檢測mlh1基因第12外顯子突變的引物、方法和試劑盒的製作方法

2023-05-24 04:24:31 1

檢測mlh1基因第12外顯子突變的引物、方法和試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測MLH1基因突變的引物，包括用於擴增樣本DNA中MLH1基因第12外顯子的引物。利用本發明的引物，通過PCR擴增，將MLH1基因第12外顯子編碼區完全擴增，然後進行直接測序，通過測序可檢測是否發生突變。本發明還提供了檢測MLH1基因突變的方法和試劑盒。通過對臨床受檢樣本用所設計的MLH1引物對MLH1基因第12外顯子進行擴增，本發明所述引物、方法和試劑盒具有較高的擴增穩定性、特異性；同時作為測序引物，無論是正向還是反向均一次性讀完MLH1ORF和側翼序列。
【專利說明】檢測MLH1基因第12外顯子突變的引物、方法和試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬生命科學和生物【技術領域】，特別是針對MLHl基因第12外顯子突變的引物、方法和試劑盒。可用於MLHl基因突變與遺傳性非息肉性結直腸癌(HNPCC)相關性檢測。
【背景技術】 [0002]大腸癌是嚴重危害人類健康的常見惡性腫瘤之一，也是腫瘤病因性死亡率的較高的癌症。遺傳性非息肉病性大腸癌(herediary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC)，又稱Lynch綜合症，是一種常染色體顯性遺傳性疾病，其特徵為發病較早， 具有家族聚集性，並可能伴發其他腫瘤。其發生與家族中存在錯配修復基因遺傳性突變直接相關，且主要發生在MLHl基因，以及其他相關基因，如MSH2、MSH6、APC、MYH和PMS2等。
[0003]篩查是早期發現大腸癌、降低致死率的有效方法。Lynch等對HNPCC監測處理的經驗是:(I)突變基因攜帶者從20~25歲起進行結腸鏡檢查，每I~2年I次，35歲以後 I年I次；(2) HNPCC患者應進行結腸次全切除術，並且在結腸次全切除後，還應對其隨防終生；(3)女性患者應預防性切除子宮、卵巢、輸卵管。
[0004]MLHl基因位於染色體3p21-23上，其DNA全長約58kb (不包括啟動子)，含19個外顯子，它的cDNA為長2268bp的開放閱讀框(ORF)，編碼長為756個胺基酸的蛋白。MLHl 的突變是另一個研究熱點，主要為錯義突變和鹼基的缺失或插入造成的移碼突變和雜合性缺失，導致MLHl蛋白序列改變而使腫瘤發生。目前國內已有關於MLHl基因第I外顯子、 第2外顯子、第19外顯子若干鹼基突變的報導及相關專利。MLHl第12外顯子1151處的 T-A突變在東亞正常人群中有一定的發生率，對於HNPCC風險評估具有重要的指導意義。
[0005]另外，所有HNPCC患者均應接受遺傳諮詢:不僅對HNPCC家族先證者進行錯配修復基因遺傳性突變篩查，而且可以對患者家族其他成員進行遺傳諮詢，此外也可以對尚未出現腫瘤的年輕成員進行風險評估和早期診斷，對其中的基因突變攜帶者做到早診斷早治療早幹預。
[0006]檢測樣品中是否存在MLHl基因突變的引物，可用於對個體的HNPCC易感性進行診斷，通過對檢測樣本的MLHl基因第12外顯子進行檢測，以此來判斷是否與普通人群存有差異，進而判斷該個體患HNPCC的風險是否高於普通人群。攜帶突變基因型的個體患HNPCC 的風險顯著高於普通人群，應當進一步對其家族進行檢測。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在於，提供一種檢測檢測MLHl基因突變的引物，其特徵在於，包括用於擴增樣本DNA中MLHl基因第12外顯子的PCR引物，其序列為:
[0008]EX0N12F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
[0009]EX0N12R:AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC。
[0010]進一步地，測序的通用引物M13為:
[0011]M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT[0012]M13R:AACAGCTATGACCATG。
[0013]進一步地，所述的MLHl基因突變是MLHl基因第12外顯子1151處T —A突變。
[0014]本發明還提供，一種檢測MLHl基因突變的方法，包括如下步驟:
[0015]I)採集待測血液樣本，提取DNA ；
[0016]2)以步驟I中所提取的DNA為模板，利用擴增樣本DNA中MLHl基因第12外顯子的PCR引物進行擴增，得到PCR擴增產物，所述擴增樣本DNA中MLHl基因第12外顯子的 PCR引物為:
[0017]EXONl2F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
[0018]EXONl2R:AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC。
[0019]3)對步驟2中所得PCR擴增產物進行測序，與MLHl基因野生序列進行比較，確定是否存在MLHl基因第12外顯子1151處的T — A突變，測序的通用引物M13為:
[0020]M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT
[0021]M13R:AACAGCTATGACCATG。
[0022]進一步地，PCR擴增反應條件如下:步驟1:94 0C, 2min ;步驟2: 980C IOsec, 660C 30sec, 68°C 40sec，共16個循環，而且每循環一次，Tm溫度會遞減0.5°C， 16 個循環後最終 Tm 為 58°C ;步驟 3:98°C IOsec, 58°C 30sec, 68°C 40sec，共 20 個循環；步驟 4:68°C 6min ;步驟 5:4°C保存。
`[0023]進一步地，所述的MLHl基因突變是MLHl基因第12外顯子1151處的T — A突變。
[0024]本發明還提供一種檢測MLHl基因突變的試劑盒，包括
[0025](i)核酸提取試劑；
[0026](ii)PCR擴增反應試劑，其包括用於擴增樣本DNA中MLHl基因第12外顯子的PCR 上遊引物(EX0N12F)和下遊引物(EX0N12R)分別是:
[0027]EXONl2F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
[0028]EXONl2R:AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC
[0029](iii)DNA測序試劑，其包括用於測序的通用引物M13為:
[0030]M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT
[0031]M13R:AACAGCTATGACCATG。
[0032]進一步地，所述的MLHl基因突變是MLHl基因第12外顯子1151處的T — A突變。
[0033]本發明的有益效果:MLH1第12外顯子1151處的T — A突變在東亞正常人群中有一定的發生率。本發明所設計的引物除了用於擴增樣本DNA中MLHl基因第12外顯子的PCR上遊引物(EX0N12F)和下遊引物(EX0N12R)之外，還包括測序的通用引物M13的鹼基序列，即PCR擴增引物中的「TGTAAAACGACGGCCAGT」和「AACAGCTATGACCATG」是測序通用引物的鹼基序列，而不是MLHl基因第12外顯子中序列。「GCTCCATTTGGGGACCTGTA」和 「AATGGTCCTGTGGCCTTGTC」是MLHl基因第12外顯子中的部分鹼基序列。這樣在PCR測序時使用通用引物就可以克服針對MLHl基因第12外顯子設計的引物中GC含量偏高導致的 Tm值偏高的問題。因為Tm值偏高，其測序結果會有很多雜帶或雙峰，會影響測序儀對鹼基的判讀。而本發明的引物設計有效克服傳統的檢測MLHl基因第12外顯子引物中GC含量偏高引起的Tm值升高的問題，使得測序所得圖譜清晰，無雜帶和雙峰。因而在測序中可以不受擴增引物的影響，準確方便地檢測出整個MLHl基因第12外顯子。因為通用引物M13並不屬於MLHl基因第12外顯子，因此這樣的引物設計方式不是引物設計軟體所能完成的。 利用EX0N12F和EX0N12R進行PCR反應，將MLHl基因第12外顯子編碼區完全擴增，然後用測序通用引物進行直接測序，通過測序可檢測是否發生突變。引物EX0N12F和EX0N12R具有較高的擴增穩定性、特異性，無論是正向還是反向均一次性讀完MLH10RF和側翼序列。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1是本發明對樣本3的測序圖。
[0035]圖2是對照組I對樣本3的測序圖。
[0036]圖3是本發明和對照組2擴增樣本3的電泳圖。
【具體實施方式】
[0037]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規採用方法:譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照製造廠商所建議的步驟和條件。
[0038]實施例1
[0039]檢測MLHl基因第12外顯子基因突變的試劑盒，包括:
[0040](i)核酸提取試劑(天根血液/細胞/組織基因DNA提取試劑盒)；
[0041](ii)PCR擴增反應試劑:PCR Buffer, dNTP, Taq酶，ddH20，用於擴增樣本DNA中 MLHl基因第12外顯子的PCR上遊引物(EX0N12F)和下遊 引物(EX0N12R)分別是:
[0042]EXONl2F:TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA
[0043]EXONl2R:AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC
[0044]其中PCR 擴增引物中的「 TGTAAAACGACGGCCAGT 」 和 「 AACAGCTATGACCATG 」 是測序通用引物的鹼基序列，而不是MLHl基因第12外顯子中序列。「GCTCCATTTGGGGACCTGTA」和 「AATGGTCCTGTGGCCTTGTC」是MLHl基因第12外顯子中的部分鹼基序列。
[0045](iii)測序反應試劑:Bigdye Terminator V3.1(購買自ABI公司),無水乙醇，75% 乙醇，EDTA, HiDi (highly deionized-formamide),用於測序的通用引物 M13 為:
[0046]M13F: TGTAAAACGACGGCCAGT
[0047]M13R:AACAGCTATGACCATG。
[0048]該試劑盒的使用方法包括如下步驟:
[0049](i)採集待測血液樣本，提取DNA ；
[0050](ii)以該DNA為模板，利用本發明所述試劑盒中的引物進行PCR擴增，得到PCR擴
增產物；
[0051](iii)利用本發明所述的PCR測序引物對PCR擴增產物測序，與MLHl基因野生序列進行比較，確定是否存在第1151鹼基T — A突變。
[0052]實施例2
[0053]( I)樣本抽提(根據天根血液/細胞/組織基因DNA提取試劑盒說明書):
[0054]1.1抽取300 U L血液加入900 U L紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。1000Orpm離心I分鐘(若離心機最高轉速不允許,可3000rpm離心5min), 吸去上清，留下白細胞沉澱，加200uL緩衝液GA，振蕩至徹底混勻。[0055]1.2加入20 ill蛋白酶K溶液，混勻。
[0056]1.3加入200 U I緩衝液GB，充分顛倒混勻，70°C放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短
離心以去除管蓋內壁的水珠。
[0057]1.4加人200 ill無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉澱，簡短離心去除管蓋內壁的水珠。
[0058]1.5將上一步所得溶液和絮狀沉澱都加入一個吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放回收集管中。
[0059]1.6向吸附柱CB3中加入500iU緩衝液⑶(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm(13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0060]1.7向吸附柱CB3中加入700 ill漂洗液PW (使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，OOOrpm(13, 400Xg)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱CB3放入收集管中。
[0061]1.8向吸附柱CB3中加入500 U I漂洗液Pff, 12，OOOrpm(13, 400 Xg)離心30秒，倒掉廢液。
[0062]1.9將吸附柱CB3放回收集管中，12，OOOrpm(13, 400Xg)離心2分鐘，倒掉廢液。 將吸附柱CB3置於室溫放置數分鐘，以徹底晾乾吸附材料中殘餘的漂洗液。
[0063]1.10將吸附柱CB3轉入一個乾淨的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加 100 u I洗脫緩衝液TE，室溫放置2-5分鐘，12，OOOrpm(13, 400 X g)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。
[0064](2)實驗過程
[0065]2.1按樣品數n (樣品數=待測樣本數+陰性對照I個+陽性對照I個)取預混 PCR反應液每管20 u I分裝於反應管中。
[0066]2.2將上述步驟(1)中處理好的待測樣本和陰性、陽性對照各取2 Ul分別加入反應管中，混勻，低速離心數秒，進行PCR擴增，具體反應體系如下:
【權利要求】
1.檢測MLHl基因突變的引物，其特徵在於，包括用於擴增樣本DNA中MLHl基因第12 外顯子的PCR引物，其序列為:EXONl2 F: TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA EXONl2 R: AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC。
2.如權利要求1所述的引物，其特徵在於，測序的通用引物M13為:Ml3 F:TGTAAAACGACGGCCAGTMl3 R:AACAGCTATGACCATG。
3.如權利要求1所述的引物，其特徵在於，所述的MLHl基因突變是MLHl基因第12外顯子1151處T —A突變。
4.檢測MLHl基因突變的方法，包括如下步驟:1)採集待測血液樣本，提取DNA；2)以步驟I中所提取的DNA為模板，利用擴增樣本DNA中MLHl基因第12外顯子的PCR 引物進行touchdownPCR擴增，得到PCR擴增產物，所述擴增樣本DNA中MLHl基因第12外顯子的PCR引物為:EXONl2 F: TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA EXONl2 R: AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC ；3)對步驟2中所得PCR擴增產物進行測序，與MLHl基因野生序列進行比較，確定是否存在MLHl基因第12外顯子1151處的T —A突變，測序的通用引物M13為:Ml3 F:TGTAAAACGACGGCCAGT Ml3 R:AACAGCTATGACCATG。
5.如權利要求4所述的方法,其特徵在於，touchdownPCR擴增反應條件如下:步驟1: 94°C, 2min ;步驟 2:98°C IOsec, 66°C 30sec, 68°C 40sec，共 16 個循環，而且每循環一次，Tm溫度會遞減0.5°C, 16個循環後最終Tm為58°C ;步驟3:98°C 10sec，58°C 30sec, 68°C 40sec，共20個循環；步驟4:68°C 6min ;步驟5:4 °C保存。
6.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述的MLHl基因突變是MLHl基因第12外顯子1151處的T —A突變。
7.檢測MLHl基因突變的試劑盒，包括:(i)核酸提取試劑；(ii)PCR擴增反應試劑，其包括用於擴增樣本DNA中MLHl基因第12外顯子的PCR上遊引物(EX0N12 F)和下遊引物(EX0N12 R)分別是:EX0N12 F: TGTAAAACGACGGCCAGTGCTCCATTTGGGGACCTGTA EX0N12 R: AACAGCTATGACCATGAATGGTCCTGTGGCCTTGTC(iii)DNA測 序試劑，其包括用於測序的通用引物M13為:M13 F:TGTAAAACGACGGCCAGTMl3 R:AACAGCTATGACCATG。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特徵在於，所述的MLHl基因突變是MLHl基因第12 外顯子1151處的T —A突變。
【文檔編號】C12Q1/68GK103555826SQ201310451847
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】宋坤, 周曉犢, 王淑一, 孫翠蓮 申請人:合肥艾迪康臨床檢驗所有限公司