太空誘變高效靈芝菌、其應用及其膠囊製劑的製備方法
2023-05-24 10:02:11 2
太空誘變高效靈芝菌、其應用及其膠囊製劑的製備方法
【專利摘要】本發明涉及一株太空誘變高效靈芝菌、其應用及其膠囊製劑的製備方法。對靈芝菌株進行常規誘變，不僅效率低，且需要對大批量的原始菌株進行誘變，變異幅度較小，很難大規模的提高發酵產物中目的產物靈芝多糖的產率。本發明提供了一株靈芝菌（Ganodermalucidum）S7-T7，可應用於製備抗氧化、提高免疫力的藥物和保健品。本發明所述的靈芝菌株與常規育種方法得到的菌株相比，從基因上改變了菌株的遺傳特性，彌補了常規誘變所帶來的「表型延遲」和「遺傳分離現象」，迅速獲得高質量的菌株並保證菌株的穩定性，大規模的提高菌株的產率，不需要經過對發酵條件進行大規模優化實驗的途徑來提高產量。
【專利說明】太空誘變高效靈芝菌、其應用及其膠囊製劑的製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物【技術領域】，具體涉及一株太空誘變高效靈芝菌、其應用及其膠囊製劑的製備方法。
【背景技術】
[0002]靈芝，是擔子菌綱多孔菌科靈芝屬的一種藥用真菌。中國古代把靈芝列為上品藥物，藥物專著《神農本草經》中記載:靈芝有紫、赤、青、黃、白、黑六種，性味甘平。
[0003]現代藥理研究證明，靈芝具有廣泛的藥理作用，如抗腫瘤作用、保肝解毒作用、擴張冠狀動脈和改善心肌微循環作用鎮靜作用、抗衰老作用、抗神經衰弱作用等。化學成分分析顯示，靈芝屬的子實體、菌絲體和孢子中含有多糖類、核苷類、呋喃類衍生物、留酵類、生物鹼類、蛋白質、多肽、胺基酸類、三萜類、倍半萜、有機鍺、無機鹽等。
[0004]大量實驗研究證明，靈芝的有效成分主要是多糖類物質，靈芝多糖具有免疫調節，抗腫瘤，抗衰老，清除氧自由基，活血化瘀，抗凝血，降血糖及護肝的功效。靈芝多糖通過增強機體免疫力間接抑制腫瘤細胞生長或者誘導腫瘤細胞凋亡，有效的抑制腫瘤生長，呈現一定的抗腫瘤作用。
[0005]提高靈芝菌株中的靈芝多糖含量一直是科研工作者的研究目標，目前主要運用反饋抑制理論構建耐靈芝多糖反饋抑制的篩選模型和應用常規誘變技術來提高靈芝菌株中靈芝多糖產量。利用耐靈芝多糖反饋抑制的篩選模型，篩選及優化菌株發酵過程中所需條件，過程繁瑣，不能從根本上對菌株進行改造，產率的提高有限。而對菌株進行常規誘變，例如紫外或者微波誘變等，效率低，如想獲得高效率的靈芝菌株，需要對大批量的原始菌株進行誘變，且該方法篩出的菌株的變異幅度較小，很難大規模的提高發酵產物中目的產物靈芝多糖的產率。此外常規誘變會發生「表型延遲」效應，即當代菌株並不表現出產量提高的優點，不能及時對其進行選育，易被丟棄，並且易發生「遺傳分離現象」，即突變株並不穩定，不能長久的用於大規模的靈芝菌株生產。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是提供一株遺傳性更穩定、生長更快、靈芝多糖含量更高的太空誘變高效靈芝菌、其應用及其膠囊製劑的製備方法。
[0007]本發明所採用的技術方案是:
太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7,於2011年5月19日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.4877，其特徵在於:
其 18SrDNA 序列為 SEQ ID N0.2。
[0008]所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/maS7-T7在製備藥物中的應用。
[0009]所述的太空誘變高效靈芝菌iGanoderma Iucidum^l-rXl在製備保健品中的應用。
[0010]所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在製備藥物中的應用,其特徵在於:其在製備提高免疫力藥物中的應用。
[0011]所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在製備藥物中的應用,其特徵在於:
其在製備抗氧化藥物中的應用。
[0012]所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在製備藥物中的應用，其特徵在於:
其在製備提聞免疫力保健品中的應用。
[0013]所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma 7wci<*?)S7-T7在製備藥物中的應用，其特徵在於:
其在製備抗氧化保健品中的應用。
[0014]所述的太空誘變高效靈芝菌{Ganoderma Iucidum^l-Tl製備膠囊製劑的方法,其特徵在於:
由以下步驟實現:
步驟一:將靈芝菌株在發酵罐中培養7~8 d,發酵液4000 rpm離心15min,收集菌絲體,純化水洗滌菌絲體2次；
步驟二:洗滌後的菌絲體60°C烘乾；` 步驟三:將幹菌體粉碎後過80目篩，加入1.0%硬脂酸鎂、1.0%卡拉膠，混合均勻後按
0.5g/粒裝入膠囊,製成膠囊製劑。
[0015]步驟一中，發酵培養基的配方為:蛋白腖2%、蔗糖2%、KH2PO4 0.1%、MgSO4 7H20
0.05%、VB1 0.005%、水餘量。
[0016]本發明具有以下優點:
本發明所述的靈芝菌株與常規育種方法得到的菌株相比，從基因上改變了菌株的遺傳特性，彌補了常規誘變所帶來的「表型延遲」和「遺傳分離現象」，迅速獲得高質量的菌株並保證菌株的穩定性，大規模的提高菌株的產率，不需要經過對發酵條件進行大規模優化實驗的途徑來提高產量，而且所述菌株中靈芝多糖的含量大幅度提高，能夠用於進行大規模的生產，用於製備增強免疫力和抗氧化的藥物和保健品。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017]圖1示地面對照菌株高倍鏡觀察照片；
圖2示本發明所述靈芝菌株高倍鏡觀察照片；
圖3示地面對照菌株結晶紫染色照片；
圖4示本發明所述靈芝菌株結晶紫染色照片；
圖5示地面對照菌株掃描電鏡照片，放大倍數5000 ；
圖6示本發明所述靈芝菌株掃描電鏡照片，放大倍數5000 ；
圖7示地面對照菌株和本發明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級結構的Vl可變區；A:地面對照菌株:本發明所述靈芝菌株；
圖8示地面對照菌株和本發明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級結構的V2可變區；A:地面對照菌株:本發明所述靈芝菌株；
圖9示地面對照菌株和本發明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級結構的V3可變區；A:地面對照菌株；B:本發明所述靈芝菌株；
圖10示地面對照菌株和本發明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級結構的V4可變區；A:地面對照菌株:本發明所述靈芝菌株；
圖11示地面對照菌株和本發明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級結構的V5可變區；A:地面對照菌株:本發明所述靈芝菌株；
圖12示地面對照菌株和本發明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級結構的V6可變區；A:地面對照菌株:本發明所述靈芝菌株；
圖13示地面對照菌株和本發明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級結構的V7可變區；A:地面對照菌株:本發明所述靈芝菌株；
圖14示地面對照菌株和本發明所述靈芝菌株的18S rDNA二級結構的V8可變區；A:地面對照菌株:本發明所述靈芝菌株；
圖15示地面對照菌株和本發明所述靈芝菌株的18S rDNA 二級結構的V9可變區；A:地面對照菌株:本發明所述靈芝菌株；
圖16示地面對照菌株和本發明所述靈芝菌株SDS-PAGE分析結果泳道 1:分子量 Marker ;從上至下依次為 97.2kDa、66.4kDa、44.3kDa、29.0kDa,20.lkDa、14.3kDa ；
泳道2:地面對照菌株裂解物；
泳道3:本發明所述靈芝菌株第I代菌體裂解物；
泳道4:本發明所述靈芝菌株30代傳代菌體裂解物。
【具體實施方式】
[0018]下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細的說明。
[0019]本發明所述的一株太空誘變高效靈芝菌、Ganoderma lucidum') S7-T7,於2011年5月19日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所,建議分類命名為靈芝(Ganochrma lucidum),保藏編號為CGMCC N0.4877。
[0020]下述內容中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為常規生化試劑。
[0021]一、篩選培養:
本發明所述的靈芝菌iGanoderma lucidum),是一株利用神舟七號載人太空飛行器將待突變的地面對照菌株S7-D7 (保藏編號為CGMCC 5.0706)帶上太空，經誘變使生物基因組DNA的鹼基產生變異，並造成DNA的斷裂和重組，產生基因突變。然後在地面進行篩選，比較空間誘變獲得的20株單克隆菌株菌絲日生長長度和液體培養菌體乾重後，獲得的一株有利、高效的正突變菌株。其具體篩選過程如下:
1、培養基
PDA 液體培養基:馬鈴薯 200.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，MgSO4 1.5 g/L, KH2PO4 3.0 g/L, VB1 0.01 g/L ；
PDA 固體培養基:馬鈴薯 200.0 g/L，葡萄糖 20.0 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KH2PO4 3.0 g/L7VB1 0.01 g/L，瓊脂 20.0 g/L。[0022]2、空間誘變
2008年9月，將待突變的地面對照菌株S7-D7分為2份，1份作為對照菌株於4°C保存，1份搭載神舟七號載人太空飛行器進行空間誘變。
[0023]3、誘變菌株篩選
每50mL試管接入15mL左右PDA固體培養基製成斜面，挑取經空間誘變獲得的單克隆S7-T7菌株20株，分別接種於試管斜面上，於25 °C恆溫培養5 d，在菌絲生長前沿做標記，繼續培養72 h，遊標卡尺測量日生長長度。從固體培養基中挑取上述20株單克隆菌株，分別接種於含50 mL PDA液體培養基的250 mL三角瓶中，25°C恆溫培養7 d，12000 rpm離心，收集菌體，70°C恆溫乾燥24 h，分別稱取菌體乾重。試驗重複三次，取平均值，試驗過程中地面對照菌株S7-D7作為對照，結果如表1所示。
[0024]表1空間誘變菌株生長速度的測定結果
【權利要求】
1.太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma7wcii//7?)S7-T7,於2011年5月19日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.4877，其特徵在於:
其 18SrDNA 序列為 SEQ ID N0.2。
2.權利要求1所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloiferaaS7-T7在製備藥物中的應用。
3.權利要求1所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma7wci<*?)S7-T7在製備保健品中的應用。
4.根據權利要求2所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/maA/ci<*?)S7-T7在製備藥物中的應用，其特徵在於: 其在製備提高免疫力藥物中的應用。
5.根據權利要求2所述的太空誘變高效靈芝菌7mii/_)S7-T7在製備藥物中的應用，其特徵在於: 其在製備抗氧化藥物中的應用。
6.根據權利要求3所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/maA/ci<*?)S7-T7在製備藥物中的應用，其特徵在於: 其在製備提聞免疫力保健品中的應用。
7.根據權利要求3所述的太空誘變高效靈芝菌7mii/?)S7-T7在製備藥物中的應用，其特徵在於: 其在製備抗氧化保健品中的應用。
8.利用權利要求1所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/ma7wci<*?)S7-T7製備膠囊製劑的方法，其特徵在於: 由以下步驟實現: 步驟一:將靈芝菌株在發酵罐中培養7~8 d,發酵液4000 rpm離心15min,收集菌絲體,純化水洗滌菌絲體2次； 步驟二:洗滌後的菌絲體60°C烘乾； 步驟三:將幹菌體粉碎後過80目篩，加入1.0%硬脂酸鎂、1.0%卡拉膠，混合均勻後按0.5g/粒裝入膠囊,製成膠囊製劑。
9.根據權利要求8所述的太空誘變高效靈芝菌(fefloofe/maA/ciMgSO4.7H20 0.05%、VB1 0.005%、水餘量。
【文檔編號】A61K36/074GK103548556SQ201310217079
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年6月4日 優先權日:2013年6月4日
【發明者】趙恆
申請人:神舟太空產品高科技成果推廣中心集團有限公司