用於苯乙烯合成的酶和方法
2023-05-24 07:02:01 2
用於苯乙烯合成的酶和方法
【專利摘要】本發明的主題技術一般性地涉及生物合成苯乙烯。本發明的主題技術的某些實施方案部分地基於如下認識：苯丙氨酸可通過脫氨和脫羧這樣的兩步途徑轉化為苯乙烯，其中反式-肉桂酸(tCA)作為中間物。兩種類型的酶直接參與了這一過程，苯丙氨酸解氨酶(PAL)將苯丙氨酸轉化為tCA，而肉桂酸脫羧酶將tCA轉化為苯乙烯。表達這兩種類型的酶的宿主細胞可以在生物反應器中培養，以從可再生的底物(例如葡萄糖)製備苯乙烯。
【專利說明】用於苯乙烯合成的酶和方法
[0001] 併入的序列表
[0002] 本文提供並通過引用併入了一份紙質序列表以及一份計算機可讀形式的序列表， 所述序列表包含名為"32990-5_ST25. txt"的文件，該文件的大小（在MS - DOS中測得）為 151，674位元組。該序列表由SEQ ID NO :1-44組成。
【背景技術】
[0003] 本發明的主題技術一般性地涉及用於生物合成苯乙烯的酶和方法。
[0004] 苯乙烯（乙烯基苯）是化學式為C8H8的有機化合物。這種環烴是一種無色的、油 狀液體，其容易蒸發並且具有甜的類似橡膠的氣味。在較高濃度下，苯乙烯發出不那麼令人 愉快的氣味。苯乙稀是以蘇合香樹（Styrax platanifolius)命名的，可以從蘇合香樹提取 汁液（一種安息香樹脂）。在幾個植物物種中自然存在低水平的苯乙烯。多種食物，例如水 果、蔬菜、堅果、飲料和肉類也含有苯乙烯。
[0005] 在工業上，苯乙烯是聚苯乙烯和幾種共聚物的前體。乙烯基的存在使得苯乙烯可 以聚合。每年大約生產150億鎊。美國的苯乙烯生產在20世紀40年代期間急劇增加，當時， 以苯乙烯作為合成橡膠的原料非常流行。現今，商業上顯著產品包括聚苯乙烯、丙烯腈-丁 二烯-苯乙烯（ABS)、苯乙烯-丁二烯（SBR)橡膠、苯乙烯-丁二烯膠乳、SIS (苯乙烯-異 戊二烯-苯乙烯）、S-EB-S (苯乙烯-乙烯/ 丁烯-苯乙烯）、苯乙烯-二乙烯基苯（S-DVB)、 苯乙烯-丙烯腈樹脂（SAN)和不飽和聚酯。這些材料被用於橡膠、塑料、絕緣材料、玻璃纖 維、管材、汽車和船部件、食品容器和地毯背襯。
[0006] 工業量生產苯乙烯主要來自乙苯，乙苯是由苯與乙烯烷基化而大規模製備的。它 是最重要的石油化工產品之一。有幾種方法來生產苯乙烯。乙苯脫氫是最常用的生產方法。 乙苯在氣相中與其10-15倍體積的高溫蒸汽混合，並經過一個固體催化劑床。絕大部分乙 苯脫氫催化劑基於鐵（III)氧化物，由百分之幾的氧化鉀或碳酸鉀促進。蒸汽在這個反應 中起到幾個作用。它是用於對吸熱反應提供動力的熱源，並且它通過水汽變換反應消除了 在所述氧化鐵催化劑上形成焦炭的傾向。鉀促進劑增強了這種除焦反應。所述蒸汽也稀釋 了反應物和產品，使化學平衡的位置向產品轉移。一個典型的苯乙烯裝置由兩個或三個串 聯反應器組成，所述反應器在真空下運行，以提高轉化率和選擇性。對於兩個反應器，典型 的單程轉化率是約65%;對於三個反應器，典型的單程轉化率是70-75%。對苯乙烯的選擇 性是93-97%。主要副產物是苯和甲苯。因為苯乙烯和乙苯具有類似的沸點（分別為145 和136°C )，它們的分離需要高大的蒸餾塔和高回流比（return/reflux ratio)。在其蒸餾 溫度，苯乙烯傾向於聚合。為了使這個問題最小化，早期苯乙烯裝置添加了元素硫以抑制聚 合反應。在20世紀70年代，開發了新的自由基抑制劑，這種新的自由基抑制劑由硝化的苯 酚基緩凝劑組成。最近，已經開發了一些添加劑，它們對聚合顯示出優良的抑制作用。
[0007] 由於苯乙烯是用於許多化工產品的基本石油化工產品，所以，迫切需要替代的生 產方法，特別是那些不需要化石燃料作為原料的方法。因此，儘管有可用於生產苯乙烯的方 法，但是，對於有效並且不那麼昂貴的製備苯乙烯單體的新方法存在持續需求。
【發明內容】
[0008] 本發明的主題技術一般性地涉及苯乙烯的生物合成。本發明主題技術的一些實施 方案部分地基於如下的認識：苯丙氨酸可通過脫氨和脫羧這樣的兩步途徑轉化為苯乙烯， 其中反式肉桂酸（tCA)作為中間物。兩種類型的酶直接參與了這一過程，苯丙氨酸解氨酶 (PAL)將苯丙氨酸轉化為tCA，而肉桂酸脫羧酶將tCA轉化為苯乙烯。表達這兩種類型的酶 的宿主細胞可以在生物反應器中培養，以從可再生的底物（例如葡萄糖）製備苯乙烯。
[0009] 在一個方面，本發明的主題技術涉及一種融合蛋白，所述融合蛋白包含：（a)包含 苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（b)包含肉桂酸脫羧酶的第二域。
[0010] 在某些實施方案中，所述苯丙氨酸解氨酶源自選自下組的一種有機體： Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。在一個不例性實施方案中，所述苯丙氨 酸解氨酶包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6,以及它們 的功能性片段或變體。
[0011] 在某些實施方案中，所述肉桂酸脫羧酶源自選自下組的一種有機體： Arabidopsis、Anabaena、Nostoc和Saccharomyces。在一個不例性實施方案中，所述肉桂酸 脫羧酶包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO :8、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：28, SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:36、SEQ ID N0:38,以及它們的功能 性片段或變體。例如，所述肉桂酸脫羧酶可以包含選自下組的胺基酸序列：SEQ ID NO :8、 SEQ ID N0：10,SEQ ID N0：16,SEQ ID N0：18,SEQ ID N0：20,SEQ ID N0：22,SEQ ID NO： 24, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：30, SEQ ID NO ：32, SEQ ID NO ：34, SEQ ID NO :36 以及 SEQ ID NO :38。
[0012] 肉桂酸脫羧酶的功能性變體可以包含與SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：26, SEQ ID ΝΟ:28、5Ε0ΙΟΝΟ:30、5Ε0ΙΟΝΟ:32、5Ε0ΙΟΝΟ :34、5Ε0ΙΟΝΟ:36#&5Ε0ΙΟΝΟ:38φ 任一個有約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%，約99%或甚至100%-致性 的胺基酸序列。可選地，或另外，肉桂酸脫羧酶的功能性變體可以包含：對應於SEQ ID NO: 8的殘基173位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基174位置的A、對應於SEQ ID NO :8的 殘基175位置的R、對應於SEQ ID NO :8的殘基188位置的V、對應於SEQ ID NO :8的殘基 189位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基190位置的K、對應於SEQ ID NO :8的殘基194 位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基280位置的E、對應於SEQ ID NO :8的殘基286位置 的M、對應於SEQ ID NO :8的殘基291位置的F、以及對應於SEQ ID NO :8的殘基440位置 的F。
[0013] 在某些實施方案中，所述肉桂酸脫羧酶可以包含一種突變的肉桂酸脫羧酶，所述 突變的肉桂酸脫羧酶包含對應於以下一個胺基酸殘基位置處的突變：SEQ ID NO :8的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、 196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、441 位或它們的 組合。例如，所述突變的肉桂酸脫羧酶可以包含對應於以下一個位置的胺基酸殘基位置處 的突變：SEQ ID NO :8的第175、190、193位，以及它們的組合。
[0014] 在某些實施方案中，所述肉桂酸脫羧酶可以包含一種突變的肉桂酸脫羧酶，所述 突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的選自如下一個位置的胺基酸殘基的缺失、取 代或添加：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、 193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、 441位，以及它們的組合。例如，可以用另一種胺基酸殘基取代在以下一個位置中的胺基酸 殘基：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、 191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440或441位。在另一個實例中，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在以下一個位置的氨基 酸殘基的缺失、取代或添加 ：SEQ ID NO :8的第175、190、193位，以及它們的組合。
[0015] 在一個實施方案中，本發明主題技術的融合蛋白還包含共價連接所述第一域和所 述第二域的連接體。本文所述的融合蛋白的連接體可以是一種肽連接體，例如一種包含 2-15個胺基酸的肽連接體。例如，肽連接體可以包括在表1中所示的那些。
[0016] 本發明還提供了核酸、載體和宿主細胞，所述核酸編碼本文所述的融合蛋白，所述 載體包含編碼所述融合蛋白的所述核酸，所述宿主細胞包含本文所述的載體。
[0017] 在一個方面，本發明主題技術涉及一種用於生產苯乙烯的方法，所述方法包括（a) 使宿主細胞與可發酵底物（優選碳底物或氮底物）接觸，所述宿主細胞包含一種融合蛋白， 所述融合蛋白包含：（i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（ii)包含肉桂酸脫羧酶的第 二域；以及（b)在培養基中培養所述細胞足夠時間以產生苯乙烯。所述方法還可以包括從 所述細胞培養物中收穫苯乙烯。本文所述的融合蛋白中的任何一種都可以被用於生產苯乙 烯。
[0018] 在一個方面，本發明主題技術涉及一種肉桂酸脫羧酶，所述肉桂酸脫羧酶包含： (a) SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :36 以及 SEQ ID NO :38 中的任一個；（b)與 SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO : 18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：30, SEQ ID NO ：32, SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:36、以及SEQ ID N0:38 中任一個有約 85%、約 90%、約 95%、約 97%、 約98%，約99%或甚至100%-致性的胺基酸序列，其條件是所述胺基酸序列不是SEQ ID NO :8 ;或者（c) : (a)或（b)的功能性片段。
[0019] 在某些實施方案中，所述肉桂酸脫羧酶包含：對應於SEQ ID NO :8的殘基173位 置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基174位置的A、對應於SEQ ID NO :8的殘基175位置的 R、對應於SEQ ID NO :8的殘基188位置的V、對應於SEQ ID NO :8的殘基189位置的I、對 應於SEQ ID NO :8的殘基190位置的K、對應於SEQ ID NO :8的殘基194位置的I、對應於 SEQ ID NO :8的殘基280位置的E、對應於SEQ ID NO :8的殘基286位置的M、對應於SEQ ID NO :8的殘基291位置的F、以及對應於SEQ ID NO :8的殘基440位置的F。
[0020] 在某些實施方案中，所述肉桂酸脫羧酶包含下列中的任一個：SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO ：18, SEQ ID NO ：20, SEQ ID NO ：22, SEQ ID NO ：24, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：28, SEQ ID N0:30、SEQ ID N0:32、SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:36、以及 SEQ ID N0:38。
[0021] 本發明的主題技術還涉及一種突變的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包 含對應於以下一個位置的胺基酸殘基位置處的突變：SEQ ID N0:8的第155、156、159、162、 163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、 285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440、441 位，以及它們的組合。例如，所 述突變的肉桂酸脫羧酶可以包含對應於以下一個位置的胺基酸殘基位置處的突變：SEQ ID NO :8的第175、190、193位以及它們的組合。
[0022] 在某些實施方案中，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的選自如下一 個位置中的胺基酸殘基的缺失、取代或添加：第155、156、159、162、163、164、172、173、174、 175、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、 331、360、361、395、396、398、440、441位，以及它們的組合。在某些實施方案中，所述突變為 取代。
[0023] 在某些實施方案中，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的以下一個位 置中的胺基酸殘基的缺失、取代或添加：第175、190、193位，以及它們的組合。
[0024] 本發明還提供了編碼本文所述的肉桂酸脫羧酶的核酸、包含本文所述的肉桂酸脫 羧酶的宿主細胞、以及包含本文所述的核酸的宿主細胞。
[0025] 本發明的主題技術還涉及一種用於生產苯乙烯的方法，所述方法包括：(a)使宿 主細胞與可發酵底物（優選碳底物或氮底物）接觸，所述宿主細胞包含（i)本文所述的苯 丙氨酸解氨酶和（ii)本文所述的肉桂酸脫羧酶；以及（b)在培養基中培養所述細胞足夠時 間以產生苯乙烯。
[0026] 本發明的主題技術還涉及一種宿主細胞，所述宿主細胞包含：(a)如本文所述的 重組表達的苯丙氨酸解氨酶；(b)如本文所述的重組表達的肉桂酸脫羧酶；以及（c)如本文 所述的重組表達的膜結合轉運體。所述苯丙氨酸解氨酶和所述肉桂酸脫羧酶可以被表達為 兩種單獨的蛋白質，或者可以通過如本文所述的連接體共價連接。
[0027] 在一個實施方案中，所述膜結合轉運體是ATP結合盒轉運體（ABC轉運體）。例如， 所述ABC轉運體是一種細菌ABC轉運體，例如源自Pseudomonas putida。優選地，所述ABC 轉運體是一種耐溶劑性外排泵，例如源自Pseudomonas putida S12的SrpABC泵。
[0028] 本發明的主題技術還提供了一種用於篩選候選蛋白的突變的肉桂酸脫羧酶活性 的方法，所述方法包括：(a)提供一種包含候選蛋白的蛋白質樣品以及一種選自以下的底 物：苯丙氨酸、反式肉桂酸、酪氨酸、香豆酸以及它們的組合；(b)將所述蛋白質樣品和所述 底物樣品結合以形成混合物，並在一定條件下培育所述混合物，所述條件為使得突變的肉 桂酸脫羧酶將所述底物轉化成選自由苯乙烯、4-羥基苯乙烯以及它們的組合組成的組的產 品；以及（c)將所述混合物暴露於包括聚合物樹脂的檢測材料之中，所述聚合物樹脂吸收 產物蒸氣。在一個實施方案中，所述突變的肉桂酸脫羧酶能夠以與野生型酶（例如FDCl) 相當的或高於野生型酶的速率將反式肉桂酸轉化為苯乙烯。在另一個實施方案中，所述突 變的肉桂酸脫羧酶能夠以與野生型酶相當的或高於野生型酶的速率將香豆酸轉化為4-羥 基苯乙烯。在某些實施方案中，所述候選蛋白包括包含突變的肉桂酸脫羧酶的融合蛋白。
[0029] 在一個實施方案中，本發明的主題技術還涉及一種用於篩選候選蛋白的肉桂酸脫 羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供一種包含候選蛋白的蛋白質樣品以及一種包含 反式肉桂酸的底物樣品；(b)將所述蛋白質樣品和所述底物樣品結合以形成混合物，並在 一定條件下培育所述混合物，所述條件為使得肉桂酸脫羧酶將反式肉桂酸轉化成苯乙烯； 以及（c)將所述混合物暴露於包括聚合物樹脂的檢測材料之中，所述聚合物樹脂吸收產物 蒸氣。
[0030] 在某些實施方案中，所述檢測材料還包括在苯乙烯的存在下導致顏色變化的可檢 測的標記物。例如，所述可檢測的標記物可以是4-硝基苄基-吡啶。可以將所述檢測材料 附著於固體支持物。在某些實施方案中，所述聚合物樹脂包含芳族官能團。
[0031] 在某些實施方案中，可以通過分光光度法檢測顏色的變化。例如，可以通過在約 600nm波長下測量樣品的吸收率來檢測顏色的變化。
[0032] 本文所述的篩選方法可以用於同時篩選多個候選蛋白。
[0033] 本發明的主題技術還涉及一種分離重組生成的肉桂酸脫羧酶的方法，所述方法 包括：(a)提供一種包含一種核酸的細菌宿主，所述核酸編碼肉桂酸脫羧酶，並可操作地連 接至啟動子序列；(b)在培養基中培養所述細菌宿主以在宿主細胞中表達所述肉桂酸脫羧 酶，其中，在約l〇°C至約25°C的溫度下培養所述宿主細胞；以及（c)將所述肉桂酸脫羧酶從 所述宿主細胞分離，其中，在厭氧環境下進行所述分離。
[0034] 在某些實施方案中，用於分離所述肉桂酸脫羧酶的一種或多種緩衝溶液包含還原 劑，例如三（2-羧乙基）膦（TCEP)、β-巰基乙醇以及它們的組合。
[0035] 本發明的主題技術還涉及一種結晶肉桂酸脫羧酶的方法，所述方法包括：（a)提 供濃度為約lmg/ml至約50mg/ml的肉桂酸脫羧酶溶液；(b)將所述肉桂酸脫羧酶溶液與IC 存溶液以約1:10至約10:1的體積比混合；以及（c)將所述肉桂酸脫羧酶溶液和貯存溶液 的混合物保持在適合所述肉桂酸脫羧酶形成晶體的溫度下。
[0036] 本發明的主題技術還涉及一種肉桂酸脫羧酶的晶體，其中，所述肉桂酸脫羧酶處 於與3-羥基肉桂酸的複合物之中。
[0037] 本發明的主題技術還涉及一種用於生產苯乙烯的方法，所述方法包括：(a)使宿 主細胞與一種可發酵碳底物接觸，所述宿主細胞包含：（i)苯丙氨酸解氨酶；以及（ii)肉桂 酸脫羧酶；以及（b)在培養基中培養所述宿主細胞足夠時間以產生苯乙烯，其中，通過吸收 材料吸收所述苯乙烯產物的蒸汽。
[0038] 一種用於同時篩選苯丙氨酸解氨酶和肉桂酸脫羧酶活性的方法，所述方法包括： (a)提供一種融合蛋白，所述融合蛋白包含：（i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（ii) 包含肉桂酸脫羧酶的第二域；(b)在一定條件下將述融合蛋白和所述底物混合，所述條件 為使得所述融合蛋白將所述底物轉化成產物；以及（c)檢測所述剩餘底物的量、或所述產 物的量、或它們的組合。在某些實施方案中，所述篩選包括檢測所述底物的損失、或產物 (例如反式肉桂酸、苯乙烯和苯乙烯的下遊衍生物）的量。例如，所述篩選可以包括檢測反 式肉桂酸、或苯乙烯或它們的組合的量。
[0039] 例如根據以下描述的多個方面闡明了本發明的主題技術。方便起見，將本發明主 題技術的多方面的多個實施例描述為編號的分句（1、2、3等）。這些被作為例子而提供，並 不限制本發明的主題技術。應該注意的是：可以將任意從屬分句組合成任意組合，並放入至 各自的獨立分句，例如，第1分句或第17分句。能夠以類似的方式表現其它分句。
[0040] 1、一種融合蛋白，其包括：（i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（ii)包含肉桂 酸脫羧酶的第二域；以及（iii)共價連接所述第一域和所述第二域的連接體。
[0041] 2、第1分句所述的融合蛋白，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自選自下組的一種有 機體：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0042] 3、第1分句或第2分句所述的融合蛋白，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含選自下組 的胺基酸序列：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、以及它們的功能性片段或變體。
[0043] 4、第1-3分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脫羧酶源自選自下 組的一種有機體：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0044] 5、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含選自下 組的胺基酸序列：SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38，以及它們的 功能性片段或變體。
[0045] 6、第5分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含選自下組的胺基酸序 列：SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。
[0046] 7、第5分句所述的融合蛋白，其中，所述功能性變體包含與SEQ ID NO :8、10、16、 18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一個有約85% -致性的胺基酸序列。
[0047] 8、第5分句或第7分句所述的融合蛋白，其中，所述功能性變體包含：對應於SEQ ID NO :8的殘基173位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基174位置的A、對應於SEQ ID NO: 8的殘基175位置的R、對應於SEQ ID NO :8的殘基188位置的V、對應於SEQ ID NO :8的 殘基189位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基190位置的K、對應於SEQ ID NO :8的殘基 194位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基280位置的E、對應於SEQ ID NO :8的殘基286 位置的M、對應於SEQ ID NO :8的殘基291位置的F、以及對應於SEQ ID NO :8的殘基440 位置的F。
[0048] 9、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變 的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含對應於以下一個位置的胺基酸殘基位置上 的突變：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440 或 441 位。
[0049] 10、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變 的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含對應於以下一個位置的胺基酸殘基位置上 的突變：SEQ ID NO :8的第175或190位。
[0050] 11、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變 的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一個位置處的氨 基酸殘基的缺失、取代或添加：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、 396、398、440 或 441 位。
[0051] 12、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變 的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一個位置處的氨基 酸殘基的取代：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、 192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440 或 441 位。
[0052] 13、第1-4分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變 的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一個位置處的氨基 酸殘基的缺失、取代或添加：第175或190位。
[0053] 14、第1-13分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述連接體為一種包含2-15 個胺基酸的肽連接體。
[0054] 15、第1-14分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述連接體為一種基本上由 甘氨酸和絲氨酸組成的肽連接體。
[0055] 16、第1-15分句中任一分句所述的融合蛋白，其中，所述連接體包含如在SEQ ID NO :39-44的任一個中所列出的胺基酸序列。
[0056] 17、一種編碼第1-16分句所述的任一種融合蛋白的核酸。
[0057] 18、一種包含第1-16分句所述的任一種融合蛋白的宿主細胞。
[0058] 19、一種包含第17分句所述核酸的宿主細胞。
[0059] 20、一種用於生產苯乙烯的方法，其包括：（a)使宿主細胞與可發酵碳底物接觸， 所述宿主細胞包含一種融合蛋白，所述融合蛋白包含：（i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域， (ii)包含肉桂酸脫羧酶的第二域；以及（iii)共價連接所述第一域和所述第二域的連接 體；(b)在培養基中培養所述細胞足夠時間以產生苯乙烯。
[0060] 21、第20分句所述的方法還包括從所述細胞培養物中收穫苯乙烯。
[0061] 22、第20分句或第21分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自選自下組 的一種有機體：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0062] 23、第20-22分句中任一分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含選自下 組的胺基酸序列：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6,以及它們的功能性片段或變 體。
[0063] 24、第20-23分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脫羧酶源自選自下組 的一種有機體：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0064] 25、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含選自下組 的胺基酸序列：SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38，以及它們的功 能性片段或變體。
[0065] 26、第25分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含選自下組的胺基酸序列： SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。
[0066] 27、第25分句所述的方法，其中，所述功能性變體包含與SEQ ID NO :8、10、16、18、 20、22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一個有約85% -致性的胺基酸序列。
[0067] 28、第25分句或第27分句所述的方法，其中，所述功能性變體包含：對應於SEQ ID NO :8的殘基173位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基174位置的A、對應於SEQ ID NO :8 的殘基175位置的R、對應於SEQ ID NO :8的殘基188位置的V、對應於SEQ ID NO :8的殘 基189位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基190位置的K、對應於SEQ ID NO :8的殘基194 位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基280位置的E、對應於SEQ ID NO :8的殘基286位置 的M、對應於SEQ ID NO :8的殘基291位置的F、以及對應於SEQ ID NO :8的殘基440位置 的F。
[0068] 29、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變的 肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含對應於以下一個位置的胺基酸殘基位置處的 突變：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、 191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、 440 或 441 位。
[0069] 30、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變的 肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含對應於以下一個位置的胺基酸殘基位置處的 突變：SEQ ID NO :8的第175或190位。
[0070] 31、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變的 肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一個位置處的胺基酸 殘基的缺失、取代或添加：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、 191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440 或 441 位。
[0071] 32、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變的 肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一個位置處的氨基 酸殘基的取代：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、191、 192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、440 或 441 位。
[0072] 33、第20-24分句中任一分句所述的方法，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變的 肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一個位置處的胺基酸 殘基的缺失、取代或添加：第175或190位。
[0073] 34、第20-33分句中任一分句所述的方法，其中，所述連接體為一種包含2-15個氨 基酸的肽連接體。
[0074] 35、第20-34分句中任一分句所述的方法，其中，所述連接體為一種基本上由甘氨 酸和絲氨酸組成的肽連接體。
[0075] 36、第20-35分句中任一分句所述的方法，其中，所述連接體包含如SEQ ID NO: 39-44的任一個所列出的胺基酸序列。
[0076] 37、一種肉桂酸脫羧酶，其包含：（i)SEQ ID NO :16、18、20、22、24、26、28、30、32、 34、36 和 38 的任意一個；（ii)與 SEQ ID NO :16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 和 38 中任一個有約85%-致性的胺基酸序列，條件是所述胺基酸序列不是SEQ ID N0:8;或 (iii) :(i)或（ii)的功能性片段。
[0077] 38、第27分句所述的肉桂酸脫羧酶，其中，所述胺基酸序列包含：對應於SEQ ID NO :8的殘基173位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基174位置的A、對應於SEQ ID NO :8 的殘基175位置的R、對應於SEQ ID NO :8的殘基188位置的V、對應於SEQ ID NO :8的殘 基189位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基190位置的K、對應於SEQ ID NO :8的殘基194 位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基280位置的E、對應於SEQ ID NO :8的殘基286位置 的M、對應於SEQ ID NO :8的殘基291位置的F、以及對應於SEQ ID NO :8的殘基440位置 的F。
[0078] 39、第37分句或第38分句所述的肉桂酸脫羧酶，其包含SEQ ID NO :16、18、20、22、 24、26、28、30、32、34、36 和 38 的任意一個。
[0079] 40、一種突變的肉桂酸脫羧酶，其包含對應下列一個位置的胺基酸殘基位置處的 突變：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、 191、 192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、 440 或 441 位。
[0080] 41、第40分句所述的突變的肉桂酸脫羧酶，其包含對應於下列一個位置的胺基酸 殘基位置處的突變：SEQ ID NO :8的第175或190位。
[0081] 42、一種突變的肉桂酸脫羧酶，其包含在SEQ ID NO :8的下列一個位置處的胺基酸 殘基的缺失、取代或添加：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440 或 441 位。
[0082] 43、第42分句所述的突變的肉桂酸脫羧酶，其包含在SEQ ID NO :8的下列一個 位置處的胺基酸殘基的取代：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、 396、398、440 或 441 位。
[0083] 44、第42分句所述的突變的肉桂酸脫羧酶，其包含在SEQ ID NO :8的下列一個位 置處的胺基酸殘基的缺失、取代或添加：第175或190位。
[0084] 45、一種編碼第37-44分句所述的肉桂酸脫羧酶的核酸。
[0085] 46、一種包含第37-44分句所述的肉桂酸脫羧酶的宿主細胞。
[0086] 47、一種包含第45分句所述是核酸的宿主細胞。
[0087] 48、一種用於生產苯乙烯的方法，其包括：（a)使宿主細胞與可發酵碳底物接觸， 所述宿主細胞包含：（i)苯丙氨酸解氨酶；以及（ii)第37-44分句中任一分句所述的肉桂 酸脫羧酶；(b)在培養基中培養所述細胞足夠時間以產生苯乙烯。
[0088] 49、第48分句所述的方法還包括從所述細胞培養物中收穫苯乙烯。
[0089] 50、第48分句或第49分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自選自下組 的一種有機體：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0090] 51、第48-50分句中任一分句所述的方法，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含選自下 組的胺基酸序列：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、以及它們的功能性片段或變 體。
[0091] 52、一種宿主細胞，其包含：（i)重組表達的苯丙氨酸解氨酶；（ii)重組表達的肉 桂酸脫羧酶；以及（iii)重組表達的ABC轉運體。
[0092] 53、第52分句所述的宿主細胞，其中，所述苯丙氨酸解氨酶源自選自下組的一種 有機體：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0093] 54、第52或53分句所述的宿主細胞，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含選自下組的 胺基酸序列：SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、以及它們的功能性片段或變體。
[0094] 55、第52-54分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶源自選自 下組的一種有機體：Arabidopsis、Anabaena、Nostoc 和 Saccharomyces0
[0095] 56、第52-55分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含選自 下組的胺基酸序列：SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、以及它們 的功能性片段或變體。
[0096] 57、第56分句所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含選自下組的胺基酸 序列：SEQ ID 勵：8、10、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38。
[0097] 58、第56分句所述的宿主細胞，其中，所述功能性變體包含與SEQ ID NO :8、10、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36和38中任一個有約85% -致性的胺基酸序列。
[0098] 59、第56分句或第58分句所述的宿主細胞，其中，所述功能性變體包含：對應於 SEQ ID NO :8的殘基173位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基174位置的A、對應於SEQ ID NO :8的殘基175位置的R、對應於SEQ ID NO :8的殘基188位置的V、對應於SEQ ID NO: 8的殘基189位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基190位置的K、對應於SEQ ID NO :8的 殘基194位置的I、對應於SEQ ID NO :8的殘基280位置的E、對應於SEQ ID NO :8的殘基 286位置的M、對應於SEQ ID NO :8的殘基291位置的F、以及對應於SEQ ID NO :8的殘基 440位置的F。
[0099] 60、第52-55分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突 變的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含對應於以下一個位置的胺基酸殘基位置 處的突變：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440 或 441 位。
[0100] 61、第52-55分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突 變的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含對應於以下一個位置的胺基酸殘基位置 處的突變：SEQ ID NO :8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、 191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440 或 441 位。
[0101] 62、第52-55分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突 變的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含對應於以下一個位置的胺基酸殘基位置 處的突變：SEQ ID NO :8的第175或190位。
[0102] 63、第52-55分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突 變的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一個位置處的氨 基酸殘基的缺失、取代或添加：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、 189、190、191、192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、 396、398、440 或 441 位。
[0103] 64、第52-55分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突 變的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一個位置處的 胺基酸殘基的取代：第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、 191、 192、193、194、195、196、226、227、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、398、 440 或 441 位。
[0104] 65、第52-55分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突 變的肉桂酸脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在SEQ ID NO :8的如下一個位置處的氨 基酸殘基的缺失、取代或添加：第175或190位。
[0105] 66、第52-65分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，通過一種連接體共價連接所 述苯丙氨酸解氨酶和所述肉桂酸脫羧酶。
[0106] 67、第66分句所述的宿主細胞，其中，所述連接體為一種包含2-15個胺基酸的肽 連接體。
[0107] 68、第66分句或第67分句所述的宿主細胞，其中，所述連接體為一種基本上由甘 氨酸和絲氨酸組成的肽連接體。
[0108] 69、第66-68分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述連接體包含如在SEQ ID NO :39-44中所列出的胺基酸序列。
[0109] 70、第52-69分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述ABC轉運體是一種細菌 ABC轉運體。
[0110] 71、第52-70分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述ABC轉運體源自 Pseudomonas Putida0
[0111] 72、第52-71分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述ABC轉運體是一種耐溶 劑性外排泵。
[0112] 73、第52-72分句中任一分句所述的宿主細胞，其中，所述ABC轉運體是源自 Pseudomonas putida S12 的 SrpABC 泵。
[0113] 74、一種用於篩選候選蛋白的肉桂酸脫羧酶活性的方法，所述方法包括：(a)提供 一種包含所述候選蛋白的蛋白質樣品以及一種包含反式肉桂酸的底物樣品；(b)將所述蛋 白質樣品和所述底物樣品結合以形成混合物，並在一定條件下培育所述混合物，所述條件 為使得肉桂酸脫羧酶將反式肉桂酸轉化成苯乙烯；以及（c)將所述混合物暴露於檢測材料 之中，所述檢測材料包括（i)吸收苯乙烯蒸氣的聚合物樹脂；以及（ii) 一種在苯乙烯的存 在下導致顏色變化的可檢測的標記物；其中，所述檢測材料指示所述候選蛋白具有肉桂酸 脫羧酶活性。
[0114] 75、第74分句所述的方法還包括將所述候選蛋白的活性與對照相比較。
[0115] 76、第74分句或第75分句所述的方法，其中，將所述檢測材料附著於固體支持物。
[0116] 77、第74-76分句中任一分句所述的方法，所述聚合物樹脂包含芳族官能團。
[0117] 78、第74-77分句中任一分句所述的方法，其中，通過分光光度法檢測所述顏色的 變化。
[0118] 79、第74-78分句中任一分句所述的方法，所述可檢測的標記物是4-硝基苄 基-吡啶。
[0119] 80、第79分句所述的方法，其中，通過在約600nm波長下測量所述樣品的吸收率來 檢測所述顏色的變化。
[0120] 81、第74-80分句中任一分句所述的方法，其中，同時篩選多個候選蛋白。
[0121] 82、一種分離重組生成的肉桂酸脫羧酶的方法，所述方法包括：(a)提供一種包含 一種核酸的細菌宿主，所述核酸編碼肉桂酸脫羧酶並可操作地連接至啟動子序列；(b)在 培養基中培養所述細菌宿主以在所述宿主細胞中表達所述肉桂酸脫羧酶，其中，在約l〇°C 至約25°C的溫度下培養所述宿主細胞；以及（c)將所述肉桂酸脫羧酶從所述宿主細胞分 離，其中，在厭氧環境下進行所述分離。
[0122] 83、第82分句所述的方法，其中，用於分離所述肉桂酸脫羧酶的一種或多種緩衝 液包含還原劑。
[0123] 84、第83分句所述的方法，其中，所述還原劑為三（2-羧乙基）膦（TCEP)或β -巰 基乙醇。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0124] 圖IA是酵母FDCl的預測結構的示意圖。圖IB示出了 FDCl中四個可能的tCA結 合位點（位點A-D)。圖IC示出了酵母FDCl中預測的底物（tCA)結合位點。
[0125] 圖2A示出了 37°C下FDCl在E. coli中的表達，使用了三種不同的緩衝液。重組生 成的FDCl僅累積在不溶性顆粒部分（包涵體）。圖2B示出了 16°C下FDCl在E. coli中的 表達。在上清液中檢測可溶性FDC1。
[0126] 圖3示出了純化的FDCl的SDS-PAGE分析。
[0127] 圖4示出了 pH對FDCl活性的影響。酶在pH 6. 5時表現出最大活性，並且被認為 是具有100%的相對活性。X軸表示不同反應緩衝液的pH值。
[0128] 圖5示出了 FDCl的pH穩定性。酶表現出良好的pH穩定性。當在反應前在pH 6. 0 時培育30分鐘時，沒有損失任何活性，並且被認為是具有100%的相對活性。X軸表示在酶 促反應之前培育蛋白質30分鐘時的pH值。
[0129] 圖6示出了溫度對FDCl活性的影響。當在50°C下進行反應時，酶表現出最大活 性，並且被認為是具有100%的相對活性。X軸表示進行酶促反應時的溫度。
[0130] 圖7示出了 FDCl的溫度穩定性。在50°C時，酶表現出最大活性，並且當在反應前 在50°C下培育30分鐘時，沒有損失任何活性（其被認為是具有100%的相對活性）。X軸 表示在酶促反應前培育所述酶的溫度。
[0131] 圖8示出了 FDCl在50°C下經過不同時間段的溫度穩定性。在反應前在50°C下培 育30分鐘後，酶表現出最大活性，並且被認為是具有100%的相對活性。X軸表示在酶促反 應前在50°C時培育所述酶的時間段（以分鐘計）。
[0132] 圖9示出了輔因子對FDCl活性的影響。比活性表示為每分鐘每毫克酶生成的納 摩爾苯乙烯。
[0133] 圖IOA示出了金屬離子對FDCl活性的影響。圖IOB示出了 Zn2+和Fe3+對FDCl活 性的影響。比活性表示為每分鐘每毫克酶生成的納摩爾苯乙烯。
[0134] 圖11示出了 FDCl的底物特異性。當反式肉桂酸作為底物時，酶表現出最大活性， 並且被認為是具有100%的相對活性。
[0135] 圖12A和12B描繪FDCl的動力學分析。X軸表示使用不同濃度的底物的酶促反 應。比活性表示為每分鐘每毫克酶生成的納摩爾苯乙烯。
[0136] 圖13描述了生成FDC突變體的隨機誘變的過程，和FDCl突變體的高通量比色篩 選。
[0137] 圖14示出了由FDCl突變體生產苯乙烯。Y軸表示通過FDCl突變體生產的苯乙烯 的量。X軸表示FDCl突變體的改變的胺基酸。
[0138] 圖15顯示FDC-PAL融合蛋白的活性。X軸示出了連接體的長度。
[0139] 圖16是FDC-PAL融合蛋白的預測結構的示意圖。
[0140] 圖17示出了 ABC轉運體的共表達顯著提高了苯乙烯的生產。
[0141] 圖18A示出了從葡萄糖生產苯乙烯和tCA。
[0142] 圖18B示出了由反式肉桂酸或苯丙氨酸生產苯乙烯。
[0143] 圖19示出了在培養管（左）的頂部或在96孔培養板（右）的頂部使用 STRATA-X? 樹脂。
[0144] 圖20示出純化的FDCl的SDS-PAGE分析。
[0145] 圖21A示出了 FDC(K190E)的晶體結構的初始模型的典型電子密度圖。
[0146] 圖2IB示出了 FDC(K190E)的晶體結構的不對稱單元。 具體實施方案
[0147] A.綜述
[0148] 本發明的主題技術一般性地涉及苯乙烯的生物合成。本發明主題技術的一些實施 方案部分地基於如下的認識：苯丙氨酸可通過脫氨和脫羧這樣的兩步途徑轉化為苯乙烯， 其中反式-肉桂酸（tCA)作為中間物。兩種類型的酶直接參與了這一過程，苯丙氨酸解氨 酶（PAL)將苯丙氨酸轉化為tCA，而肉桂酸脫羧酶將tCA轉化為苯乙烯。表達這兩種類型的 酶的宿主細胞可以在生物反應器中培養，以從可再生的底物（例如葡萄糖）製備苯乙烯。
[0149]
【權利要求】
1. 一種融合蛋白，其包括：(a)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（b)包含肉桂酸脫 羧酶的第二域。
2. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其中，所述苯丙氨酸解氨酶包含選自下組的氨基 酸序列：SEQIDN0:2、SEQIDN0:4、SEQIDN0:6、以及它們的功能性片段或變體。
3. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含選自下組的胺基酸 序列：SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、SEQIDN0:16、SEQIDN0:18、SEQIDN0:20、SEQID NO：22,SEQIDNO：24,SEQIDNO：26,SEQIDNO：28,SEQIDNO：30,SEQIDNO：32,SEQ IDNO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38,以及它們的功能性片段或變體。。
4. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變的肉桂酸脫 羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含對應於選自下組的一個位置的胺基酸殘基位置處的突 變：SEQIDN0:8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、190、 191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、396、 398、440、441位、以及它們的組合。
5. 根據權利要求4所述的融合蛋白，其中，所述突變在對應於選自下組的一個位置的 胺基酸殘基位置處：SEQIDNO:8的第175和190位，以及它們的組合。
6. 根據權利要求1所述的融合蛋白，其還包含共價連接所述第一域和所述第二域的連 接體。
7. 根據權利要求6所述的融合蛋白，其中，所述連接體是一種包含2-15個胺基酸的肽 連接體。
8. 根據權利要求7所述的融合蛋白，其中，所述連接體選自下組：GS、GSG、SEQID N0:39、SEQIDN0:40、SEQIDN0:41、SEQIDN0:42、SEQIDN0:43、SEQIDN0:44。
9. 一種編碼根據權利要求1所述的融合蛋白的核酸。
10. -種包含根據權利要求9所述的核酸的載體。
11. 一種包含根據權利要求10所述的載體的宿主細胞。
12. -種生產苯乙烯的方法，所述方法包括： (a)使宿主細胞與可發酵碳底物接觸，所述宿主細胞包含根據權利要求1所述的融合 蛋白；以及 (b) 在培養基中培養所述宿主細胞足夠時間以產生苯乙烯。
13. -種肉桂酸脫羧酶，其包含一個對應於選自下組的一個位置的胺基酸殘基位置處 的突變：SEQIDNO:8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、 396、398、440、441位，以及它們的組合。
14. 根據權利要求13所述的肉桂酸脫羧酶，其中，所述突變在對應於選自下組的一個 位置的胺基酸殘基位置處：SEQIDNO:8的第175、190、193位，以及它們的組合。
15. 根據權利要求13所述的肉桂酸脫羧酶，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含選自下組的 胺基酸序列：SEQIDN0:16、SEQIDN0:18、SEQIDN0:20、SEQIDN0:22、SEQIDN0:24、 SEQIDNO:26,SEQIDNO:28,SEQIDNO:30,SEQIDNO:32,SEQIDNO:34,SEQIDNO:36, SEQIDN0:38,以及它們的功能性片段。
16. -種編碼根據權利要求13所述的肉桂酸脫羧酶的分離的核酸。
17. -種包含根據權利要求16所述的分離的核酸的載體。
18. -種包含根據權利要求17所述的載體的宿主細胞。
19. 一種生產苯乙烯的方法，所述方法包括： (a) 使宿主細胞與可發酵碳底物接觸，所述宿主細胞包含（i) 一種苯丙氨酸解氨酶；以 及（ii)根據權利要求13所述的肉桂酸脫羧酶；以及 (b) 在培養基中培養所述細胞足夠時間以產生苯乙烯。
20. -種宿主細胞，其包含：（a) -種重組表達的苯丙氨酸解氨酶；(b) -種重組表達的 肉桂酸脫羧酶；以及（c) 一種重組表達的膜結合轉運體。
21. 根據權利要求20所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶是一種突變的肉桂酸 脫羧酶，所述突變的肉桂酸脫羧酶包含在對應於選自下組的一個位置的胺基酸殘基位置處 的突變：SEQIDNO:8 的第 155、156、159、162、163、164、172、173、174、175、187、188、189、 190、191、192、193、194、195、196、226、227、280、285、286、287、291、326、331、360、361、395、 396、398、440、441位，以及它們的組合。
22. 根據權利要求20所述的宿主細胞，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含選自下組的氨基 酸序列：SEQIDN0:8、SEQIDN0:10、SEQIDN0:16、SEQIDN0:18、SEQIDN0:20、SEQID N0:22、SEQIDN0:24、SEQIDN0:26、SEQIDN0:28、SEQIDN0:30、SEQIDN0:32、SEQID NO:34、SEQIDNO:36、SEQIDNO:38,以及它們的功能性片段或變體。
23. 根據權利要求20所述的宿主細胞，其中，所述膜轉運體一種細菌ABC轉運體。
24. -種生產苯乙烯的方法，所述方法包括： (a) 使根據權利要求20所述的宿主細胞與可發酵碳底物接觸；以及 (b) 在培養基中培養所述細胞足夠時間以產生苯乙烯。
25. -種用於篩選候選蛋白的突變的肉桂酸脫羧酶活性的方法，所述方法包括： (a) 提供一種包含候選蛋白的蛋白質樣品以及一種選自下組的底物：苯丙氨酸、反式 肉桂酸、酪氨酸、香豆酸、以及它們的組合； (b) 將所述蛋白質樣品和所述底物樣品結合以形成混合物，並在一定條件下培育所述 混合物，所述條件為使得突變的肉桂酸脫羧酶將所述底物轉化成選自由苯乙烯、4-羥基苯 乙烯、以及它們的組合組成的組的產物；以及 (c) 將所述混合物暴露於包括聚合物樹脂的檢測材料之中，所述聚合物樹脂吸收產物 蒸氣。
26. 根據權利要求25所述的方法，其中，所述檢測材料還包括在產物的存在下導致顏 色變化的可檢測的標記物。
27. 根據權利要求26所述的方法，其中，所述可檢測的標記物是4-硝基苄基-吡啶。
28. 根據權利要求25所述的方法，其中，所述聚合物樹脂是一種疏水樹脂。
29. 根據權利要求25所述的方法，其中，所述候選蛋白包括包含突變的肉桂酸脫羧酶 的融合蛋白。
30. -種結晶肉桂酸脫羧酶的方法，所述方法包括： (a) 提供濃度為約lmg/ml至約50mg/ml的肉桂酸脫羧酶溶液； (b) 將所述肉桂酸脫羧酶溶液與貯存溶液以約1:10至約10:1的體積比混合；以及 (c) 將步驟（b)所述的混合物保持在適合所述肉桂酸脫羧酶形成晶體的溫度下。
31. 根據權利要求30所述的方法，其中，在步驟（a)中所述肉桂酸脫羧酶的濃度為約 5mg/ml至約 10mg/ml。
32. 根據權利要求30所述的方法，其中，在步驟（b)中所述體積比為約1:2至約2:1。
33. 根據權利要求30所述的方法，其中，所述肉桂酸脫羧酶處於與選自下組的小分 子的複合物之中：反式-肉桂酸、3-羥基肉桂酸、阿魏酸、2-甲基肉桂酸、4-羥基肉桂酸、 3, 4-二甲氧基肉桂酸、2, 5-二甲氧基肉桂酸、以及它們的組合。
34. 根據權利要求33所述的方法，其中，步驟（b)的混合物中的小分子的最終濃度為約 0.01% (w/v)至約 1% (w/v)。
35. 根據權利要求30所述的方法，其中，步驟（b)的混合物還包含一種選自下組的添加 劑：MnCl2、聚乙烯吡咯烷酮K15、非洗滌劑磺基甜菜鹼201、苄脒鹽酸鹽、以及它們的組合。
36. 根據權利要求30所述的方法，其中，所述步驟（c)的溫度為約4°C至約12°C。
37. 根據權利要求30所述的方法，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含與SEQIDNO:8有至少 85 % -致性的胺基酸序列。
38. -種肉桂酸脫羧酶的晶體，其中，所述肉桂酸脫羧酶處於與3-羥基肉桂酸的複合 物之中。
39. 根據權利要求38所述的晶體，其中，所述肉桂酸脫羧酶包含SEQIDNO: 16所示的 胺基酸序列。
40. 根據權利要求39所述的晶體，其中，所述晶體具有晶胞參數a= 249.51A、b= 120.67A、c=158.49A、0 =94.9° 〇
41. 一種生產苯乙烯的方法，所述方法包括： (a) 使宿主細胞與一種可發酵碳底物接觸，所述宿主細胞包含：（i) 一種苯丙氨酸解氨 酶；以及（ii) 一種肉桂酸脫羧酶；以及 (b) 在培養基中培養所述宿主細胞足夠時間以產生苯乙烯，其中，通過吸收材料吸收所 述苯乙烯產物的蒸汽。
42. 根據權利要求41所述的方法，其中，所述吸收材料選自下組：聚合物樹脂、活性炭、 纖維素材料、以及它們的組合。
43. 根據權利要求42所述的方法，其中，所述聚合物樹脂是一種疏水樹脂。
44. 根據權利要求42所述的方法，其中，所述聚合物樹脂選自下組：C18、C8、苯基、 SDB-L吸附劑樹脂、以及它們的組合。
45. -種同時篩選苯丙氨酸解氨酶活性和肉桂酸脫羧酶活性的方法，所述方法包括： (a)提供一種融合蛋白，所述融合蛋白包含：（i)包含苯丙氨酸解氨酶的第一域，以及（ii) 包含肉桂酸脫羧酶的第二域； (b) 提供選擇下組的底物：苯丙氨酸、反式-肉桂酸、酪氨酸、香豆酸、以及它們的組 合； (c) 在一定條件下培育所述融合蛋白和所述底物，所述條件為使得所述融合蛋白將所 述底物轉化成選自下組的產物：苯乙烯、4-羥基苯乙烯、以及它們的組合；以及 (d) 檢測剩餘底物的量、或所述產物的量、或二者。
46. 根據權利要求45所述的方法，其中，所述苯乙烯的檢測包括將步驟（c)的融合蛋白 和底物暴露於一種吸收所述產物蒸汽的聚合物樹脂。
【文檔編號】C12N9/88GK104487581SQ201380033044
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2013年6月21日 優先權日:2012年6月22日
【發明者】M·W·布伊亞, 陳輝, 蔡先鵬, 韓吉祥, 於曉丹 申請人:菲特吉恩公司