一種雷公藤多苷提取物及其提取方法
2023-05-24 17:17:46
專利名稱：一種雷公藤多苷提取物及其提取方法
技術領域：
本發明涉及一種植物提取物及其提取方法，具體的涉及一種雷公藤多苷提取物及其提取方法。
背景技術：
雷公藤屬在我國主要分布於長江流域以南山區和東北長白山區，民間廣泛流傳用作為治療關節炎、跌打損傷、皮膚病等的草藥，也用於農藥。在臨床上國內對雷公藤的研究取得了顯著的成效和突破，從治療風溼性關節炎已發展到治療紅斑狼瘡、銀屑病、腎炎和腫瘤研究等多種常見病和疑難雜症，由於其應用面廣、療效顯著，且對疑難頑症具有獨特治療作用而逐漸成為國內外、中醫、西醫、中西醫各專家矚目和研究的熱點。
中醫學中，雷公藤的傳統提取方法採用水煎濃縮。此方法投料量有限，溫度要求高，操作有較高要求，產量低，不適合工業化生產。現有的應用於工業化生產的雷公藤提取物的提取方法主要有下述幾種1.提取法將雷公藤藥材用水煎煮提取。該方法汙染，水用量大，能耗大。
2.乙醇提取法將雷公藤用乙醇提取，之後用氯仿萃取並濃縮至幹。生產效率極低，乙醇投料大且損耗大，不易於大規模工業生產。
3.乙酸乙酯提取法將雷公藤用乙醇提取，之後用乙酸乙酯萃取，再用氯仿萃取並濃縮至幹。
上述3種方法提取的產品質量不好，其中藥效成分雷公藤甲素等萜類化合物的提取率低。
4.柱層析法該方法產品純度較高，但投料量小，大規模生產操作要求高，不易於大規模工業應用。
自二十世紀80年代初期發現雷公藤療效後，許多藥廠紛紛生產雷公藤提取物產品。但是，由於目前對雷公藤製劑的藥理研究很少，缺乏正規的藥理資料，且對於藥效成分無統一的質量控制標準，各廠家生產的雷公藤製劑所含組分和藥效成分含量不盡相同，因此，市面上的雷公藤製劑的藥理效果和毒副作用有很大的差異。其中，很多產品藥理效果不好，且毒副作用大。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的提取方法提取的雷公藤多苷中藥效成分含量不高，產品質量不好，或者工藝不易於大規模工業生產等問題，而提供一種產品藥效成份高，藥理效果好，且操作簡便，成本低，生產周期短，對環境汙染少，易應用於大規模的工業生產的雷公藤多苷提取方法，以及其雷公藤多苷產品。
本發明的方法採用水提並醇提，吸附與柱層析並行的提純工藝，具體包括如下步驟(1)提取粗品將雷公藤粉末用水煮提取，再用醇或醇的水溶液提取，將提取液合併，濃縮至醇含量小於或等於體積百分比20％，之後用有機溶劑萃取，製得含粗品的萃取液，濃縮至幹得粗品。本發明的方法在粗提部分選擇水煮和醇的水溶液分別提取，將有效成分更多的提取保存了出來，並減少了用水量。
其中，雷公藤可選用葉、花、根、莖各部，較佳的選用木質部，經精選研碎後製得粉末。
其中，所述的水煮提取的次數較佳的為1～3次；水的用量較佳的為雷公藤粉末重量的3～10倍；水煮的溫度較佳的為50～100℃；水煮的時間較佳的為30～60分。
其中，所述的醇或醇的水溶液提取的次數較佳的為1～3次；所述的醇可選自低級醇，較佳的為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇；醇的水溶液中醇的濃度較佳的為體積百分比40％以上；醇或醇的水溶液的用量較佳的為雷公藤粉末重量的6～10倍；醇的水溶液提取的溫度較佳的為20～50℃；醇的水溶液提取的時間較佳的為8～24小時。
其中，所述的萃取的次數為較佳的為1～3次；使用的有機溶劑較佳的選自石油醚、低級滷代烷烴、環烷烴、烷烴、低級脂肪酮或酯；有機溶劑的用量為較佳的為提取液濃縮後體積的1～3倍；每次萃取的時間較佳的為30～60分鐘。
雷公藤多苷粗品為疏鬆紅棕色粉末，收率約為5～18wt‰。採用不同有機溶劑進行萃取所得的粗品的收率如表1所示。
表1採用不同有機溶劑進行萃取所得的粗品收率
(2)粗品精製用有機溶劑溶解粗品，加入吸附劑進行吸附，過濾，將濾餅用梯度有機溶劑的溶液進行洗脫，收集有效部分的洗脫液，濃縮，再進行柱層析，用梯度有機溶劑的溶液進行洗脫，收集含有效成分的洗脫液，濃縮至幹，即得精製雷公藤多苷。本發明方法中的吸附過程能夠有效提高產品純度，操作簡單，便於大規模工業化操作，能夠有效節省勞動力成本，縮短生產周期，節約時間成本；梯度洗脫提高了柱層析的分離效果，成品質量有效提高。
其中，溶解雷公藤多苷粗品所用的用有機溶劑較佳的為石油醚、滷代烷烴、環烷烴、烷烴、低級脂肪酮或酯。
其中，所述的吸附劑較佳的為矽膠、中性氧化鋁、纖維素或硅藻土；吸附劑的用量較佳的為粗品質量的10～20倍。；吸附的時間為較佳的為30～60分。
吸附後過濾，將濾餅用梯度有機溶劑的溶液進行洗脫，收集有效部分的洗脫液。其中，所述的有機溶劑較佳的選自石油醚、滷代烷烴、環烷烴、烷烴、低級脂肪酮或酯，所述的梯度有機溶劑的溶液較佳的為梯度在體積百分比1～20％間的滷代烷烴或烷烴的醇溶液，或梯度在體積百分比1～20％的環烷烴的丙酮溶液，或能夠達到同樣展開效果的其它梯度有機溶劑；所述的滷代烷烴較佳的為二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿或四氯化碳；所述的環烷烴較佳的為環己烷或環戊烷；所述的烷烴較佳的為己烷或戊烷；所述的低級脂肪酮較佳的為丙酮或甲乙酮；所述的酯較佳的為乙酸乙酯。較佳的梯度洗脫的有機溶劑的溶液及其用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3～4毫升；3％的梯度，用量為1.5～2毫升；5％的梯度，用量為2～3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為3～5毫升；15％的梯度，用量為4～6毫升；百分比為體積百分比。
其中，所述的有效部分的洗脫液以採用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標準品對照進行確認。將洗脫液濃縮後，製得幹浸膏，可再加入有機溶劑，按上述方法進行二次吸附洗脫。吸附洗脫後進行濃縮，最好濃縮至幹，再加入有機溶劑溶解，進行後續的柱層析。
柱層析的方法按常規操作進行，使用梯度有機溶劑的溶液進行洗脫，收集含有效成分的洗脫液。其中，每個梯度的有機溶劑的溶液的用量和時間，梯度有機溶劑的溶液的種類和配比，較佳的梯度洗脫的有機溶劑的溶液及其用量同前述。洗脫後的有效部分的洗脫液的確認同前述。
將柱層析後的洗脫液濃縮至幹，即製得精製雷公藤多苷產品。採用不同有機溶劑進行梯度洗脫所得的精製雷公藤多苷產品的收率如表2所示。
表2採用不同有機溶劑進行梯度洗脫所得的精製雷公藤多苷產品的收率
本發明的方法中，所用的醇和其他有機溶劑可全部回收循環使用，從而減少了成本，對環境友好。
本發明還涉及由上述方法製得的雷公藤多苷提取物，以及含有該雷公藤多苷提取物的藥物組合物。該藥物組合物包含治療有效量的本發明的雷公藤多苷和藥學上可接受的載體。本發明中，所述的藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，如稀釋劑，賦形劑(如水等)，粘合劑(如纖維素衍生物、明膠、聚乙烯吡咯烷酮等)，填充劑(如澱粉等)，崩裂劑(如碳酸鈣、碳酸氫鈉)。另外，還可以在組合物中加入其他輔助劑，如香味劑和甜味劑等。
本發明的藥物組合物，可以通過靜脈注射、皮下注射或口服的形式施加於需要治療的患者。用於口服時，可將其製備成常規的固體製劑如片劑、粉劑或膠囊等；用於注射時，可將其製備成注射液。本發明的藥物組合物的各種劑型可以採用醫學領域常規的方法進行製備。其中雷公藤內酯甲的含量可為不少於重量百分比0.01％。上述藥物組合物施加於需要治療的患者的一般劑量可為1～1.5mg雷公藤多苷成分/公斤體重/天，具體可根據患者的年齡和病情等變化。
本發明所用試劑及原料均市售可得。
本發明的積極進步效果在於本發明的方法採用水提並醇提，吸附與柱層析並行的提純工藝，製得的雷公藤多苷藥效成分含量高，且操作簡便，成本低，生產周期短，所用有機試劑可全部回收循環使用，對環境友好，易應用於大規模的工業生產，具有較高的工業應用價值。由本發明的方法製得的雷公藤多苷藥效成分含量高，且含量比例適度，藥理效果好，毒副作用小。
圖1為效果實施例中雷公藤甲素標準曲線。
圖2為效果實施例中雷公藤內酯甲標準曲線。
具體實施例方式
下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。
實施例1雷公藤木質部經揀選、處理為小塊，由粉碎機粉碎為粉末。稱取150Kg粉末，置於多用提取鍋中，用5倍重量的水攪拌均勻，在提取鍋中直接通蒸汽加熱至80℃-100℃，蒸煮1h，待冷卻至常溫，收集濾液。再加6倍重量的乙醇，浸泡8h，溫度30℃，放出乙醇提取液，以同樣的方法再次加入乙醇，浸泡一次，合併提取液。
提取液抽至蒸餾鍋，首先打開冷凝器和冷卻器的進水閥門，再慢慢將反應鍋夾道的冷卻水放出，控制好蒸汽的流量和鍋內溫度70-100℃左右，直至藥液中含乙醇濃度小於體積百分比20％為止。
加入與濃縮液等體積的氯仿回流提取三次，每次提取60min後，使氯仿萃取液和原乙醇提取液分出上下兩層，放出氯仿萃取液，將三次萃取液合併，脫水過濾，常壓蒸餾回收氯仿。控制好鍋內溫度和壓力，減壓抽真空，真空度-0.07MPa以下，濃縮得疏鬆紅棕色粉末即為雷公藤多苷粗品提取物。
將上步的雷公藤多苷粗粉用氯仿，先溶解成溶液，然後緩緩加入混有氯仿的矽膠(100-200目)中，矽膠的用量為粗品質量的15倍，攪拌進行吸附1h，過濾抽乾，濾液為無效成份。
濾餅以1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的氯仿乙醇溶液梯度洗脫，溶液用量以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3.5毫升；3％的梯度，用量為1.8毫升；5％的梯度，用量為2.5毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4毫升；15％的梯度，用量為5毫升。採用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標準品對照確認有效洗脫梯度。過濾抽乾，將有效濾液濃縮，回收氯仿，濃縮後得幹浸膏。將幹浸膏再加入氯仿稀釋成溶液，重複進行二次吸附洗脫，減壓抽真空濃縮後得幹浸膏，待柱層析備用。
在直徑9cm左右層析柱中，先裝入氯仿少許，然後推入藥棉(做成球狀)置於柱底部鋪平。溼法裝矽膠，排盡柱內氣泡，靜置24h以上壓實，開活塞放出矽膠劑上面多餘的氯仿，粒體開始收縮，自然壓緊柱體。
將柱中加入幹浸膏的稀釋液，分別加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的氯仿乙醇液進行梯度洗脫，溶液用量以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3.5毫升；3％的梯度，用量為1.8毫升；5％的梯度，用量為2.5毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4毫升；15％的梯度，用量為5毫升。用分瓶收集洗脫液。將收集的小瓶洗脫液分別點樣於矽膠G板上進行薄層層析後，用紫外分析儀相應波長下鑑別洗脫液是否含有效成分，收取有效瓶樣，將有效瓶樣的洗脫液濃縮抽乾得有效成份。將分取的有效成份經乾燥、化驗、配比，混合過100目篩，包裝，即為成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量為0.15wt％，雷公藤內酯甲的含量為0.32wt％。將所用所有有機試劑回收循環使用。
雷公藤多苷粉的檢驗方法，採用薄層層析法，與標準品對照一致，成份相同。多苷粉採用LD50急性毒性試驗LD50＝155±15mg/Kg，理化性質雷公藤多苷為黃色或棕黃色粉末，味苦，熔點100～120℃。雷公藤多苷按江蘇省衛生廳蘇衛藥萍字[84]第76號文執行。
實施例2雷公藤木質部經揀選、處理為小塊，由粉碎機粉碎為粉末。稱取150Kg粉末，置於多用提取鍋中，用3倍重量的水攪拌均勻，在提取鍋中直接通蒸汽加熱至50℃-60℃，蒸煮40分，待冷卻至常溫，收集濾液。重複用水提取2次。再加10倍重量的體積百分比90％甲醇水溶液(體積百分比)，浸泡24h，溫度20℃，放出甲醇提取液。合併提取液。
提取液抽至蒸餾鍋，首先打開冷凝器和冷卻器的進水閥門，再慢慢將反應鍋夾道的冷卻水放出，控制好蒸汽的流量和鍋內溫度70-100℃左右，直至藥液中含甲醇濃度小於體積百分比10％為止。
加入3倍濃縮液體積的石油醚回流提取一次，提取40min後，使石油醚萃取液和原提取液分出上下兩層，放出石油醚萃取液，脫水過濾，常壓蒸餾回收石油醚。控制好鍋內溫度和壓力，減壓抽真空，真空度-0.07MPa以下，濃縮得疏鬆紅棕色粉末即為雷公藤多苷粗品提取物。
將上步的雷公藤多苷粗粉用石油醚先溶解成溶液，然後緩緩加入混有石油醚的中性氧化鋁(100-200目)中，中性氧化鋁的用量為粗品質量的10倍，攪拌進行吸附1h，過濾抽乾，濾液為無效成份。
濾餅用％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的石油醚乙醇溶液梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3毫升；3％的梯度，用量為1.5毫升；5％的梯度，用量為2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為3毫升；15％的梯度，用量為4毫升。採用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標準品對照確認有效洗脫梯度。過濾抽乾，將有效濾液濃縮，回收石油醚，濃縮後得幹浸膏，待柱層析備用。
在直徑10cm左右層析柱中，先裝入石油醚少許，然後推入藥棉(做成球狀)置於柱底部鋪平。溼法裝矽膠，排盡柱內氣泡，靜置24h以上壓實，開活塞放出矽膠劑上面多餘的石油醚，粒體開始收縮，自然壓緊柱體。
將柱中加入幹浸膏的稀釋液，分別加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的石油醚乙醇液進行梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3毫升；3％的梯度，用量為1.5毫升；5％的梯度，用量為2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為3毫升；15％的梯度，用量為4毫升。用分瓶收集洗脫液。將收集的小瓶洗脫液分別點樣於矽膠G板上進行薄層層析後，用紫外分析儀相應波長下鑑別洗脫液是否含有效成分，收取有效瓶樣，將有效瓶樣的洗脫液濃縮抽乾得有效成份。將分取的有效成份經乾燥、化驗、配比，混合過100目篩，包裝，即為成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量為0.12wt％，雷公藤內酯甲的含量為0.30wt％。將所用所有有機試劑回收循環使用。
實施例3雷公藤木質部經揀選、處理為小塊，由粉碎機粉碎為粉末。稱取150Kg粉末，置於多用提取鍋中，用10倍重量的水攪拌均勻，在提取鍋中直接通蒸汽加熱至95℃-100℃，蒸煮30分，待冷卻至常溫，收集濾液。重複用水提取1次。再加6倍重量的體積百分比40％異丙醇水溶液(體積百分比)，浸泡15h，溫度50℃，放出異丙醇提取液，重複再提取兩次，合併提取液。
提取液抽至蒸餾鍋，首先打開冷凝器和冷卻器的進水閥門，再慢慢將反應鍋夾道的冷卻水放出，控制好蒸汽的流量和鍋內溫度70-100℃左右，直至藥液中含異丙醇濃度小於體積百分比5％為止。
加入2倍濃縮液體積的環己烷回流提取兩次，每次提取50min後，使環己烷萃取液和原提取液分出上下兩層，放出環己烷萃取液，將三次萃取液合併，脫水過濾，常壓蒸餾回收環己烷。控制好鍋內溫度和壓力，減壓抽真空，真空度-0.07MPa以下，濃縮得疏鬆紅棕色粉末即為雷公藤多苷粗品提取物。
將上步的雷公藤多苷粗粉用環己烷，先溶解成溶液，然後緩緩加入混有環己烷的纖維素(100-200目)中，纖維素的用量為粗品質量的18倍，攪拌進行吸附50分，過濾抽乾，濾液為無效成份。
濾餅1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的環己烷丙酮溶液梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為4毫升；3％的梯度，用量為2毫升；5％的梯度，用量為3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為5毫升；15％的梯度，用量為6毫升。採用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標準品對照確認有效洗脫梯度。過濾抽乾，將有效濾液濃縮，回收環己烷，濃縮後得幹浸膏，再進行二次吸附洗脫，濃縮後的幹浸膏，待柱層析備用。
在直徑12cm左右層析柱中，先裝入環己烷少許，然後推入藥棉(做成球狀)置於柱底部鋪平。溼法裝矽膠，排盡柱內氣泡，靜置24h以上壓實，開活塞放出矽膠劑上面多餘的環己烷，粒體開始收縮，自然壓緊柱體。
將柱中加入幹浸膏的稀釋液，分別加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的環己烷丙酮溶液進行梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為4毫升；3％的梯度，用量為2毫升；5％的梯度，用量為3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為5毫升；15％的梯度，用量為6毫升。用分瓶收集洗脫液。將收集的小瓶洗脫液分別點樣於矽膠G板上進行薄層層析後，用紫外分析儀相應波長下鑑別洗脫液是否含有效成分，收取有效瓶樣，將有效瓶樣的洗脫液濃縮抽乾得有效成份。將分取的有效成份經乾燥、化驗、配比，混合過100目篩，包裝，即為成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量為0.10wt％，雷公藤內酯甲的含量為0.25wt％。將所用所有有機試劑回收循環使用。
實施例4雷公藤木質部經揀選、處理為小塊，由粉碎機粉碎為粉末。稱取150Kg粉末，置於多用提取鍋中，用8倍重量的水攪拌均勻，在提取鍋中直接通蒸汽加熱至70℃-80℃，蒸煮50分，待冷卻至常溫，收集濾液。再加8倍的體積百分比60％正丁醇水溶液，浸泡20h，溫度25℃，放出正丁醇提取液，以同樣的方法再次加入體積百分比60％正丁醇水溶液，浸泡一次，合併提取液。
提取液抽至蒸餾鍋，首先打開冷凝器和冷卻器的進水閥門，再慢慢將反應鍋夾道的冷卻水放出，控制好蒸汽的流量和鍋內溫度70-100℃左右，直至藥液中含正丁醇濃度小於體積百分比10％為止。
加入同濃縮液等體積的己烷回流提取三次，每次提取30min後，使己烷萃取液和原提取液分出上下兩層，放出己烷萃取液，將三次萃取液合併，脫水過濾，常壓蒸餾回收己烷。控制好鍋內溫度和壓力，減壓抽真空，真空度-0.07MPa以下，濃縮得疏鬆紅棕色粉末即為雷公藤多苷粗品提取物。
將上步的雷公藤多苷粗粉用己烷，先溶解成溶液，然後緩緩加入混有己烷的硅藻土(100-200目)中，硅藻土的用量為粗品質量的18倍，攪拌進行吸附30分，過濾抽乾，濾液為無效成份。
濾餅1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的己烷的甲醇溶液梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3.5毫升；3％的梯度，用量為1.6毫升；5％的梯度，用量為2.8毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4.5毫升；15％的梯度，用量為5.5毫升。採用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標準品對照確認有效洗脫梯度。過濾抽乾，將有效濾液濃縮，回收己烷，濃縮後得幹浸膏，再進行二次吸附洗脫，濃縮至幹，待柱層析備用。
在直徑8cm左右層析柱中，先裝入己烷少許，然後推入藥棉(做成球狀)置於柱底部鋪平。溼法裝矽膠，排盡柱內氣泡，靜置24h以上壓實，開活塞放出矽膠劑上面多餘的己烷，粒體開始收縮，自然壓緊柱體。
用少量己烷溶解洗脫後濃縮的乾粉，加入柱中，分別加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的己烷的甲醇溶液液進行梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3.5毫升；3％的梯度，用量為1.6毫升；5％的梯度，用量為2.8毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4.5毫升；15％的梯度，用量為5.5毫升。用分瓶收集洗脫液。將收集的小瓶洗脫液分別點樣於矽膠G板上進行薄層層析後，用紫外分析儀相應波長下鑑別洗脫液是否含有效成分，收取有效瓶樣，將有效瓶樣的洗脫液濃縮抽乾得有效成份。將分取的有效成份經乾燥、化驗、配比，混合過100目篩，包裝，即為成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量為0.11wt％，雷公藤內酯甲的含量為0.25wt％。將所用所有有機試劑回收循環使用。
實施例5雷公藤木質部經揀選、處理為小塊，由粉碎機粉碎為粉末。稱取150Kg粉末，置於多用提取鍋中，用8倍重量的水攪拌均勻，在提取鍋中直接通蒸汽加熱至60℃-70℃，蒸煮40分，待冷卻至常溫，收集濾液。再加8倍的體積百分比80％乙醇水溶液，浸泡10h，溫度20℃，放出正丁醇提取液，以同樣的方法再次加入體積百分比80％乙醇水溶液，浸泡一次，合併提取液。
提取液抽至蒸餾鍋，首先打開冷凝器和冷卻器的進水閥門，再慢慢將反應鍋夾道的冷卻水放出，控制好蒸汽的流量和鍋內溫度70-100℃左右，直至藥液中含乙醇濃度小於體積百分比10％為止。
加入同濃縮液等體積的乙酸乙酯回流提取三次，每次提取60min後，使乙酸乙酯萃取液和原提取液分出上下兩層，放出乙酸乙酯萃取液，將三次萃取液合併，脫水過濾，常壓蒸餾回收乙酸乙酯。控制好鍋內溫度和壓力，減壓抽真空，真空度-0.07MPa以下，濃縮得疏鬆紅棕色粉末即為雷公藤多苷粗品提取物。
將上步的雷公藤多苷粗粉用丙酮，先溶解成溶液，然後緩緩加入混有丙酮的硅藻土(100-200目)中，硅藻土的用量為粗品質量的20倍，攪拌進行吸附30分，過濾抽乾，濾液為無效成份。
濾餅1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的四氯化碳的乙醇溶液梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3毫升；3％的梯度，用量為1.7毫升；5％的梯度，用量為2.2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4.2毫升；15％的梯度，用量為4.5毫升。採用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標準品對照確認有效洗脫梯度。過濾抽乾，將有效濾液濃縮，回收四氯化碳，濃縮後得幹浸膏，再進行二次吸附洗脫，濃縮至幹，待柱層析備用。
在直徑8cm左右層析柱中，先裝入己烷少許，然後推入藥棉(做成球狀)置於柱底部鋪平。溼法裝矽膠，排盡柱內氣泡，靜置24h以上壓實，開活塞放出矽膠劑上面多餘的己烷，粒體開始收縮，自然壓緊柱體。
用少量四氯化碳溶解洗脫後濃縮的乾粉，加入柱中，分別加入1％、3％、5％、7％、10％、12％、15％(體積百分比)的四氯化碳的乙醇溶液進行梯度洗脫，溶液用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3毫升；3％的梯度，用量為1.7毫升；5％的梯度，用量為2.2毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為4.2毫升；15％的梯度，用量為4.5毫升。用分瓶收集洗脫液。將收集的小瓶洗脫液分別點樣於矽膠G板上進行薄層層析後，用紫外分析儀相應波長下鑑別洗脫液是否含有效成分，收取有效瓶樣，將有效瓶樣的洗脫液濃縮抽乾得有效成份。將分取的有效成份經乾燥、化驗、配比，混合過100目篩，包裝，即為成品雷公藤多苷原粉。其中，雷公藤甲素的含量為0.10wt％，雷公藤內酯甲的含量為0.25wt％。將所用所有有機試劑回收循環使用。
效果實施例高效液相色譜測定雷公藤甲素和雷公藤內酯甲含量(儀器Agilent.1100Series高效液相色譜儀)(一)雷公藤甲素測定1、對照品溶液的製備取雷公藤甲素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解並製成每毫升約含50ug的溶液。
2、供試品溶液的製備取各廠家雷公藤多苷片各50片，取約1.5克，精密稱定，加入乙酸乙酯10mL溶解，稱重，超聲提取，再稱重加乙酸乙酯補足損失量，搖勻，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL，加至用乙酸乙酯溼法裝好的中性氧化鋁(3g內徑1cm，70-350目)柱上(室溫條件下)，用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，旋轉蒸發儀蒸除乙酸乙酯，殘渣以甲醇轉移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
3、測定精密吸取供試品溶液10μL，照HPLC法(中國藥典2005年版一部)操作。色譜條件柱溫30℃，流動相甲醇-0.01mol/L磷酸二氫鉀(3565)，流速1.00mL/min。在225nm波長處測定供試品和對照品的峰面積，計算即得。
(二)雷公藤內酯甲測定1、對照品溶液的製備取雷公藤內酯甲對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解並製成每毫升中約含0.1mg的溶液。
2、試品溶液的製備取各廠家雷公藤多苷片各50片，取約1.5克，精密稱定，加入乙酸乙酯10mL溶解，稱重，超聲提取，稱重並加入乙酸乙酯補足損失量，離心(3000r/min)。精密吸取上清液5mL至已用乙酸乙酯溼法裝好的中性氧化鋁(3g，內徑1cm，70-350目)柱上(室溫條件下)，用乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，旋轉蒸發除去乙酸乙酯，殘渣以甲醇轉移至5mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。
3、測定精密吸取供試品溶液20μL，照HPLC法(中國藥典2005年版一部附錄)操作。色譜條件柱溫30℃，流動相甲醇-乙晴-水(60∶25∶15)，流速1.0mL/min。在210nm波長處測定供試品和對照品的峰面積，計算即得。
標準曲線的製備分別精密稱取雷公藤甲素和雷公藤內酯甲對照品8.15mg、6.04mg，用甲醇溶解並定容至25mL作為儲備液。分別精密吸取儲備液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL和0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0置5mL量瓶中，按色譜條件與系統適用性試驗。分別繪製曲線，並計算得回歸方程Y1＝1714.2X+0.7818，Y2＝507.02X-0.0258；R1＝1.0000，R2＝0.9998。表明在0.163～1.630μg、0.484～4.840μg之間兩者有較好的線性關係(見圖1和圖2)。
表1 雷公藤甲素標準曲線測定
表2 雷公藤酯甲標準曲線測定
表3給出了由實施例1的方法5個批次製得的雷公藤多苷原粉製得的雷公藤多苷片和其他生產企業生產的雷公藤多苷片中雷公藤甲素和雷公藤內酯甲的含量對比。
表3 不同生產企業雷公藤多甙片甲素、內酯甲含量對比表
由表3數據看出，本發明的雷公藤多苷提取物製得的雷公藤多苷片與其他生產企業生產的雷公藤多苷片相比，其中所含雷公藤甲素和雷公藤內酯甲的含量及比例有較大不同，處於適中的範圍。由以上兩種可檢測成分為代表表明，本發明的雷公藤多苷提取物製得的雷公藤多苷片中藥效成分含量及比例適中。
由下述雙倍劑量雷公藤多苷治療原發性腎病綜合症的實驗表明由本發明的方法製得的雷公藤多苷藥理效果好，毒副作用小。
1 對象和方法1.1病例選擇18例患者均符合以下條件①臨床表現為單純NS，無或僅有很少量鏡下血尿，腎功能正常，無感染及血栓等併發症。其中一部分患者曾用激素治療；②組織學改變為繫膜增生性病變；③無肝功能異常，外周血白細胞計數正常；④排除繼發性腎小球腎炎。其中男性13例，女性5例，平均年齡24.4±8.6歲，病程半個月～12年。治療前的臨床情況見表1。
18例患者的腎活檢組織學診斷①IgA腎病(IgAN)8例，有5例以往曾接受激素治療，2例敏感，3例無效；②IgM腎病(IgMN)4例，2例用過激素敏感；③繫膜增生性腎小球腎炎(MsPGN)6例，以往3例用過激素，1例敏感，2例無效。
1.2 治療方法1.2.1 T II 泰州製藥廠生產雷公藤多甙片(本發明的雷公藤多苷片)1.2.2 給藥方案起始劑量2mg/(kg.d)分三次餐後口服(一般為10mg/片，4片，每日三次)，持續4周後改為1.5mg/(kg.d)×4周後減至1mg/(kg.d)維持。
1.3觀察項目①臨床觀察浮腫、尿量變化，消化道反應，有無皮疹等；②實驗室檢查尿量，尿蛋白定量；外周血象；肝腎功能及血漿蛋白等每周檢查一次，部分患者治療前進行尿蛋白SDS-PAGE平板電泳，分析尿蛋白組成。
1.4療效判斷①緩解尿蛋白消失或降至微量，定量在0.4g/24h以下；②改善尿蛋白比治療前減少50％以上；③無效未達上述標準。
2 結果2.1雙倍劑量T II對NS的療效本組18例原發性腎小球腎炎，治療後的臨床情況見表4。共有15例得到完全緩解，佔83.3％(見表5)。8例IgAN中7例緩解(佔87.5％)，1例改善。6例MsPGN中5例緩解(83.3％)，4例IgMN 3例緩解(75.0％)。18例中有5例以往曾用足量激素治療無效但經大劑量T II治療後獲得緩解。本組中有1例IgMN和1例MsPGN對T II無效。在緩解的15例中，治療1周即緩解者有4例，治療2周緩解者有8例，因此共有12例(佔緩解組的80％)在治療2周內尿蛋白消失(見表6)。原有浮腫、尿少的患者在服用T II後，可見明顯的利尿反應，浮腫很快消失。在1例T II治療無效的IgMN，儘管蛋白尿沒有明顯減少，但尿量明顯增加，浮腫也迅速消退。
表4 一般臨床情況及實驗室檢查結果
表5 T II對不同病理類型NS的療效
表6 患者症狀緩解出現時間
2.2 T II療效與尿蛋白成份的關係11 例患者治療前進行了尿液SDS2PAGE平板電泳檢查，發現緩解組患者的尿蛋白主要為白蛋白，無高分子及小分子蛋白質，而非緩解組尿蛋白組成中含有較多分子量＜2萬的蛋白質(佔8.5±4.6％)，同時存在較多大分子尿蛋白(佔21.0±14.7％)。
2.3 雙倍劑量T II治療的副反應治療中僅有個別病例有噁心、嘔吐或有食慾下降等胃腸不適，本組18例患者均能很好地耐受雙倍劑量T II治療。客觀檢查少數病例在治療初期SGPT短暫輕度升高(僅1例＞100U/L)，繼續治療後又恢復正常，無血清膽紅素升高。無一例出現白細胞減少至215×109/L以下，僅1例WBC降至3.1×109/L，但未影響治療。在觀察期內，所有病例腎功能保持正常(見表7)。
表7 治療的副反應(n＝18)
2.4 雙倍劑量治療後的復發情況2例患者在使用T II 2mg/(kg.d)4周，臨床症狀緩解後將T II劑量迅速減至1mg/(kg.d)，給藥2周後NS均復發。另2例患者在尿蛋白緩解後隨訪過程中因上感蛋白尿加重，繼續應用雙倍劑量治療後尿蛋白消失。其餘病例正在隨訪中，尚未見復發者。
權利要求
1.一種雷公藤多苷的提取方法，其特徵在於包括如下步驟(1)提取粗品將雷公藤粉末用水煮提取，再用醇或醇的水溶液提取，將提取液合併，濃縮至醇含量小於或等於體積百分比20％，之後用有機溶劑萃取，製得含粗品的萃取液，濃縮至幹得粗品；(2)粗品精製用有機溶劑溶解粗品，加入吸附劑進行吸附，過濾，將濾餅用梯度有機溶劑的溶液進行洗脫，收集有效部分的洗脫液，濃縮，再進行柱層析，用梯度有機溶劑的溶液進行洗脫，收集含有效成分的洗脫液，濃縮至幹，即得精製雷公藤多苷。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中，所述的水煮提取的次數為1～3次；所述的醇或醇的水溶液提取的次數為1～3次；所述的萃取的次數為1～3次；步驟(2)中，所述的向含粗品的萃取液中加入吸附劑進行吸附，過濾，將濾餅用梯度有機溶劑進行洗脫，收集有效部分的洗脫液的步驟的次數為1～2次。
3.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中，所述的水煮的溫度為50～100℃ 水煮的時間為30～60分。
4.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中，所述的醇或醇的水溶液提取的溫度為20～50℃；醇或醇的水溶液提取的時間為8～24小時。
5.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中，所述的水的用量為雷公藤粉末重量的3～10倍；所述的醇或醇的水溶液的用量為雷公藤粉末重量的6～10倍；所述的萃取用的有機溶劑的用量為提取液濃縮後體積的1～3倍。
6.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中，所述的醇的水溶液中醇的濃度為體積百分比40％以上。
7.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(1)中，所述的萃取每次的時間為30～60分鐘。
8.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(2)中，所述的吸附劑為矽膠、中性氧化鋁、纖維素或硅藻土。
9.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(2)中，所述的吸附劑的用量為粗品質量的10～20倍。
10.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(2)中，所述的吸附的時間為30～60分。
11.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述的有機溶劑為石油醚、滷代烷烴、環烷烴、烷烴、低級脂肪酮或酯。
12.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(2)中，所述的梯度有機溶劑的溶液為梯度在體積百分比1～20％間的滷代烷烴或烷烴的醇溶液，或梯度在體積百分比1～20％的環烷烴的丙酮溶液，或能夠達到同樣展開效果的其它梯度有機溶液。
13.如權利要求11或12所述的方法，其特徵在於所述的滷代烷烴為二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿或四氯化碳；所述的環烷烴為環己烷或環戊烷；所述的烷烴為己烷或戊烷；所述的低級脂肪酮為丙酮或甲乙酮；所述的酯為乙酸乙酯。
14.如權利要求1或12所述的方法，其特徵在於權利要求1的步驟(1)中或權利要求12中，所述的醇為甲醇、乙醇、異丙醇或正丁醇。
15.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(2)中，所述的梯度有機溶劑的溶液及每個梯度的溶液的用量為以每克吸附劑為參照，1％的梯度，用量為3～4毫升；3％的梯度，用量為1.5～2毫升；5％的梯度，用量為2～3毫升；7％、10％和12％的梯度，用量均為3～5毫升；15％的梯度，用量為4～6毫升；百分比為體積百分比。
16.如權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟(2)中，所述的有效部分的洗脫液以採用薄層層析和紫外364nm下檢測，與標準品對照進行確認。
17.如權利要求1所述的方法，其特徵在於將所述的醇和/或有機溶劑回收，循環使用。
18.如權利要求1所述的方法製得的雷公藤多苷。
19.含有如權利要求18所述的雷公藤多苷的藥物組合物。
全文摘要
一種雷公藤多苷的提取方法，包括(1)提取粗品將雷公藤粉末用水煮提取，再用醇或醇的水溶液提取，合併提取液，濃縮至醇含量≤體積百分比20％，再用有機溶劑萃取，濃縮至幹得粗品；(2)粗品精製用有機溶劑溶解粗品，加入吸附劑進行吸附，過濾，將濾餅用梯度有機溶劑的溶液進行洗脫，收集有效部分的洗脫液，濃縮，再進行柱層析，用梯度有機溶劑的溶液進行洗脫，收集含有效成分的洗脫液，濃縮至幹即可。本方法操作簡便，成本低，生產周期短，所用試劑可循環使用，對環境汙染少，易應用於大規模的工業生產。本發明還公開了由上述方法製得的雷公藤多苷及其藥物組合物。該產品藥效成分含量高，含量比例適度，藥理效果好。
文檔編號A61P13/00GK101088519SQ20071004385
公開日2007年12月19日 申請日期2007年7月17日 優先權日2007年7月17日
發明者林健 申請人:上海美通生物科技有限公司, 江蘇美通製藥有限公司