一種培育茯苓的方法
2023-04-25 03:46:26
專利名稱：一種培育茯苓的方法
技術領域：
本發明屬於微生物的培育方法，尤其是涉及一種培育茯苓的方法。
背景技術：
茯苓為一種多年生腐生真菌，屬於真菌門，具有藥用價值，是一味常用大宗中藥。野生茯苓通常在海拔500米以上，生長在地下20釐米左右的腐朽的松樹根或松樹段上。茯苓的生長發育可分為兩個階段，即菌絲生長階段和菌核形成階段，菌絲生長階段主要是菌絲從松木中吸收水分和營養，繁殖大量的營養菌，當菌絲越積越多時就成為菌核，到形成菌核階段時栽培上稱為結苓階段。目前人工培育茯苓的方法主要有幹段木栽培和松樹根栽培，段木栽培法以松木為栽培料，選擇直徑12釐米以上不成材的松樹砍倒，在農曆12月份砍下松樹，去樹杈，削去形成層的外皮，露出木質部，削皮留筋，鋸成60～80釐米長的木段，堆碼後乾燥，約40天後，無松脂分泌，木心乾燥後即可接種。松木段下窖的時間在春季3-4月份，下窖選擇晴天，每窖下松木段15-20公斤。接種方法目前有三種較普遍採用，一是菌絲引種，將栽培菌種內長滿菌絲的松木塊取出，順段木形成的「V」縫，一塊接一塊平鋪在上面，再撒上木屑等料種，然後將一根段木削皮處向下壓在松木塊上，使其呈「品」字形。二是老段木引種，選黃白色、筋皮下有明顯菌絲且有小茯苓又有特殊香氣的段木作種引。三是鮮茯苓引種，選1-2代種苓，種苓皮色紫紅，肉色白，漿氣足，質結實，個重2-3公斤的鮮苓作種引。將種苓切成小塊或小片放於段木之間，每一窖需500克左右鮮苓。接好種後，立即覆土，厚7-10釐米，使窖頂呈龜背形，以利排水。用松樹段木栽培茯苓要消耗大量木材。松樹根栽培法為首先挖開根周圍的土，露出松根，將側根刮開皮槽，曝曬數天，曬乾後即可接種。於5-8月間在松根開槽處接放菌種，用樹葉將其蓋好，覆土壓實即可。接後每10天檢查1次，發現病蟲害和白蟻要及時防治。9～12月茯苓膨大生長期要及時培土。第二年4-6月可採收，此方法雖能節約大量材耗但產量低，不能滿足需求。
發明內容
本發明的目的在於提供一種可取代現有茯苓栽培種植用材，不需採伐樹木，易於推廣，產量高的培育茯苓的方法。
本發明的技術方案在於，培育茯苓的方法採用菌種繁殖法。首先選取優良苓種，其標準為品質好，無病蟲害，個體較大，近球形，質地堅，皮紅，肉白，漿汁多，氣味濃鬱的茯苓菌核；然後進行母種保存和培養；最後在此基礎上進行原種和栽培種的製作和擴繁。其中母種的培養包括母種的分離和在培養基上的接種培養，原種的製作是將母種接種在培養基上進行培養，栽培種的製作是在培養基上進行發菌培養，具體工藝如下1、母種的分離和培養母種分離方法為用無菌水將種苓衝洗數次，再用紗布揩乾，最後用75％酒精擦洗種苓外皮，並用0.1％升汞擦洗乾淨後，進行紫外線滅菌；在無菌條件下，用無菌刀將種苓剖開，用酒精火焰滅菌後的接種鏟從種苓較深部位取出黃豆大小的苓肉，接入試管斜面上；配製母種培養基，其組分為馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水1000毫升，另加0.5克酵母粉，0.5克蛋白腖，PH值為5.5-6.5；母種的培養過程為在溫度28-32℃，培養2-3天，長出菌絲後，認定無雜菌即可繼續培養至菌絲長滿斜面。
2、原種的製作原種製作中用的培養基其配方為松木屑76％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；其接種培養過程為在無菌條件下，按常規將母種接入上述配製好的培養基瓶中，置28-32℃溫室中培養，經25-30天，菌絲長滿瓶即為原種。
3、栽培種的製作栽培種製作中所需的培養基配方為松木片(2釐米×10釐米×0.3釐米)65％，松木屑10％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，尿素0.2％；其發菌培養過程為將上述配料按常規配製後裝入15釐米×18釐米×0.005絲米的聚乙烯塑膠袋中，經滅菌接種後置28-32℃下培養，經25-30天，當菌絲長滿並深入至木片內後即可。
本發明提供的培育茯苓的方法，能培育出茯苓菌絲和茯苓菌核；由於在母種、原種、栽培種的培養過程中，其培養基由人工配製而成，不需要天然松木，因而不用採伐樹木，可用於大批量生產，種植成本低。經試驗，生產出的茯苓其外形與現有商品茯苓一致，顯微構造基本一致，多糖提取率相近，完全可替代商品茯苓入藥。這種茯苓種植用材代用品的開發，既能保證中醫臨床用藥，又有效地保護了森林資源，不失為中醫藥行業生產類似產品的一種行之有效的方法。
具體實施例方式
菌種培養的具體工藝如下1、選取優良苓種其標準為品質好，無病蟲害，個體較大，近球形，質地堅，皮紅，肉白，漿汁多，氣味濃鬱的茯苓菌核。
2、母種的分離和培養母種分離方法為用無菌水將種苓衝洗數次，再用紗布揩乾，最後用75％酒精擦洗種苓外皮，並用0.1％升汞擦洗乾淨後，進行紫外線滅菌；在無菌條件下，用無菌刀將種苓剖開，用酒精火焰滅菌後的接種鏟從種苓較深部位取出黃豆大小的苓肉，接入試管斜面上；母種培養基的配方為馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水1000毫升，另加0.5克酵母粉，0.5克蛋白腖，PH值為5.5-6.5；母種的培養過程為在溫度28-32℃，培養2-3天，長出菌絲後，認定無雜菌即可繼續培養至菌絲長滿斜面。
3、原種的製作原種製作中用的培養基的配方為松木屑76％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；其接種培養過程為在無菌條件下，按常規將母種接入上述配製好的培養基瓶中，置28-32℃溫室中培養，經25-30天，菌絲長滿瓶即為原種。
4、栽培種的製作栽培種製作中所需的培養基配方為松木片(2釐米×10釐米×0.3釐米)65％，松木屑10％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，尿素0.2％；其發菌培養過程為將上述配料按常規配製後裝入15釐米×18釐米×0.005絲米的聚乙烯塑膠袋中，經滅菌接種後置28-32℃下培養，經25-30天，當菌絲長滿並深入至木片內後即可。
茯苓菌種在松枝、木屑瓶內菌絲生長情況及試驗數據如下2003年5月22日，將直徑1釐米左右小松枝截短至15釐米，木屑分別浸泡在營養液中，待浸透後撈出，分別放入瓶中，高壓消毒後，5月30日接種茯苓菌種，接種兩天後菌絲開始生長，6月20日已形成菌索，8月9日已形成6×3釐米不等的白色塊狀物，其質地緻密，表面呈粉狀。菌絲生長情況如下表
表1茯苓菌絲在瓶內生長情況表
顯微比較研究商品茯苓(購於成都市藥材公司)，由茯苓成熟菌核分離得到茯苓菌絲為母種(瓊脂、馬鈴薯等)，由茯苓母種擴繁得到的茯苓菌絲為原種(木屑等)，由茯苓原種擴大培養得到茯苓菌絲為茯苓栽培種(即新配方生長的茯苓菌絲、菌核)。
1、商品茯苓的顯微特徵商品茯苓的粉末用水裝片，在顯微鏡下可觀察到無色不規則的顆粒狀團塊和分支狀團塊；用5％的NaOH溶液裝片，可見團塊溶化，露出菌絲，菌絲細長，稍彎曲，有分支，呈無色或淡棕色。
2、茯苓菌絲母種的顯微特徵茯苓菌絲母種的粉末，用水裝片和5％的NaOH溶液裝片觀察到菌絲，菌絲細長，稍彎曲，有分支，呈無色或淡棕色。
3、茯苓原種菌絲的顯微特徵茯苓菌絲原種的粉末，用水裝片時，可見到分支狀團塊，也可見到少量的菌絲；用5％的NaOH溶液裝片時，只能見到菌絲，菌絲細長，稍彎曲，有分支，呈無色或淡棕色。
4、新配方生長的茯苓菌絲、菌核的顯微特徵同上方法裝片只能見到菌絲，菌絲細長，稍彎曲，有分支，呈無色或淡棕色。與商品茯苓的顯微特徵基本一致。
提取工藝的確定茯苓水溶性多糖提取工藝的確定選用複合方法提取茯苓水溶性多糖。即將茯苓粉末(過40目篩)適量，用乙酸乙酯、丙酮於索氏提取器分別提取4小時，藥渣加入催化酶酶解，於60-70℃浸泡40分鐘，再依次用5倍量、3倍量、2倍量的沸水提取1小時。合併水提液，濾過，濾液濃縮至1/10，用Severge法除蛋白。上清液加入三倍量的乙醇沉澱多糖，冷藏12小時，離心，收集沉澱，低溫乾燥，即得。
茯苓鹼溶性多糖提取工藝的確定茯苓鹼溶性多糖含量較高，提取方法相對簡單，所得提取率較穩定。即將水提後的藥渣用稀NaOH溶液提取，鹼提液離心，所得上清液以10％的醋酸中和，3倍量乙醇沉澱，再提純即得。綜合考慮了生產可行性及經濟性，經反覆試驗後確定稀NaOH溶液用量為5倍量，提取2次，每次4小時。
茯苓多糖的提取定量實驗取低溫烘乾後的商品茯苓、母種、原種，新配方生長的茯苓菌絲、菌核適量精密稱定，按上述方法提取多糖，結果如下表表2茯苓多糖提取率
茯苓多糖含量測定採用苯酚—硫酸法，對商品茯苓、本發明新配方生長的茯苓菌絲和菌核、茯苓菌絲母種、茯苓菌絲原種進行茯苓多糖含量測定。測定結果如下表3茯苓多糖含量測定結果
由上可見，該發明新配方生長的茯苓菌絲、菌核與商品茯苓比較，多糖提取率相近，可代替商品茯苓入藥，並且該發明新配方生長的茯苓菌絲、菌核的培育成本低，可以大批量生產。
權利要求
1.一種培育茯苓的方法，其特徵在於該方法包括選取優良苓種、母種保存和培養、在此基礎上進行原種和栽培種的製作和擴繁，具體工藝如下(1)母種的培養母種分離方法為用無菌水將種苓衝洗數次，再用紗布揩乾，最後用75％酒精擦洗種苓外皮，並用0.1％升汞擦洗乾淨後，進行紫外線滅菌；在無菌條件下，用無菌刀將種苓剖開，用酒精火焰滅菌後的接種鏟從種苓較深部位取出黃豆大小的苓肉，接入試管斜面上；母種培養基的配製為馬鈴薯200克，葡萄糖20克，瓊脂20克，水1000毫升，0.5克酵母粉，0.5克蛋白腖，pH5.5-6.5；母種培養過程為在溫度28-32℃，培養2-3天，長出菌絲後，認定無雜菌即可繼續培養至菌絲長滿斜面；(2)原種的製作原種培養基的配製為松木屑76％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，含水量50％-55％，pH5.5-6.5；原種接種培養過程為在無菌條件下，按常規將母種接入上述配製好的培養基瓶中，置28-32℃溫室中培養，經25-30天，菌絲長滿瓶即為原種；(3)栽培種的製作栽培種培養基的配方為形狀為2釐米×10釐米×0.3釐米的松木片65％，松木屑10％，麩皮20％，糖2％，石膏粉1％，過磷酸鈣1％，尿素0.2％；栽培種發菌培養過程為將上述配料按常規配製後裝入15釐米×18釐米×0.005絲米的聚乙烯塑膠袋中，經滅菌接種後置28-32℃下培養，經25-30天，當菌絲長滿並深入至木片內後即可。
全文摘要
本發明公開了一種培育茯苓的方法，屬於微生物培育方法的技術領域，採用菌種繁殖法，選取優良苓種，進行母種保存和培養，在此基礎上進行原種和栽培種的製作和擴繁；母種的培養包括母種的分離和在培養基上的接種培養，原種的製作為將母種接種在培養基上進行培養，栽培種的製作為在培養基上進行發菌培養；本發明提供的培育茯苓的方法，可以培育出茯苓菌絲和菌核，在母種、原種、栽培種的培養過程中，其培養基由人工配製而成，不需要天然松木，因而不用採伐樹木，可用於大批量生產，種植成本低。
文檔編號A01G1/00GK1732761SQ20051002136
公開日2006年2月15日 申請日期2005年7月29日 優先權日2005年7月29日
發明者何俊蓉, 李萍, 徐利遠 申請人:四川省農業科學院生物技術核技術研究所