陽離子對稱兩親性自組裝多肽及其應用的製作方法

2023-05-24 06:56:26 1

專利名稱：陽離子對稱兩親性自組裝多肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於自組裝多肽領域，具體涉及ー類陽離子對稱兩親性自組裝多肽及其作為抑制金黃色葡萄球菌新型納米抗菌藥物及檢測微環境變化的分子傳感器的應用。
背景技術：
肽分子自組裝技術是近年來的研究熱點，通過分子設計和固相合成等手段可以得到成千上萬種結構相異的肽分子，肽分子自組裝後形成的納米尺寸材料具有廣泛的潛在用途。國內外已有多肽材料應用於納米生物醫學領域的報導，包括用於3D細胞培養、組織修復、藥物運輸以及止血等，但目前現有技術公開的能自組裝形成納米尺寸材料用於上述領 域的多肽在結構上多具有全程或半程電荷匹配的特點(唐麗麗，何道航' 廣東化工，2011，38(1) :76-79.)。對於陽離子多肽，作為具有抗菌作用的多肽有望克服臨床上日益嚴重的細菌耐藥性，國內外報導多用於構建抗菌劑。本發明設計出了一類陽離子對稱兩親性自組裝多肽，它們的一級結構與上述多肽不同，具有陽離子対稱性，具有抗菌作用，還可以應用於檢測微環境變化。

發明內容
本發明的目的在於提供一類能夠自組裝的陽離子對稱兩親性多肽。本發明第二目的在於提供陽離子対稱的兩親性自組裝多肽在製備抑制金黃色葡萄球菌新型納米抗菌藥物中的應用。本發明第三目的在於提供陽離子対稱的兩親性自組裝多肽在製備檢測微環境變化的分子傳感器中的應用。本發明的目的通過以下技術方案實現一類陽離子対稱的兩親性自組裝多肽，其胺基酸序列的通式如下Ac-XfLeu-1le-Xg-Xg-Val-Xg-Xg-1le-Leu-XfNHg，其中 Ac 表不 N 端こ酸化，NH2 表示C端氨基化，X1. X2、X3為極性帶正電荷的胺基酸，且正電荷以Val為中心點兩邊對稱，序列中的胺基酸全為L型胺基酸。Xp X2、X3為相同或不同胺基酸均可。所述極性帶正電荷的胺基酸為Arg、Lys或His。所述的陽離子對稱的兩親性自組裝多肽胺基酸序列優選為Ac-RLIRKVKRILR_NH2、Ac-KLIRKVKRILK-NH2、Ac-KLIKKVKKILK-NH2、Ac-HLIKKVKKILH-NH2、Ac-HLIHKVKHILH-NH2、
Ac-hlihrvrhilh-nh2、Ac-hlirrvrrilh-nh2、Ac-klirrvrrilk-nh2、ac-klikrvrkilk-nh2 或
Ac-RLIRRVRRILR-NH2。所述的陽離子對稱的兩親性自組裝多肽在製備抑制金黃色葡萄球菌新型納米抗菌藥物中的應用。所述的陽離子對稱的兩親性自組裝多肽在製備檢測微環境變化的分子傳感器中的應用。相對於現有技術，本發明具有如下優點和有益效果
(I)本發明多肽自組裝是其分子間通過非共價鍵相互作用自發組合形成一種結構明確、構造穩定、具有某種理化性能的分子聚集體或超分子結構。(2)實驗表明，本發明所述陽離子対稱的兩親性自組裝多肽在不同的環境條件下會發生不同的結構變化，因此，此種多肽可以在製備檢測微環境變化的分子傳感器中應用。不同的環境條件主要指為不同肽濃度、溫度、NaCl濃度、Na2SO4濃度、SDS濃度及TFE體積分數的溶液。(3)實驗表明，本發明所述陽離子対稱的兩親性自組裝多肽對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌作用，因此，可以用於研製適於臨床上使用的新型納米抗菌藥物。(4)本發明提供了ー類新型結構的自組裝多肽，增加了自組裝多肽的類型。(5)本發明提供了ー類新型的分子傳感器、ー類新型的抗菌藥物，有利於感染疾病 的預防和治療。


圖1是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽的三維分子結構示意圖。圖2是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽的高效液相(HPLC)色譜圖，結果顯示它的純度是97. 4%。圖3是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽的質譜(MS)圖，結果顯示它的分子量為1491. 9。圖4是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽在超純水溶液中的原子力顯微鏡納米形貌圖，其中陽離子對稱兩親性自組裝多肽P5VP5的濃度是0. 4mg/ml。圖5是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽在0.1M NaCl溶液中的原子力顯微鏡納米形貌圖，其中陽離子對稱兩親性自組裝多肽P5VP5的濃度是0. 4mg/ml。圖6是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明肽濃度對陽離子對稱兩親性自組裝多肽P5VP5結構的影響。圖7是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明溫度對陽離子對稱兩親性自組裝多肽P5VP5結構的影響。圖8是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明不同NaCl濃度對陽離子對稱兩親性自組裝多肽P5VP5結構的影響。圖9是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明不同Na2S04濃度對陽離子對稱兩親性自組裝多肽P5VP5結構的影響。圖10是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明不同十二烷基硫酸鈉(SDS)濃度對陽離子對稱兩親性自組裝多肽P5VP5結構的影響。圖11是本發明所述陽離子對稱兩親性自組裝多肽的圓二色(CD)譜圖，該圖表明不同三氟こ醇(TFE)體積分數對陽離子對稱兩親性自組裝多肽P5VP5結構的影響。圖12是本發明所述不同濃度的陽離子對稱兩親性自組裝多肽對金黃色葡萄球菌的抑菌圈大小示意圖，圖中，1、2處的陽離子對稱兩親性自組裝多肽P5VP5的濃度分別為
0.lmg/ml、lmg/ml,3處是空白對照水溶液。
具體實施方式
為了更好地理解本發明，下面結合實施例對本發明作進ー步說明，但本發明要求保護的範圍並不局限於實施例表示的範圍。實施例1當X1為Arg，X2為Arg，X3為Lys時，自組裝多肽①序列如下CH3CO-Arg-Leu-1Ie-Arg-Lys-Val-Lys-Arg-1Ie-Leu-Arg-NH2自組裝多肽①的合成1、材料Fmoc-Arg(pbf)-OH(N-荷甲氧羰醯基-2,2,4,6,7-五甲基ニ氫苯並呋喃_5_磺醯-精氨酸)、Fmoc-Leu-OH (N-荷甲氧羰醯基-亮氨酸)、Fmoc-1le-OH (N-荷甲氧羰醯基-異亮氨酸)、Fmoc-Lys (Boc)-OH(N-荷甲氧羰醯基-N'-叔丁氧羰醯基-賴氨酸)、Fmoc-Val-OH (N-荷甲氧擬酸基-糹顏氨酸)、Rink Amide-MBHA Resin (樹脂)、HBTU (0-苯並三唑-1-基-N、N、N、N-四甲基尿六氟磷酸脂)和HOBT (1_羥基苯並三氮唑)購自杭州中肽生化有限公司；哌啶、醋酸酐、DMF (N、N-ニ甲基甲醯胺)、TFA (三氟こ酸)、NMM (N-甲基嗎啉)、こ醚、甲醇、DCM (ニ氯甲烷)購自天津市富宇精細化工有限公司。2、製備方法採用Fmoc (芴甲氧羰醯基)保護的固相合成法，其エ藝步驟如下(I)稱取 20g 0. 5mmol/g 的 Rink Amide-MBHA Resin 於肽合成器皿中，取 200mlDMF溶漲樹脂30min，然後抽濾，再取用300mlDMF洗滌樹脂，分三次進行，毎次的洗滌時間為2min，抽濾乾洗滌液後向肽合成器中加入100ml20%哌啶/DMF (V V)震蕩反應30min，反應結束後，再抽濾出反應液，再用400mlDMF分四次洗滌樹脂，洗畢後取少量樹脂做茚三酮檢測試驗，樹脂呈陽性，向肽合成器皿中加入以下原料
Fmoc-Arg(pbf)-OH25.95g
HBTU15.16g
HOBT5.40g
NMM4.39ml
DMF160ml上述原料加完後，震蕩反應30min，反應結束後，用300mlDMF分四次洗滌樹脂，每次洗滌時間2分鐘，取少許樹脂做茚三酮試驗檢測，樹脂呈陰性。(2)向肽合成器皿中加入5ml 20%哌啶/DMF (V V)震蕩反應30min，反應結束後抽濾出反應液，再用40ml DMF分四次洗滌樹脂，洗畢取少許樹脂做茚三酮試驗檢測，結果樹脂呈陽性，向反應器皿中加入以下原料(a) Fmoc-Leu-OH14. 14g(b)HBTU15. 16g(c)HOBT5. 40g(d) NMM4.39ml(e)DMF160ml上述原料加完後，震蕩反應40min，反應結束後，用40mlDMF分四次洗滌樹脂，每次洗滌時間為2min，取少許樹脂做茚三酮檢測，樹脂呈陰性。(3)變換步驟(2)中的(a)原料，(b) (c) (d) (e)原料及加入量不變，重複步驟
(2)的操作；(a)原料依次替換為 Fmoc-1le-OH (14. 14g)、Fmoc_Arg (pbf) -OH (25. 95g)>Fmoc-Lys(Boc)-OH (18. 74g)> Fmoc-Val-OH (13. 58g)> Fmoc-Lys(Boc)-OH (18.74g)>Fmoc-Arg (pbf) -OH (25. 95g)、Fmoc-1le_0H (14. 14g)、Fmoc-Leu_0H (14. 14g)、Fmoc_Arg(pbf)-OH (25. 95g)。即每重複一次步驟(2)的操作，變換ー種(a)原料，直至將上述原料都使用一次為止；(4)再重複一次(I) (2) (3)步驟的操作，各步驟的原料及所用原料的量均不變；最後ー個Arg合成結束後，脫出Fmoc-保護基，加入20%哌啶/DMF (V V)反應30min，洗淨樹脂，加入160ml 50%醋酸酐/DMF (V V)反應30min，用40ml DMF洗淨樹脂，再用甲醇洗滌樹脂8次，除去DMF。氮氣吹乾後，用TFA (三氟こ酸)/DCM強酸裂解液，裂解3小吋，將合成多肽從樹脂上裂解下來，同時脫去所有保護基團，收集溶有合成肽的裂解液，然後減壓過濾，收集濾液，用冷こ醚沉澱溶解在濾液中的多肽，再抽濾得到白色固體，即得合成肽的粗品。合成肽粗品經HPLC (高效液相色譜)純化，收集主峰，經過冷凍乾燥後，即得到目標合成肽。3、本發明所述其他的陽離子對稱兩親性自組裝多肽可以通過替換上述I中的胺基酸，按照上述2所述製備方法合成純化得到。在此過程中不同的合成實驗參數如下表I所示表I本發明所述部分陽離子對稱兩親性自組裝多肽的不同合成實驗參數
權利要求
1.一類陽離子對稱的兩親性自組裝多肽，其特徵在於，其胺基酸序列的通式如下 Ac-X1-Leu-1le_X2_X3_Val_X3_X2_IIe-Leu-X1HMH2,其中 Ac 表不 N 端乙酸化，NH2 表不 C端氨基化，XpX2、X3為相同或者不同的極性帶正電荷的胺基酸，且正電荷以Val為中心點兩邊對稱，序列中的胺基酸全為L型胺基酸。
2.根據權利要求1所述的陽離子對稱的兩親性自組裝多肽，其特徵在於，所述極性帶正電荷的胺基酸為Arg、Lys或His。
3.根據權利要求1所述的陽離子對稱的兩親性自組裝多肽，其特徵在於，其胺基酸序列優選為 Ac-RLIRKVKRILR-NH2、Ac-KLIRKVKRILK-NH2、Ac-KLIKKVKKILK-NH2、Ac-hlikkvkkilh-nh2、Ac-hlihkvkhilh-nh2、Ac-hlihrvrhilh-nh2、Ac-hlirrvrrilh-nh2、Ac-KLIRRVRRILK-NH2、Ac-KLIKRVRKILK-NH2 或 Ac-RLIRRVRRILR-NH2。
4.權利要求1中所述的陽離子對稱的兩親性自組裝多肽在製備抑制金黃色葡萄球菌新型納米抗菌藥物中的應用。
5.權利要求1中所述的陽離子對稱的兩親性自組裝多肽在製備檢測微環境變化的分子傳感器中的應用。
全文摘要
本發明公開了陽離子對稱兩親性自組裝多肽及其應用，其胺基酸序列的通式如下Ac-X1-Leu-Ile-X2-X3-Val-X3-X2-Ile-Leu-X1-NH2，其中X1、X2、X3為極性帶正電荷的胺基酸，且正電荷以Val為中心點兩邊對稱，序列中的胺基酸全為L型胺基酸。本發明陽離子對稱的兩親性自組裝多肽對金黃色葡萄球菌具有較好的抑菌作用，可用於研製新型納米抗菌藥物。此外，本發明所述的陽離子對稱兩親性自組裝多肽可作為分子傳感器用於檢測微環境的變化。
文檔編號G01N33/68GK103012558SQ20121021967
公開日2013年4月3日 申請日期2012年6月28日 優先權日2012年6月28日
發明者何道航, 觀富宜 申請人:華南理工大學