上的標記。該些標記可W彼 此相同或不同，並且可W與結合分子非共價地結合/綴合。所述標記也可W通過共價鍵與 所述結合分子直接結合/綴合。或者，所述標記可W通過一或多種連接化合物與所述結合 分子結合/綴合。標記與結合分子的綴合技術為本領域技術人員所熟知。
[0056] 本發明的免疫綴合物的標記可W是治療劑，但是它們也可W是可檢測的部分/物 質。適於治療和/或預防的標記可W是毒素或者其功能部分、抗生素、酶、增強吞瞻作用或 者免疫刺激作用的其它結合分子。包含可檢測物質的免疫綴合物可診斷性地用於例如評定 對象是否己經感染柯薩奇病毒毒株或者作為臨床實驗程序的一部分監測柯薩奇病毒感染 的發生或進展W例如確定指定治療方案的功效。然而，它們也可W用於其它檢測和/或分 析和/或診斷目的。可檢測的部分/物質包括但不限於酶、輔基、英光材料、發光材料，生物 發光材料、放射性材料、正電子發射金屬W及非放射性順磁性金屬離子。為了檢測和/或分 析和/或診斷目的用於標記結合分子的標記依賴於使用的特定檢測/分析/診斷技術和/ 或方法例如免疫組織化學染色（組織）樣品、流式細胞計量術、雷射掃描細胞計量術檢測、 英光免疫測定、酶聯免疫吸附測定巧LISA)、放射免疫測定巧IA)、生物測定（例如吞瞻作用 巧1|定）、蛋白質印跡應用等。對於本領域已知的檢測/分析/診斷技術和/或方法合適的標 記為本領域技術人員所熟知。
[0057] 此外，本發明的結合分子或者免疫綴合物也可W附著於固體支持物上，其特別用 於柯薩奇病毒的體外免疫測定或者純化。該種固體支持物可W是多孔或者無孔的、平面或 非平面的。本發明的結合分子可W與標記序列融合W便於純化。所述標記序列的例子包括 但不限於六組氨酸標記、myc標記或者flag標記。或者，一種抗體可W與另一種抗體綴合 形成抗體異源綴合物化eterocon化gate)。
[0058] 另一方面，本發明的結合分子可W與一或多個抗原綴合/附著。優選地，該些抗原 是由給予了結合分子-抗原綴合物的對象的免疫系統識別的抗原。所述抗原可W彼此相 同，但也可W是不同的。使附著抗原和結合分子的綴合方法為本領域所熟知，包括但不限於 使用交聯劑。本發明的結合分子結合柯薩奇病毒並且附著於結合分子的抗原將引發對於所 述綴合物的有力T細胞攻擊，最終導致柯薩奇病毒的破壞。
[0059] 除了通過直接或間接（例如通過接頭）綴合而化學產生免疫綴合物之外，所述免 疫綴合物可W作為融合蛋白而產生，所述融合蛋白包含本發明的結合分子及合適的標記。 融合蛋白可W通過本領域已知方法產生，例如通過構建核酸分子W及隨後表達所述核酸分 子而重組產生，所述核酸分子包含符合讀框的編碼結合分子的核巧酸序列W及編碼合適標 記的核巧酸序列。
[0060] 本發明另一方面提供了編碼本發明的至少一種結合分子、其功能變體或者免疫綴 合物的核酸分子。該種核酸分子可W用作中間物W進行克隆，例如用於如上述的親和力成 熟方法中。在一個優選的實施方案中，所述核酸分子是分離或純化的。DNA分子的序列可W 用常規技術，或利用雜交瘤技術獲得。
[0061] 本領域技術人員將意識到該些核酸分子的功能變體也是本發明的一部分。功能變 體是該樣的核酸序列，通過使用標準遺傳密碼可W將其直接翻譯W提供與從親代核酸分子 中翻譯的序列相同的胺基酸序列。
[0062] 一旦獲得了有關的序列，就可W用重組法來大批量地獲得有關序列。該通常是將 其克隆入載體，再轉入細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。
[0063] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然後再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0064] 目前，已經可W完全通過化學合成來得到編碼本發明的結合分子（或其片段，或 其衍生物）的DNA序列。然後可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子 (或如載體）和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明的結合分子的序列中。 [006引本發明還涉及包含上述的適當DNA序列W及適當啟動子或者控制序列的載體。該 些載體可W用於轉化適當的宿主細胞，W使其能夠表達蛋白質。優選的，本發明的載體是例 如含病毒啟動子的質粒表達載體，且在所述表達載體中分別插入了抗柯薩奇病毒單克隆抗 體重鏈可變區（VH)與恆定區序列和輕鏈可變區化與恆定區融合序列。
[0066] 宿主細胞可W是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有：細菌細胞如大腸桿菌，鏈黴菌屬；鼠傷寒沙 口氏菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞如果禍S2或Sf9 ;動物細胞如CH0、C0S7、NS0 或Bowes黑素瘤細胞等。特別適用於本發明的宿主細胞是真核宿主細胞，尤其是哺乳動物 細胞，如293細胞。
[0067] 用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原 核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期後收穫，用CaC12法處理， 所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgC12。如果需要，轉化也可用電穿孔的 方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法：磯酸巧共沉澱法，或常規機械 方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
[0068] 獲得的轉化子可W用常規方法培養，表達本發明的結合分子。根據所用的宿主細 胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適於宿主細胞生長的條件下進行培養。 當宿主細胞生長到適當的細胞密度後，用合適的方法（如溫度轉換或化學誘導）誘導選擇 的啟動子，將細胞再培養一段時間。
[0069] 本發明的結合分子優選的是採用哺乳動物細胞來生產，哺乳動物細胞通常需要在 含血清的培養基中進行培養。需要對細胞進行無血清的適應過程後，方可讓細胞在無血清 培養基中正常的生長。
[0070] 如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重 組的蛋白。該些方法是本領域技術人員所熟知的。該些方法的例子包括但並不限於：常規 的復性處理、用蛋白沉澱劑處理（鹽析方法）、離也、滲透破菌、超聲處理、超離也、分子篩層 析（凝膠過濾）、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術 及該些方法的結合。
[0071] 本發明的結合分子也可W在轉基因非人哺乳動物如兔、山羊或者牛中產生，並且 分泌進例如其乳中。
[0072] 藥物組合物
[0073] 本發明的結合分子可用於製備抑制柯薩奇病毒的組合物。
[0074] 基於本發明的新發現，還提供了 一種可抑制柯薩奇病毒或柯薩奇病毒感染疾病的 組合物，其包含：有效量的本發明所述的結合分子；W及藥學上可接受的載體。
[00巧]本文所用的術語"藥學上可接受的"是指當分子本體和組合物適當地給予動物或 人時，它們不會產生不利的、過敏的或其它不良反應。本文所用的"藥學上可接受的載體" 應當與本發明的結合分子相容，即能與其共混而不會在通常情況下大幅度降低組合物的效 果。
[0076] 可作為藥學上可接受的載體或其組分的一些物質的具體例子是糖類，如乳糖、葡 萄糖和藏糖；澱粉，如玉米澱粉和±豆澱粉；纖維素及其衍生物，如駿甲基纖維素軸、己基 纖維素和甲基纖維素；西黃著膠粉末；麥芽；明膠；滑石；固體潤滑劑，如硬脂酸和硬脂酸 鎮；硫酸巧；植物油，如花生油、棉巧油、芝麻油、橄攬油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二 醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚己二醇；海藻酸；乳化劑，如Tween? ;潤溼劑，如月桂基 硫酸軸；著色劑；調味劑；壓片劑、穩定劑；抗氧化劑；防腐劑；無熱原水；等滲鹽溶液；和磯 酸鹽緩衝液等。
[0077] 本發明的組合物可根據需要製成各種劑型，並可由醫師根據患者種類、年齡、體重 和大致疾病狀況、給藥方式等因素確定對病人有益的劑量進行施用。給藥方式例如可W採 用注射或其它治療方式。
[0078] 本發明的結合分子可未分離的或者分離的形式使用。此外，本發明的結合分 子可W單獨應用或者於包含至少一種本發明的結合分子（或其變體或片段）的混合物中應 用。換句話說，所述結合分子可W組合應用，例如作為包含兩或更多種本發明的結合分子、 其變體或片段的藥物組合物。例如，具有不同但互補活性的結合分子可W組合在一個治療 方案中W達到希望的預防、治療或診斷作用，但是或者也可W將具有相同活性的結合分子 組合在一個治療方案中W達到希望的預防、治療或診斷作用。任選地，所述混合物進一步包 含至少一種其它治療劑。優選地，所述治療劑如利己韋林，可用於預防和/或治療柯薩奇病 毒感染。
[0079] 所述藥物組合物可包含兩或多個對於柯薩奇病毒具有中和活性的結合分子。在 一個實施方案中，當組合應用時，所述結合分子呈現協同中和活性。換句話說，所述組合物 包含至少兩種具有中和活性的結合分子，特徵在於所述結合分子在中和柯薩奇病毒中起協 同作用。如本文所用，術語"協同"是指當組合應用時，結合分子的組合作用高於單獨應用 時的加合作用。所述協同作用的結合分子可W結合柯薩奇病毒的相同或不同片段上的不同 結構。計算協同作用的方式是通過組合指數計算。組合指數（CI)的概念己經由化OU and Talalay(1984)描述。
[0080] 可W調整給藥方案W提供最佳的所需應答（例如治療應答）。合適的劑量範圍可 例如是0. Ol-lOOmg/kg體重，優選0. l-15mg/kg體重。此外，例如可W給予一次推注、隨時 間給予多次分開劑量或者根據治療情況的緊急性而可W按比例降低或增加劑量。本發明的 分子和組合物優選是無菌的。使得該些分子和組合物無菌的方法為本領域所熟知。用於診 斷、預防和/或治療的其它分子可WW與本發明的結合分子相似的給藥方案給予。如果單 獨給予其它分子，則可W在給予本發明的一或多種人結合分子或藥物組合物之前、同時或 者之後給予患者。對於人患者的精確給藥方案通常在臨床實驗期間挑選出。
[008。 檢測試劑和試劑盒
[0082] 本發明的結合分子可用於製備檢測柯薩奇病毒的試劑或試劑盒。
[0083] 如本文所用，術語"待測樣品"涵蓋了多種樣品類型，包括生物學來源的血液及其 它體液樣品，實體組織樣品如活檢組織樣品或者組織培養物，或者衍生自其中的細胞或者 其後代。該術語還包括在獲得後已經通過任何方式處理的樣品，例如用試劑處理、溶解、或 者富集某些成分如蛋白質或者多核巧酸。該術語涵蓋了得自任何物種的各種臨床樣品，也 包括培養的細胞、細胞上清和細胞溶解產物。術語"待測樣品"也包括其它非診斷目的的待 測樣品，如可能包含病毒的器皿、物品、食品、藥品。
[0084] W所述的結合分子為基礎，可製備方便、快速且準確地檢測柯薩奇病毒的試劑盒。
[0085] 因此，本發明提供了一種用於檢測樣品中是否存在柯薩奇病毒的檢測試劑盒，該 試劑盒中含有本發明的抗柯薩奇病毒的結合分子。
[0086] 在獲得了本發明提供的結合分子後，可W方便地製備出用於特異性檢測柯薩奇病 毒的檢測試劑盒。
[0087] 作為本發明的一種檢測方式，採用間接化ISA法，將待測的抗原包被於固相載體 上，利用本發明的結合分子進行檢測。
[0088] 作為本發明的一種優選方式，所述的結合分子是抗體，可根據雙抗夾也法的原理 來檢測。雙抗夾也法常規的做法是將一抗（如本發明的單克隆抗體）固定於載體，然後使 一抗與抗原反應，洗塗後再與二抗反應（所述的二抗攜帶可檢測信號，或可與攜帶可檢測 信號的物質結合），最後進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號。雙抗夾也法特別適用於具 有兩個或兩個W上表位的抗原的檢測。
[008引為了在檢測時更方便，所述試劑盒中除了含有本發明的結合分子W外，還可W包 含其它檢測試劑或輔助試劑，所述的輔助試劑例如是ELISA試劑盒中常規使用的一些試 齊U，該些試劑的特性W及它們的配製方法均是本領域技術人員所熟知的，如顯色劑、標記 物、二抗、抗抗體、增敏劑等。本領域人員應理解，各種變化形式的檢測試劑盒均是包含在本 發明中的，只要在其中利用了本發明的結合分子作為識別柯薩奇病毒的試劑。
[0090] 此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用於說明其中裝載的試劑的使用方 法。
[0091] 在獲得了本發明提供的結合分子和/或試劑盒後，可W利用多種免疫學相關方法 來檢測樣品中柯薩奇病毒的存在與否或其含量，該些方法均被包含在本發明中。較佳地，所 述的方法是W非疾病診斷為目的的。
[0092] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，該些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第H版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照製造廠商所建議的條件。
[0093] I.材料與方法
[0094] 細胞和病毒
[0095] RD細胞（購自中國科學院細胞庫）和Vero細胞（購自中國科學院細胞庫）均用 含有10%血清和lOOU/ml青黴素、lOOug/ml鏈黴素的DMEM培養基培養。
[0096] SP2/0細胞（購自中國科學院細胞庫）用含有10%血清和lOOU/ml青黴素、lOOug/ ml鏈黴素的1640培養基培養。
[0097] CA16 病毒株 SZ05(CA16/SZ05)(參見 Liu F 等，Virol J2011 ;8:534)和 G08(參 見 Liu Q，Yan K 等，Vaccine20120ctl9;30(47):6642-8)及 EV71 病毒株 G082(參見 Ku Z 等，J Virol Methods2012化14)在畑和Vero細胞上擴增。病毒滴度測定採用微量滴定法 在畑細胞上進行，並且表示為半數組織感染量TCID50。
[009引抗原製備及小鼠免疫
[0099] CA16/SZ05 滅活病毒的製備參見 Cai Y 等，Vaccine2013Apr26 ;31 (18) : 2215-21。 將4ug的滅活病毒巧Oul體積）與等體積鉛佐劑和25ug CpG佐劑混合後腹腔免疫6周雌 性Ba化/c小鼠，在0周、2周、4周、6周各免疫一次。在第7周時，採取小鼠血清檢測中和滴 度。第8周時中和滴度最高的一隻小鼠通過尾靜脈加強免疫lOug的滅活CA16病毒。3天 後，取小鼠脾臟用於製備雜交瘤細胞。
[0100] 雜交瘤細胞株的製備和篩選
[0101] 小鼠尾靜脈加強免疫3天後，取小鼠脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0通過PEG1500 融合，製備雜交瘤細胞。9天之後，通過化ISA和微量中和滴定實驗篩選特異性分泌針對 CA16的中和性抗體。簡言之，CA16F顆粒包被96孔板，每孔lng，4°C包被過夜，用含有5% 脫脂牛奶的PBST封閉，每孔加70ul雜交瘤細胞培養液在37C賠育2小時，接著用HRP標 記的二抗賠育1小時，最後進行顯色反應，讀取0D450的吸光值。同時，在VERO細胞上進行 中和試驗來篩選分泌中和性抗體的細胞株。中和試驗參照Liu Q等，Vaccine20120ctl9; 30(47) : 6642-8。
[0102] 腹水製備和抗體純化
[010引雌性Ba化/c小鼠腹腔注射500ul液體石蠟油，兩周後，每隻小鼠腹腔注射30萬個 雜交瘤細胞。7天後，12號針頭收集腹水，10, 00化pm離也lOmin，去除上層油脂和下層沉澱， 取澄清的腹水進行抗體純化。根據說明書，利用化Trap化TrapTM Protein G親和柱佑E health care)純化腹水獲得抗體。
[0104] 生物素標記單克隆抗體
[0105] 將純化後的單抗透析成PBS緩衝液，取1ml濃度為2mg/ml的9B5加入27ul的濃度 為 lOmM Sulf〇-NHS-LC-Biotin(thermo，EZ-Link飯 Sulf〇-NHS-LC-Biotinylation Kit), 4C輕輕震蕩混合2小時。然後用脫鹽柱置換緩衝液將多餘的生物素除去。將偶聯後的單 抗加等體積的甘油，保存-2(TC。
[0106] 酶聯免疫吸附實驗鑑定單克隆抗體
[0107] 每孔Ing CA16F顆粒4°C過夜包被96孔化ISA板，鑑定單抗的結合能力。ELISA 板經含5%脫脂牛奶的PBST在37°C封閉2小時後，按每孔long入單抗37°C賠育2小時，接 著用HRP標記的抗鼠二抗進行賠育，最後讀取吸光值0D450。
[010引免疫英光染色
[0109] 經CA16感染的Vero細胞用4%多聚甲酵固定20min，接著用1%NP40在室溫處理 lOmin。固定的細胞用含有10%FBS和10%BSA的PBS37°C封閉1小時。將單抗用含1%BSA 的PBS稀釋到最終濃度lOng/ul後與細胞進行37°C賠育。然後，將Alexa488標記的抗鼠 IgGQnvitrogen，Carlsbad, CA，USA)為檢測二抗。用 5y g/ml4, 6-二脈基-2-苯基巧隙 值API)室溫賠育5分鐘對細胞染色。每一步中間都用PBS清洗3遍。染色細胞用免疫英光 顯微鏡（Leica,Wetzlar，Germany)觀察。
[0110] 夾也化ISA檢測CA16滅活病毒和病毒樣顆粒
[01川用9B5包被ELISA板，lng/ul，50ul/孔，37°C 2小時；含5%脫脂牛奶的PBST37C 封閉1小時後，將滅活的CA16和EV71 W及病毒樣顆粒加入化ISA板中，2化g/50ul/孔起 始，2倍比稀釋12個濃度，37C 1小時；然後將生物素標記的9851:20000稀釋，50ul/孔， 37°C 1小時；最後用HRP-Avidinl:2000稀釋，50ul/孔，37°C作用半小時，最後TMB顯色15 分鐘，讀取吸光值0D450。
[0112] 捕獲化ISA早期診斷患者血清裡的特異性IgM抗體
[0113] 將抗人IgM抗體（購於Sigma)5ug/ml，50ul/孔於PBS中包被化ISA板，37°C 2小 時；含5%脫脂牛奶的PBST37C封閉1小時後，用含1%脫脂牛奶的PBST稀釋lul的人血清 至50ul，加到ELISA板中，37°C 2小時；隨後加入lOOng的CA16和EV71滅活病毒，50ul/孔， 37°C 2小時；然後將9B5和D5單抗（參見Ku Z等，J Virol Methods2012化14)8ng/孔加 入板中，37°C 1小時；最後用HRP標記的抗鼠IgG二抗1:5000稀釋，50ul/孔，37°C作用1小 時，結果為TMB顯色15分鐘，讀取吸光值0D450。
[0114] 體外中和實驗
[0115] 純化的單克隆抗體用含2%FBS的DMEM進行二倍比稀釋。CA16病毒稀釋到工作濃 2TCID50/U1。中和實驗在96孔板中進行，每孔加入50ul稀釋的抗體和50ul病毒液，37C 賠育1小時。將lOOul抗體病毒混合物加至含有10, 000RD細胞中，37C賠育。72小時後， 觀察細胞病變，並記錄能夠完全抑制細胞病變的最低單抗濃度。
[0116] 抗體預防CA16感染小鼠
[0117] 1日齡ICR小鼠，腹腔注射化g和lOug單克隆抗體和對照抗體2G9(參見Ku Z，化i J 等，J Virol Methods2012Dec;186(l-2):193-7)及 PBS 對照。24 小時後，腹腔注射 CA16/ G08(TCID50:2. 7*l〇Vml) lOul，之後連續18天每天記錄各組的臨床症狀評分和死亡率。臨 床病症分級如下；〇級，健康；1級，反應遲緩；2級，平衡失調，肌無力；3級，痛疾；4級，死 亡。
[011引抗體治療感染CA16的小鼠
[0119] 2 日齡 ICR 小鼠，腹腔注射 CA16/G08(TCID50:2.7*l〇Vml)10ul。攻毒 24 小時後， 腹腔注射化g和lOug單克隆抗體9B5和對照抗體（鼠源單抗2G9,針對皿sAg)及PBS對照， 為"一天治療組"；攻毒後72小時腹腔注射lOug單克隆抗體9B5和對照抗體及PBS對照， 為天后治療組"；攻毒後120小時腹腔注射lOug單克隆抗體9B5和對照抗體及PBS對 照，為"五天後治療組"。注射抗體之後連續18天每天記錄各組的臨床症狀評分和死亡率。 臨床病症分級如下；〇級，健康；1級，反應遲緩；2級，平衡失調，肌無力；3級，痛疾；4級，死 亡。
[0120] 單克隆抗體的基因序列分離及鑑定
[0121] 從生長良好的雜交瘤細胞株用Trizol試劑提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，然後 PCR擴增出輕、重鏈可變區基因。分別W鼠源kappa鏈和gamma2B恆定區序列設計引物， 用5' Race方法擴增輕重鏈可變區序列。擴增出的輕、重鏈可變區基因分別克隆到pGEM-T 載體（Progema)中，篩選陽性克隆測序。將擴增出的抗體序列從信號膚端及恆定區末端 設計引物，通過RT-PCR擴增抗體全長基因，在5'端和3'端分別引入Hindlll和EcoRI 酶切位點，PCR產物用Hindlll和EcoRI雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳純化回收目的片段， 連入相同酶切的質粒PCDNA3. 1 (Progema)中，構建成真核表達載體PCDNA3. l-(m9B5H)和 PCDNA3. l-(m9B化）。將 PCDNA3. l-(m9B5H)和 PCDNA3. l-(m9B5L)脂質體法共轉染 CH0 細 胞，72小時後取培養上清進行分析，用ELISA方法確定培養上清中抗體的表達，具體化ISA 方法如下；每孔lOng CA16F顆粒4°C過夜包被96孔化ISA板，鑑定重組單抗的結合能力。 ELISA板經含5%脫脂牛奶的PBST在37C封閉2小時後，將重組表達的抗體上清巧B5重組 表達）50ul每孔，同時由雜交瘤分泌並純化所得的9B5 (9B5腹水純化）按每孔long加入作 陽性對照，37C賠育2小時，接著用HRP標記的抗鼠二抗進行賠育，最後讀取吸光值0D450。
[0122] 同時通過免疫英光染色實驗檢測重組表達的9B5識別感染細胞的CA16病毒，通 過微量中和實驗來檢測重組表達的9B5中和CA16病毒。
[0123] 單抗9B5對病毒結合至祀細胞的作用
[0124] 將 lOOul 的 lOOug，lOug，lug9B5 及 lOOug 對照抗體 2G9 分別與 150ul 的 500M0I CA16病毒混合，37C賠育1小時後，在4C預冷，然後將抗體病毒混合物加至已經預冷的 VERO細胞上，4°C賠育1小時，用預冷的PBS洗細胞兩遍除去未結合的病毒，然後收穫樣品， 用兔抗 CA16VP1 (參見 Liu Q，等 JVirol Methods2011Apr; 173(1): 115-20)及抗目-actin 的抗體通過Western檢測結合上的病毒及細胞內參。
[0125] 病毒結合至祀細胞後單抗9B5的中和能力測定
[0126] CA16病毒稀釋到工作濃度2TCID50/U1，將50ul加至預冷的含有10, 000畑細胞 中，4°C賠育1小時，用預冷的PBS洗兩遍細胞，然後將單抗用含2%FBS的DMEM進行二倍比 稀釋，每孔加入50ul稀釋的抗體，4C賠育1小時後，再將細胞用預冷的PBS洗兩遍，加入 lOOul含2%FBS的DMEM，37°C賠育。抗體病毒混合物37C賠育。72小時後，觀察細胞病變， 並記錄能夠完全抑制細胞病變的最低單抗濃度。加入MTT，測定細胞活性，具體方法參見化i J 等，Vaccine201331:2130-6。
[0127] II.具體實施例
[0128] 實施例1、雜交瘤細胞株9B5的建立
[0129] 滅活CA16免疫小鼠的脾臟細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合後獲得雜交瘤細胞。通過 ELISA和微量中和滴定實驗對雜交瘤細胞上清進行分析，篩選到一個雜交瘤細胞株，其分泌 的抗體能夠結合CA16病毒並且具有體外中和作用，命名該雜交瘤細胞株為9B5。
[0130] 實施例2、單抗9B5的特性分析
[0131] 對雜交瘤細胞株9B5分泌的單抗進行特性分析。亞型鑑定顯示，單抗9B5的輕鏈 均屬於kappa鏈，重鏈屬於IgG2B。
[0132] SDS-PAGE分析顯示單抗9B5的重鏈和輕鏈分別為50邸和25邸左右，如圖1。
[0133] 通過化ISA檢測了單抗9B5與不同抗原的反應活性，結果顯示，9B5與滅活CA16病 毒反應，但不與滅活EV71病毒反應，說明該抗體特異性識別CA16。另外，該單抗均不與大腸 桿菌重組表達的CA16衣殼蛋白VP0, VP1，或VP3反應，提示該單抗識別的是構象表位。
[0134] 實施例3、單抗9B5能夠通過免疫英光染色檢測CA16病毒感染細胞
[013引如圖2所示，在免疫英光染色實驗中，單抗9B5可W檢測CA16感染細胞中的病毒， 在細胞質中產生綠色英光信號。而用無關的抗皿sAg對照單抗（2G9)檢測則不產生綠色英 光。
[0136] 實施例4、基於9B5的夾也ELISA可W特異靈敏地檢測到CA16病毒或病毒樣顆粒
[0137] 本發明人設計了一個基於9B5的夾也化ISA，即用50ng/孔的9B5作為捕獲抗體包 被化ISA板，用Biotin偶聯的9B5(9B5-Biotin)作為檢測抗體。圖3顯示，該方法可W檢 測到低至0. 02加g/ml的CA16滅活病毒或病毒樣顆粒，且對EV71滅活病毒或病毒樣顆粒無 任何交叉反應。因此，9B5可W作為特異性檢測CA16的試劑，且檢測靈敏度極高，可檢測到 極微量的病毒。
[013引實施例5、單抗9B5可W用於檢測病人血清中CA16特異性IgM抗體 [0139] 本發明人設計了一個用於檢測病人血清中CA16特異性IgM抗體的化ISA，先用抗 人IgM抗體包被化ISA板W捕獲人血清裡的IgM，其中CA16特異性IgM將與預先製備的滅 活CA16病毒/9B5抗原抗體複合物結合，通過檢測9B5即可確定是否存在CA16特異性IgM。 圖4顯示，該方法檢測出5#和26#血清中的CA16-IgM抗體為陽性，與EV71特異性抗體D5 檢測出的38#、53#、64#和173#的EV71-IgM陽性結果沒有交叉反應，與7#陰性血清也無交 叉反應，表明該方法能夠特異性檢測CA16-IgM。
[0140] 實施例6、單抗9B5的體外抗病毒活性
[0141] 體外的病毒中和實驗顯示單抗9B5能夠高效中和CA16感染，針對CA16/SZ05和 CA16/G08病毒株的最低抑制濃度均為Ing/ml。
[0142] 實施例7、單抗9B5的體內抗病毒活性
[0143] 單抗9B5的體內抗病毒活性在CA16/G08感染小鼠模型上進行評價。在單抗的預 防效果評價實驗中，對照抗體（2G9)組和PBS組小鼠在攻毒後3天開始反應遲緩，第4至5 天出現共濟失調、腿無力症狀繼而出現痛疾及死亡，存活率分別為43%和29%(圖5);而化g 和lOug劑量的9B5單抗組，不但未出現小鼠死亡，而且所有小鼠未出現任何症狀（圖5)，表 明9B5單抗可W預防小鼠被CA16感染，預防效果極其優異。
[0144] 在單抗的治療效果評價實驗中，1天治療組中的對照抗體（2G9)和PBS處理小鼠 在攻毒後四天開始反應遲緩，第5至6天出現共濟失調、腿無力症狀繼而出現痛疾及死亡， 存活率分別為43%和29% (圖6)，而注射2ug和lOug的9B5單抗均可W 100%保護被CA16 感染的小鼠，未出現小鼠死亡，僅個別小鼠在第7天有輕微反應遲純症狀，但很快消失（圖 6) ;3天治療組中，注射lOug的9B5單抗亦可W 100%保護被CA16感染；天的小鼠，小鼠未 出現臨床症狀及死亡，而對照抗體（2G9)組和PBS組小鼠卻出現共濟失調、腿無力症狀繼而 出現痛疾及死亡，存活率分別為37%和42%(圖7);在小鼠感染CA165天後，已出現二級及 H級臨床症狀，再注射加g/g的9B5,可W減輕其臨床症狀，並有85%的存活率，而對照抗體 (2G9)組和PBS組小鼠卻出現嚴重臨床症狀，存活率僅僅為37%和28%(圖8)。
[0145] 該些結果表明，9B5不僅在體外有很好的中和活性，更重要的是具有強大的針對 CA16感染的體內預防和治療作用，是進一步構建人源化單抗的理想祀標。
[0146] 實施例8、單抗9B5的序列
[0147] 本發明人成功克隆出了 9B5單抗的輕鏈和重鏈序列，其中，9B5重鏈屬於 I曲-V巧58VH1家族，分離獲得的全長重鏈（包括信號膚編碼序列（1-57位）、可變區 (58-420位）和恆定區（421-1428位））具體序列見圖9 ;9B5輕鏈為IGKV12/13亞群，分離 獲得的全長輕鏈（包括信號膚編碼序列（1-60位）、可變區化1-384位）和恆定區（385-702 位））具體序列見圖10。
[0148] 9B5重鏈可變區核巧酸序列如下（SEQ ID N0:1);

【權利要求】
1. 一種分離的結合分子，其特徵在於，所述結合分子包含以下的胺基酸序列：SEQ ID N0:8所示的重鏈CDR1，SEQ ID N0:9所示的重鏈CDR2和SEQ ID NO: 10所示的重鏈CDR3， SEQ ID NO: 14所示的輕鏈CDR1，SEQ ID NO: 15所示的輕鏈CDR2和SEQ ID NO: 16所示的 輕鏈CDR3。
2. 如權利要求1所述的結合分子，其特徵在於，包含重鏈可變區，所述的重鏈可變區具 有SEQ ID NO:2所示的胺基酸序列。
3. 如權利要求1所述的結合分子，其特徵在於，包含輕鏈可變區，所述的輕鏈可變區具 有SEQ ID N0:4所示的胺基酸序列。
4. 如權利要求1所述的結合分子，其特徵在於，包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其重鏈 可變區和輕鏈可變區分別具有SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4所示的胺基酸序列。
5. 如權利要求1所述的結合分子，其特徵在於，包含重鏈恆定區和輕鏈恆定區，其重鏈 恆定區具有SEQ ID NO: 18所示的胺基酸序列；或其輕鏈恆定區具有SEQ ID N0:20所示的 胺基酸序列。
6. 編碼權利要求1-5任一所述的結合分子的核酸分子。
7. 權利要求1-5任一所述的結合分子在製備用於檢測、治療和/或預防柯薩奇病毒 A16型感染的藥物中的用途。
8. -種表達載體，其特徵在於，所述表達載體中含有編碼權利要求1-5任一所述的結 合分子的DNA。
9. 一種宿主細胞，其特徵在於，所述宿主細胞中含有權利要求8所述的表達載體。
10. -種組合物，其特徵在於，它含有權利要求1-5任一所述的單克隆抗體，以及藥學 上可接受的載體。
11. 一種檢測柯薩奇病毒A16型的試劑盒，其包括權利要求1-5任一所述的結合分子。
12. -種抑制柯薩奇病毒A16型的方法，其特徵在於，所述的方法包括給予患者有效量 的權利要求1-5任一所述的結合分子。
13. -種檢測柯薩奇病毒A16型的方法，其特徵在於，利用權利要求1-5任一所述的結 合分子與待測樣品進行接觸，通過檢測所述的結合分子與受試樣品的結合情況，獲得柯薩 奇病毒的存在情況以及存在量。
【文檔編號】C12N15/13GK104513310SQ201310451637
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】黃忠, 石金平, 劉慶偉 申請人:中國科學院上海巴斯德研究所