一種誘導幹細胞向胰島樣細胞分化的方法及其應用的製作方法

2023-05-24 23:53:06

專利名稱：一種誘導幹細胞向胰島樣細胞分化的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫學領域，具體地說是利用PDX-1基因在胰腺生長發育過程中的重要作用，構建含該基因的病毒載體，用來感染幹細胞；或構建表達載體、純化PDX-1蛋白，添加於誘導培養液中，誘導幹細胞向胰島樣細胞分化，並將獲得的細胞植入糖尿病患者體內用於糖尿病的治療。
背景技術：
近幾年，胰島細胞移植治療糖尿病取得了一些療效，但供者細胞來源不足、嚴重的免疫排斥反應等困難卻極大的限制了這種療法的應用。幹細胞作為一類具有自我更新及多向分化潛能的細胞，已經逐漸成為人們尋找胰島細胞的新資源，如骨髓中的間充質幹細胞(MSCs)易於分離培養擴增，遺傳背景穩定，體內植入反應較弱，在特定的誘導條件下可分化為多種組織細胞，是修復骨、軟骨等組織或細胞損傷的首選種子細胞，也是基因治療的理想靶細胞。
對幹細胞進行適當的基因修飾，使之成為能分泌胰島素的細胞，是治療I型糖尿病的策略之一，而引入PDX-1基因，即胰腺十二指腸同源框蛋白1，有可能獲得能分泌胰島素的細胞。PDX-1基因在胰腺生長發育過程中扮演了很重要的角色，它不但可以調控胰島素的表達，還可以調控葡萄糖轉運子(Glut-2)、葡萄糖激酶(GK)等基因的表達。
由於幹細胞是相對靜止的一群細胞，利用脂質體轉染效率很低，選用病毒載體則可獲得較高的轉染效率。腺病毒載體不整合到染色體中，攜帶的外源基因表達水平高，表達時間短，是轉染PDX-1最合適的載體。因為PDX-1是一個調控基因，它可以啟動自身基因及下遊基因的表達，瞬時表達就足以發揮功能。
利用PDX-1具有蛋白轉導結構域的特點，構建表達載體、純化PDX-1蛋白，添加於誘導培養液中，可以克服基因治療的不安全因素。

發明內容
本發明的目的是提供一種獲得大量胰島樣細胞團以用於糖尿病細胞治療的方法。採用以下技術方案1)構建含PDX-1基因的原核表達載體表達、純化PDX-1蛋白。
2)構建含PDX-1基因的病毒載體，以腺病毒載體為例用電穿孔法使穿梭質粒pAdtrack-CMV-PDX-1與病毒骨架質粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183中同源重組。利用脂質體介導重組腺病毒載體轉染293細胞，包裝並擴增腺病毒。
3)誘導幹細胞分化通過直接添加PDX-1蛋白，或轉染含PDX-1基因的病毒載體，可以誘導幹細胞分化為胰島樣細胞。
4)將獲得的胰島樣細胞以一定數量植入糖尿病患者體內，腹腔或經肝門脈移植，可以發揮降血糖作用。
本發明的內容未公開發表，本領域的技術人員如不花費創造性勞動根本不能根據現有的技術推斷得到本發明的誘導分化方法。
具體實施例方式
實施例1、PDX-1蛋白的表達、純化設計含有NdeI、XhoI位點的PDX-1基因上、下遊引物，PCR擴增全長片段，電泳回收，連入pGEM-T easy載體(Promega公司產品)，測序正確後，NdeI、XhoI雙酶切目的片段及pET-24a(+)，回收、連接。IPTG誘導表達，並純化該蛋白。
實施例2、pAdv-PDX-1腺病毒載體的構建攜帶PDX-1基因的質粒由美國Hui HongXiang博士饋贈。PDX-1是通過smaI位點插入PBluscriptII KS載體中的。在smaI位點兩端選擇BamHI及XhoI酶切。BamHI、BglII是同尾酶，故選擇BglII及XhoI酶切腺病毒穿梭質粒pAdtrack-cmv。將酶切產物電泳回收，16℃連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌DH5α，塗卡那黴素抗性平板篩選，取1μl菌液進行PCR鑑定。提取PCR鑑定為陽性的菌液質粒，行雙酶切鑑定。選擇BglII及XhoI位點進行酶切鑑定，切出了400bp的小片段及9.7kb的大片段。
選用PmeI酶切1μg穿梭質粒pAdtrack-cmv-PDX-1，70％乙醇沉澱質粒，加5μlH2O。線性化的穿梭質粒與100ng超螺旋質粒pAdEasy-1電穿孔共轉化至BJ5183感受態菌中，菌液塗卡那黴素抗性平板篩選。選擇20個小克隆，分別接種於含卡那黴素的LB培養液，37℃搖菌過夜。提取質粒，重組質粒均大於40kb，經0.7％瓊脂糖電泳可初步鑑定。根據電泳結果，選取質粒作PacI限制性酶切鑑定。重組質粒可被酶切出4.5kb的小片段及38.6kb的大片段。
取鑑定好的重組病毒質粒5μg行PacI限制性酶切。用Lipofectine 2000(Invitrogen公司產品)包裹線性化質粒轉染293細胞，轉染12h後去掉轉染液，加含5％胎牛血清的DMEM培養液繼續培養7～10天，當細胞出現CPE時，收集細胞，-70℃和37℃反覆凍融三次，離心取上清。用病毒上清再次感染293細胞，收集上清。用TCID50法測定病毒滴度(參考AdEasy Vector Systerm操作方法)，滴度為6.3×107PFU/mL。
實施例3、骨髓間充質幹細胞的分離培養和擴增無菌條件下，擠出肋骨中的骨髓，肋骨可以由非血液系統疾病胸外科手術後獲得；或由非血液系統疾病或正常人髂後上棘抽取骨髓，約5ml。向骨髓液中加入含10％胎牛血清的α-MEM(Gibico公司產品)充分混合，1500r/min離心5min，棄上清，再加入5ml完全培養液混勻後輕輕疊加到密度為1.073的Percoll分離液上，1500r/min離心20min，取白細胞膜層以上的部分，加入完全培養液洗兩遍。按1×106/ml密度接種於完全培養基中，置37℃，5％CO2飽和溼度的孵箱中培養。培養72h後更換培養液，以後每4d換液一次。細胞達80％融合後用25％胰酶消化，按1∶3傳代繼續擴增培養。
實施例4、PDX-1誘導骨髓間充質幹細胞向胰島樣細胞分化直接添加PDX-1蛋白於培養液中；或選擇病毒感染MSCs合適的MOI(MOI＝150)，根據細胞數，計算所需病毒量感染MSCs，孵育2h後，補加含有10％胎牛血清的α-MEM培養液，繼續培養1周，誘導分化。
實施例5、胰島樣細胞團的鑑定利用RT-PCR鑑定巢蛋白(nestin)，神經生成素3(ngn3)，PDX-1，GK、Glu2、胰島素，胰高血糖素基因的表達。利用primer 3軟體設計基因引物，序列如下

結果表明轉染PDX-1基因的細胞(1周)弱表達nestin、ngn3、Glut2基因，高表達PDX-1，GK、胰島素，胰高血糖素基因。
利用免疫組化鑑定胰島素、胰高血糖素抗原的表達。結果顯示誘導的細胞表達胰島素、胰高血糖素、生長抑素蛋白。
利用放射免疫分析法檢測胰島素水平。挑取轉染PDX-1基因1周的細胞團，置24孔板中，分3孔，每孔約90～100個細胞團，直徑約150μm。各孔加入1mL含5.6mmol/L葡萄糖的KRBB緩衝液，置37℃孵箱中孵育1h。棄掉舊緩衝液，以含5.6mmol/L葡萄糖、16.7mmol/L葡萄糖的KRBB緩衝液依次孵育1h，收集上清。收集各孔的細胞團，加入酸乙醇溶液，4℃過夜，用細胞超聲破碎儀破細胞，上清保存於-20℃。用放射免疫分析法檢測各上清中的胰島素含量。用BCA(Bicinchoninic acid，二喹啉甲酸)測定法檢測細胞內總蛋白含量。結果誘導的胰島樣細胞團在5.6mmol/L葡萄糖濃度下胞內胰島素含量為(54.45±9.14)ng/mg蛋白；而在16.7mmol/L葡萄糖濃度下胞內胰島素含量為(130.14±12.24)ng/mg蛋白。具有一定的糖反應性。
實施例6、體內移植實驗首先製作糖尿病大鼠模型。取成年Wistar大鼠，雌雄不限，體重約180-200g。按70mg/kg劑量給每隻大鼠腹腔注射鏈脲黴素。鏈脲黴素粉劑用0.1M檸檬酸緩衝液(pH＝4.5)配製成液體使用，現配現用。當大鼠血糖升高(≥16.7mmol/L)且穩定一周，表明糖尿病模型已經建成。無菌條件下，向糖尿病大鼠腎包囊下或肝門脈小分支注入1000個胰島樣細胞團。術後，定期觀測血糖情況。結果糖尿病大鼠在植入細胞後第二周時血糖平均下降5.6mmol/L。表明誘導的胰島樣細胞團具有降血糖作用。
權利要求
1.一種誘導幹細胞向胰島樣細胞分化的方法及其應用，其特徵在於利用轉錄因子PDX-1誘導幹細胞向胰島樣細胞分化，獲得的胰島樣細胞可在糖尿病的治療中應用。
2.按照權利要求1所述的誘導方案，其特徵在於向誘導培養液中直接添加PDX-1轉錄因子，或向幹細胞中轉染PDX-1基因，可以誘導幹細胞向胰島樣細胞分化。
3.按照權利要求2所述的方案，其特徵在於選擇構建含有PDX-1基因的原核表達載體，表達並純化該蛋白，按100nmol/L～1μmol/L濃度直接添加到培養液中，誘導幹細胞向胰島樣細胞分化。
4.按照權利要求2所述的方案，其特徵在於選擇構建含有PDX-1基因的病毒載體，包括腺病毒載體，腺相關病毒載體，慢病毒載體，逆轉錄病毒載體等，通過這些載體介導PDX-1基因在幹細胞中表達，誘導幹細胞向胰島樣細胞分化。
5.按照權利要求4所述的病毒載體，腺病毒載體是轉染PDX-1基因的首選病毒載體。
6.按照權利要求1所述的幹細胞，其特徵在於被用來誘導的幹細胞可以包括胚胎幹細胞，胰腺幹細胞，肝幹細胞，造血幹細胞，間充質幹細胞，神經幹細胞等。
7.按照權利要求1所述的方案，其特徵在於選用無血清誘導培養液，並向其中添加胰高血糖素樣肽-1，尼克醯胺等營養素或細胞因子，可以誘導轉染PDX-1基因或轉導PDX-1蛋白的幹細胞向胰島樣細胞分化。
8.按照權利要求7所述的方案，其特徵在於添加的胰高血糖素樣肽-1≤20nmol/L，尼克醯胺≤20mmol/L。
9.按照權利要求1所述的方案，其特徵在於獲得的胰島樣細胞團能表達胰島相關基因及蛋白，如葡萄糖轉運子、葡萄糖激酶、胰島素、胰高血糖素、生長抑素等。
10.按照權利要求1所述的方案，其特徵在於獲得的胰島樣細胞團通過肝門脈或腹腔等方式植入糖尿病患者體內，可以發揮一定的降血糖功能。
全文摘要
發明名稱為一種誘導幹細胞向胰島樣細胞分化的方法及其應用。本發明的目的是提供一種獲得大量胰島樣細胞團並在糖尿病細胞治療中應用的方法。為實現上述目的，本發明採用以下技術方案1)獲得PDX－1基因；2)將PDX－1基因插入原核表達載體中，表達、純化出PDX－1蛋白；或構建含有PDX－1基因的病毒載體。3)分離、培養及擴增幹細胞；4)向培養液中直接添加PDX－1蛋白，或利用病毒載體介導PDX－1基因在幹細胞中表達，誘導幹細胞分化為胰島樣細胞；5)經肝門脈或腹腔移植，將獲得的胰島樣細胞植入糖尿病患者體內發揮作用。本發明簡化了誘導幹細胞向胰島樣細胞分化的方案，為糖尿病細胞治療提供了新的胰島細胞來源，為糖尿病患者實現自體幹細胞治療自身疾病奠定了基礎。
文檔編號C12N15/12GK1637137SQ20041007064
公開日2005年7月13日 申請日期2004年7月28日 優先權日2004年1月6日
發明者裴雪濤, 李豔華, 張銳, 王韞芳, 閆舫 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所