治療病毒性出血熱的方法
2023-05-24 07:06:06 4
專利名稱：治療病毒性出血熱的方法
該申請對1998年11月20日遞交的臨時申請序號60/109,153的優先權提出了權利要求。
本發明涉及醫療科學，特別是涉及用蛋白質C治療病毒性出血熱。
蛋白質C為維生素K依賴絲氨酸蛋白酶且為天然來源的抗凝血藥，其通過使凝血級聯代謝(cascade)中的因子Va和VIIIa失活而在調節止血中起作用。人蛋白質C作為一種2-鏈酶原循環，但是通過限制使用與細胞表面膜蛋白凝血調節蛋白複合的凝血酶蛋白水解，在轉移為活化蛋白質C(aPC)後，在內皮素和血小板表面起作用。
與其它的蛋白質相結合，aPC也許是作為導致抗血栓形成的保護的最重要的血液凝血的向下調節劑(down-regulator)發揮作用。除了它的抗凝聚功能以外，aPC通過它抑制細胞因子(例如TNF和IL-1)的生成而具有抗炎作用，並且也發揮有利於血塊溶解的前纖維蛋白溶解性質。因此，蛋白質C酶系統代表抗凝血作用、抗炎作用和纖維蛋白溶解作用的主要生理機制。
病毒性出血熱為一種與顯著死亡率有關的臨床症候群。毫無例外，出血熱病毒為屬於四種病毒科的有包膜的RNA病毒沙粒病毒科[胡寧熱、Machupo熱、拉塞熱]、班亞病毒科[克裡米亞-剛果出血熱、裂谷熱、漢坦及相關病毒]、纖絲病毒科[伊波拉、馬伯格]和黃病毒科[登革熱、黃熱病、鄂木斯克出血熱、誇塞納森林病]。[Cosgriff，T.M.，Reviews of Infectious Diseases 11(4)S672-S688，1989]。這些物質引起廣泛的嚴重疾病，但是最極端的臨床表現包括循環不穩定、增加的血管通透性和彌散性出血[Lacy，等.Advances in PediatricInfectious Diseases 1221-53，1997]。
在出血熱中出血的基礎機制是複雜的。可能的因素包括只有血小板減少，或與彌散性血管內凝血有關的血小板減少(DIC)。所述機制的主要方面可為內皮細胞功能障礙，該機制對血小板與凝血兩者具有密切的聯繫。另一個可能的因素是由於增加的消耗或受損的合成的結果顯示在血漿中的凝血因子水平降低。增加的消耗在DIC中發生，而受損的合成可能是肝損傷的結果。在病毒性出血熱中，肝受累的情況普遍發生。例如，在黃熱病、克裡米亞-剛果出血熱和裂谷熱中，出血與嚴重肝功能障礙的短暫關聯就是明顯的。
病毒以兩種一般方式改變出血。第一種是通過對細胞功能直接作用，第二種是通過免疫和炎症途徑的活化。兩種機制可導致不同程度的細胞損傷，包括細胞死亡。凝血途徑的活化是免疫和炎症反應的重要部分並且解釋了有時在這些反應中觀察到的纖維蛋白沉積作用的原因。
血小板減少在病毒性出血熱中普遍發生。例如，在登革出血熱中，提示血小板減少和血小板消耗增加這兩種變化已被測定。這也是伴有由漢坦及相關病毒引起的腎症候群(HFRS)的出血熱中的情況。對在病毒感染中增加的血小板破壞的其它的機制包括血小板與病毒的直接相互作用、DIC、和內皮損傷。
在伊波拉和馬伯格出血熱中，在大多數器官中發現一般性出血。尤其是在肺、肝、腎和淋巴器官中，也可廣泛觀察到沒有顯著炎症的局灶性壞死。DIC是常見的。
目前，尚未有治療病毒性出血熱的有效療法。在缺乏病毒特異性化學治療方法的情況下，控制是主要的支持療法。因此，存在安全的、有效治療患有病毒性出血熱患者的方法的需求。
本發明首先描述用蛋白質C治療病毒性出血熱。具有抗凝血、抗炎和纖維蛋白溶解活性的蛋白質C對治療在病毒性出血熱患者中發生的血凝過快狀態或蛋白質C缺乏是有用的。
本發明提供治療患有病毒性出血熱的患者的方法，方法包括給予所述患者藥學上有效量的蛋白質C。
本發明另外提供在需要此治療的患者中治療病毒性出血熱的方法，方法包括給予所述患者藥學上有效量的活化蛋白質C以便得到大約2ng/ml至大約300ng/ml的活化蛋白質C血漿水平。
對本發明的目的，如在此公開和權利要求的那樣，以下術語定義如下。
蛋白質C指具有抗凝血、抗炎和纖維蛋白溶解性質的維生素K依賴絲氨酸蛋白酶，其包括(但不局限於)血漿衍生的和重組生成的蛋白質C。蛋白質C包括並優選為人蛋白質C，儘管蛋白質C也可包括其它的種類或具有蛋白質C的蛋白水解、醯胺水解、酯水解和生物(抗凝血、纖維蛋白原溶解性質和抗炎)活性的衍生物。Gerlitz，等，U.S.專利5,453,373號和Foster等，U.S.專利5,516,650號描述蛋白質C衍生物的實例，其全部描述通過引用結合到本文中。
酶原-蛋白水解酶的酶無活性的前體。如在此使用的那樣，蛋白質C的酶原指的是分泌的，無活性的形式，無論蛋白質C的一個鏈或兩個鏈。
活化蛋白質C或aPC指的是已通過限制性蛋白水解轉化為其活化形式的蛋白質C酶原。aPC包括且優選為人蛋白質C，儘管aPC也可包括其它的種類或具有蛋白質C的蛋白水解、醯胺水解、酯水解和生物(抗凝血或纖維蛋白原溶解性質)活性的衍生物。在以上蛋白質C的描述中，提及蛋白質C衍生物的實例。
HPC-人蛋白質C酶原。
r-hPC-重組人蛋白質C酶原。
r-aPC-通過使r-hPC體外活化或從原核細胞、真核細胞、和轉基因動物或植物中直接分泌的活化形式的蛋白質C而產生的重組人活化蛋白質C，包括，例如作為酶原從人腎293細胞中分泌，然後經技術人員熟知的且在Yan，U.S.專利4,981,952號和Cottingham，WO97/20043中公開的技術純化或活化，其全部內容通過引用結合到本文中。
血漿衍化的活化蛋白質C-如在Eibl，U.S.專利5,478,558號中描述的那樣，經活化血漿HPC產生的活化蛋白質C，其全部內容通過引用結合到本文中。
持續輸注-在特定時間內，持續基本不間斷地把溶液導入靜脈中。
大劑量注射-在長達120分鐘的時間內注射確定量(稱作大劑量)的藥物。
適宜用於給藥-適宜作為治療藥物所給予的凍幹製劑或溶液劑。
劑型-指的是適宜作為用於人體的單位劑量的生理分散單位，每單位含有預定量的、經計算產生所需治療作用的活性物質和適宜的藥用賦形劑。
藥學有效量-表示能夠抑制人膿毒症的本發明化合物的量。當然，通過評價圍繞該病例的具體環境，主治醫師將確定給予本發明化合物的具體劑量。
病毒性出血熱-指的是由屬於以下四種病毒科的有包膜的RNA病毒引起的出血熱，包括沙粒病毒科[胡寧熱、Machupo熱、拉塞熱]、班亞病毒科[克裡米亞-剛果出血熱、裂谷熱、漢坦及相關病毒]、纖絲病毒科[伊波拉、馬伯格]和黃病毒科[登革熱、黃熱病、鄂木斯克出血熱、誇塞納森林病]。這些物質引起廣泛的嚴重疾病，但是最極端的臨床表現，包括循環不穩定、增加的血管通透性和彌散性出血。
本發明提供用蛋白質C治療病毒性出血熱。具有抗凝血、抗炎和纖維蛋白溶解活性的蛋白質C在治療中發生血凝過快狀態和/或蛋白質C缺乏的病毒性出血熱患者是有用的。
通過本領域已知的任何方法或者如在U.S.專利4,981,952號和U.S.專利5,550,036號中描述的那樣，可生成和/或分離本發明給予的蛋白質C，其通過引用結合到本文中。例如，通過分泌全長的、可溶性蛋白質C或來自細胞的蛋白質C的生物活化多肽變體形式，能夠生成蛋白質C，它包括(a)構建包含DNA編碼蛋白質C的載體；(b)用載體轉染細胞；和(c)在分泌全長的可溶性蛋白質C或蛋白質C的生物活化多肽變體形式的條件下，於培養基中培養這樣轉染的細胞。另外，所述細胞為原核細胞，例如哺乳動物細胞如金黃倉鼠AV12細胞、人胚胎293細胞或幼倉鼠腎細胞。
按照已知方法，可配製用於治療病毒性出血熱的蛋白質C以製備藥學上有用的組合物。例如，要求的製劑應為包含填充劑如蔗糖、鹽如氯化鈉、緩衝劑如枸櫞酸鈉和蛋白質C或aPC的，穩定高純度產物的冷凍乾燥製劑。
通過持續輸注大約1小時至大約240小時注射適宜劑量，非腸道給予蛋白質C以確保它以有效形式傳遞進入血流。
如通過優良醫學實踐和個體患者的臨床疾病所確定的那樣，本領域技術人員能夠易於優化用於包含蛋白質C的治療組合物的藥學上有效劑量和給藥方案。所給予蛋白質C的量一般為大約5.0μg/kg/hr至大約250μg/kg/hr。用於治療病毒性出血熱的蛋白質C優選為活化蛋白質C(aPC)。所給予aPC的量為大約1.0μg/kg/hr至大約96μg/kg/hr。所給予aPC的量更優選為大約1.0μg/kg/hr至大約50μg/kg/hr。而所給予aPC的量更優選為大約1.0μg/kg/hr至大約35μg/kg/hr。所給予aPC的量甚至更優選為大約5.0μg/kg/hr至大約30μg/kg/hr。所給予aPC的量還甚至更優選為大約15μg/kg/hr至大約30μg/kg/hr。所給予aPC的量還甚至更優選為大約20μg/kg/hr至大約30μg/kg/hr。所給予aPC的優選的量為大約24μg/kg/hr。所給予aPC的最優選的量為大約48μg/kg/hr。所給予aPC的適宜的劑量將導致減輕與病毒性出血熱有關的血栓形成併發症。
從所給予aPC的量得到的血漿範圍為大約2ng/ml至大約300ng/ml。優選血漿範圍為大約2ng/ml至大約200ng/ml。血漿範圍最優選為大約30ng/ml至大約150ng/ml且仍然更優選為大約100ng/ml。
或者，通過作為大劑量注射劑每小時注射適宜劑量的三分之一，隨後作為持續輸注每小時劑量的剩餘的三分之二達1小時，隨後持續輸注適宜劑量23小時，這導致給予適當的劑量超過24小時來給予aPC。另外，藉助靜脈袋滴注泵或注射泵，在2倍正常速度下給藥15分鐘，隨後在1.5倍正常速度下給藥45分鐘來給予大劑量注射。然後以正常速度，即每時間區段內給予適當劑量水平的治療藥物來確定的速度，持續達240小時。
使用本發明中提出的治療病毒性出血熱的蛋白質C將提供治療嚴重的和令人衰弱的疾病所必需的療法。使用蛋白質C是有效的並且可避免併發症例如出血傾向、毒性和目前使用的抗凝血藥的其它的常見副作用。
提供以下實施例主要是進一步闡明本發明。本發明的範圍並不僅僅由以下實施例構成。製備1人蛋白質C的製備通過技術人員熟知的技術例如在Yah，U.S.專利4,981,952號中闡明的那些技術，在人腎293細胞中製備重組人活化蛋白質C(r-hPC)，其全部內容通過引用結合到本文中。在Bang等的U.S.專利4,775,624號中公開並對基因編碼的人蛋白質提出了權利要求C，其全部內容通過引用結合到本文中。用於在293細胞中表達人蛋白質C的質粒為其在Bang等，U.S.專利4,992,373號中公開的質粒pLPC，其全部內容通過引用結合到本文中。在歐洲專利申請0445939號中和在Grinnell等，1987，Bio/Technology 51189-1192中，也描述有質粒pLPC的構建，其內容也通過引用結合到本文中。簡言之，在293細胞中轉染所述質粒，然後在無血清培養基中鑑定穩定的轉化突變型，傳代培養並生長。發酵後，經微量過濾，得到無細胞培養基。
通過採用Yan，U.S.專利4,981,952號的技術，將人蛋白質C與培養液分離。在它被吸附到陰離子交換樹脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)上之前，製備4mM的在EDTA中的澄清的培養基。在用4柱體積的20mM Tris、200mM NaCl(pH7.4)和2柱體積的20mM Tris、150mM NaCl(pH7.4)洗滌之後，用20mM Tris、150mM NaCl、10mMCaCl2(pH7.4)洗脫結合的重組人蛋白質C酶原。如同SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳判斷的那樣，洗脫之後所洗脫的蛋白質純度大於95％。
通過在NaCl中製備蛋白質3M隨後吸附在20mM Tris、3MNaCl、10mM CaCl2(pH7.4)中平衡的疏水性相互作用樹脂(ToyopearlPhenyl 650M，TosoHaas)上，可完成蛋白質的進一步純化。在用2柱體積不含有CaCl2的平衡緩衝液洗滌後，用20mM Tris(pH7.4)洗脫重組人蛋白質C。
通過除去殘留的鈣，把洗脫的蛋白質製備用於活化。將重組人蛋白質C通過金屬親和柱(Chelex-100，Bio-Rad)以除去鈣並再次結合到陰離子交換劑(Fast-Flow Q，Pharmacia)上。將這些柱兩者按順序排列並在20mM Tris、150mM NaCl、5mM EDTA(pH7.4)中平衡。隨後載荷蛋白質，在從所述系列中脫離結合前，用1柱體積的相同緩衝液洗滌Chelex-100柱。用3柱體積的平衡緩衝液洗滌陰離子交換柱，隨後用0.4M NaCl、20mM Tris-乙酸鹽(pH6.5)洗脫蛋白質。經UV 280消光E0.1％＝1.81或1.85，分別測量重組人蛋白質C和重組活化蛋白質C溶液的蛋白質濃度。製備2重組人蛋白質C的活化在4℃下，在50mM HEPES(pH7.5)存在下，把小牛凝血酶偶聯於活化CH-Sepharose 4B(Pharmacia)上。在樹脂上進行偶聯反應，該樹脂已被填充到使用大約5000單位凝血酶/mL樹脂的柱上。通過柱使凝血酶溶液循環大約3小時，然後將2-氨基-乙醇(MEA)加入到濃度0.6mL/L的循環溶液中。使含有MEA的溶液循環另外10-12小時以確保完全阻斷樹脂上未反應的胺。阻斷後，用10柱體積的1MNaCl、20mM Tris(pH6.5)洗滌偶聯有凝血酶的樹脂以除去所有非特異性結合的蛋白質，並在活化緩衝液中平衡後將它用於活化反應。
在EDTA(為螯合任何殘留的鈣)中將已純化的r-hPC製備成5mM並用20mM Tris(pH7.4)或20mM Tris-乙酸鹽(pH6.5)稀釋至2mg/mL的濃度。在37℃下，將該物料通過用50mM NaCl和20mM Tris(pH7.4)或20mM Tris-乙酸鹽(pH6.5)平衡的凝血酶柱。將流速調節使r-hPC和凝血酶樹脂之間維持大約20分鐘的接觸時間。收集流出液並立即用於醯胺水解活性試驗。如果與已建立的蛋白質C標準物相比較，所述物料不具有特異性活性(醯胺水解)，將其在凝血酶柱上循環以使r-hPC活化至完全。隨後用以上20mM緩衝液1∶1稀釋物料，緩衝液具有7.4或6.5的pH以保持當等待下一個加工步驟時蛋白質C處於較低濃度。
通過把蛋白質C結合於在含有150mM NaCl的活化緩衝液(20mM Tris，pH7.4或20mM Tris-乙酸鹽，pH6.5)中平衡的陰離子交換樹脂(Fast-Flow Q，Pharmacia)上，實現從蛋白質C物料中除去瀝濾了的凝血酶。凝血酶不與在這些條件下的陰離子交換樹脂相互作用，但是通過柱進入到樣品應用流出液中。一旦蛋白質C載荷於柱上，用20mM平衡的緩衝液洗滌2-6柱體積，之後用在5mM Tris-乙酸鹽(pH6.5)或20mM Tris(pH7.4)中的0.4M NaCl洗脫液洗脫結合的蛋白質C。更高體積的柱洗滌液便利於更完全除出十二肽。從該柱洗脫的物料貯存於冷凍溶液(-20℃)中或作為冷凍乾燥粉末貯存。
通過在活化的部分組織促凝血酶原激酶時間(APTT)凝固試驗中測量凝固時間的延長作用，測定活化蛋白質C的抗凝血活性。當在這個濃度範圍內在幾次稀釋作用下製備樣品時，在125-1000ng/mL的蛋白質C濃度範圍的稀釋緩衝液(1mg/mL放射免疫試驗級小牛血清白蛋白、20mM Tris(pH7.4)、150mM NaCl、0.02％NaN3)中，製備標準曲線。對每一個樣品池，加入50μL冷的馬血清和50μL重構成活化部分組織促凝血酶原激酶時間試劑(APTT試劑，Sigma)並在37℃下孵育5分鐘。孵育後，將50μL適當的樣品或標準物加入到每個池中。使用稀釋的緩衝液替代樣品或標準物以測定基礎凝固時間。在把50μL的37℃下30mM CaCl2加入到每一個樣品或標準物中後，立即啟動纖維計數器(fibrometer)(CoA篩選出血分析儀，American Labor)的計時裝置(timer)。從標準曲線的線性回歸方程計算樣品中活化蛋白質C的濃度。在這裡所報導的凝固時間為最少三次重複試驗的平均值，包括標準曲線樣品。
以上描述使本領域適當技術的人員能夠製備用於治療病毒性出血熱的蛋白質C。製備3活化蛋白質C的製劑通過以下方法，製備活化蛋白質C的穩定的冷凍乾燥製劑，方法包括把包含大約2.5mg/mL活化蛋白質C、大約15mg/mL蔗糖、大約20mg/mL NaCl、和具有pH高於5.5但低於6.5的枸櫞酸鈉緩衝液的溶液冷凍乾燥。另外，活化蛋白質C的穩定的冷凍乾燥製劑包括把含有大約5mg/mL活化蛋白質C、大約30mg/mL蔗糖、大約38mg/mL NaCl、和具有pH高於5.5但低於6.5的枸櫞酸鹽緩衝液的溶液冷凍乾燥。
在配製適宜於凍幹方法的製劑中，蛋白質C∶鹽∶填充劑(w∶w∶w)的比例是一個重要因素。依蛋白質C的濃度、鹽的選擇和濃度及填充劑的選擇和濃度而定，所述比例可變化。特別是大約1份活化蛋白質C大約7.6份的鹽大約6份的填充劑為優選。
通過使活化蛋白質C、NaCl、蔗糖和枸櫞酸鈉緩衝液混合，可製備適宜於經持續輸注給藥的活化蛋白質C的單位劑量製劑。混合後，將4mL溶液轉移至單位劑量收集器中並冷凍乾燥。將含有大約5mg至大約20mg活化蛋白質C(適宜於將大約0.01mg/kg/hr至大約0.05mg/kg/hr的劑量給予需要它們的患者)的單位劑量收集器密封並貯存直至使用。
該試驗目的是顯示輸注r-aPC導致統計學上顯著減少與病毒性出血熱有關的死亡率。
內含標準包括患有病毒性出血熱的患者。診斷後這些患者立即進入試驗並進入醫院。對滿足用於病毒性出血熱內含標準的患者給予標準支持護理。另外，患者接受安慰劑或r-aPC 96小時。在24μg/kg/hr劑量下，給予r-aPC。
本研究的主要目標是與安慰劑相比較r-aPC的安全性和有效性，及r-aPC治療凝血病和影響死亡率的能力。
權利要求
1.治療患有病毒性出血熱的患者的方法，該方法包括給予所述患者藥學上有效量的蛋白質C。
2.權利要求1的方法，其中所述蛋白質C為人蛋白質C酶原。
3.權利要求1的方法，其中所述蛋白質C為人活化蛋白質C。
4.權利要求3的方法，其中所述人活化蛋白質C的量為大約1μg/kg/hr至大約96μg/kg/hr。
5.權利要求4的方法，其中所述人活化蛋白質C通過持續輸注大約1至大約240小時給予。
6.在需要此治療的患者中治療病毒性出血熱的方法，該方法包括給予所述患者藥學上有效量的活化蛋白質C，以使活化蛋白質C的血漿水平達到大約2ng/ml至大約300ng/ml。
7.權利要求6的方法，其中所述活化蛋白質C以大劑量注射給予。
8.權利要求6的方法，其中所述活化蛋白質C通過持續輸注大約1至大約240小時給予。
9.權利要求6的方法，其中所述活化蛋白質C首先作為大劑量注射劑(bolus)給予，然後作為持續輸注給予。
10.權利要求9的方法，其中以大劑量注射形式給予所需活化蛋白質C的三分之一，以達到約2ng/ml至約300ng/ml範圍內的活化蛋白質C血漿水平，隨後通過持續輸注給予剩餘的三分之二的活化蛋白質C。
全文摘要
本發明提供用蛋白質C治療病毒性出血熱的方法。要求保的本發明對嚴重的和令人衰弱的疾病提供需要的治療,同時避免目前常用的抗凝血藥的併發症例如出血傾向、毒性和全身性副作用。
文檔編號A61P31/12GK1326356SQ99813313
公開日2001年12月12日 申請日期1999年11月15日 優先權日1998年11月20日
發明者C·J·菲舍爾, 殷秀慈 申請人:伊萊利利公司