香菇野生47和50菌種的分子特異標記及方法與應用的製作方法

2023-04-25 03:39:16 6

專利名稱：香菇野生47和50菌種的分子特異標記及方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，具體涉及一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記及其獲得方法與應用。
背景技術：
我國香菇產量已從1983年的1.95萬噸迅速發展到2005年的242萬噸，佔全球香菇總產量的70％以上，改寫了世界食用菌產量的排行榜，並不斷縮小與排行第一的雙孢蘑菇產量差距，有專家預測，由於中國香菇產業的迅猛發展，在近10年內其將成為世界產量最高的食用菌。中國香菇以其驚人的發展速度，優質的品質及低廉的成本為世界菇業人士矚目，中國香菇已風靡世界。
優質菌種在香菇單產和質量中的貢獻率舉足輕重，這決定了香菇菌種在香菇產業中的重要地位。1999年我國籤署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種智慧財產權，同時也要加強保護我們國家自己的品種智慧財產權，為了建立食用菌新品種登記制度來真正保護我國的品種產權，必須首先建立成熟的品種鑑定技術，為新品種登記奠定基礎。尤其日本2004年4月1日開始實行《種苗法修正案》，對我國食用菌尤其是香菇的出口構成了極大的威脅。就國內而言，香菇栽培菌種「同種異名，異種同名」的現象，不僅給菇農帶來了極大的損失，影響了他們的栽培積極性，也極大地影響了中國香菇的快速發展；而且，隨著大規模的工廠化栽培方式的出現，對香菇栽培菌株質量的要求越來越高，需要發展更為簡便、快速、準確的菌株鑑定技術，以保證每批次的用種都準確無誤。
隨著分子生物學技術的快速發展，特別是分子標記和基因標記技術的建立與成熟，為發展簡便、快速、準確的菌株鑑定技術提供了有效手段。SCAR(Sequence CharacterizedAmplified Region)標記是一種十分穩定的分子標記，在應用上具有迅速、簡便、低成本的特點，本發明建立了香菇野生47和50菌種的SCAR分子標記，能對香菇野生47和50菌種進行快速鑑定。

發明內容
本發明的目的是為了能對香菇野生47和50菌種進行簡便、快速、準確的鑑定和檢測，提供了一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記，同時提供了這種香菇野生47和50菌種的分子標記的獲得方法。
一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記為700bp大小的特異片段，其特異性PCR擴增引物對序列為5′GTTCAAAGTCACAGATTAC3′和5′AAGAAGGAGAATGTTCAGCC3′。
一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記的獲得方法，包括下列步驟(1)菌絲培養和基因組DNA的提取。
(2)香菇菌株野生47和50的特異DNA片斷的獲得採用PCR技術，經過大量的篩選試驗，採用簡單重複序列引物獲得了香菇菌株野生47和50的特異DNA片斷，將該片段克隆測序。
(3)特異PCR擴增引物的獲得以得到的DNA序列為基礎，設計特異PCR擴增引物，引物對的序列如下5′GTTCAAAGTCACAGATTAC3′和5′AAGAAGGAGAATGTTCAGCC3′。
(4)用特異PCR擴增引物對對野生47和50菌株進行SCAR-PCR擴增。
(5)電泳檢測可見700bp大小的特異片段(圖1)。而其它香菇菌種均未見特異性片斷。
根據採用這一對特殊引物進行PCR擴增，以能否產生700bpDNA片段作為對香菇野生47和50菌株進行鑑定和檢測的依據。
該檢測方法與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高的優點。該檢測所需時間只需要2-3天，而常規的拮抗試驗所需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要至少3個月的時間；該方法在所收集的我國164個香菇生產菌株中具有野生47和50菌株的專一性。


圖1香菇野生47和50菌株專用檢測引物對香菇菌株進行SCAR-PCR擴增結果圖中1豹皮0820；2豹皮0821；3虎皮0826；4虎皮0827；5申10；626；7野生47和50；8野生47；9野生50；109015；117402；12蘇香13武香；NC為陰性對照，箭頭所示為香菇野生47和50菌株擴增出分子量約為700bp的特殊DNA條帶。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
實施例1(1)菌絲培養和基因組DNA的提取將低溫保藏的香菇菌株野生47和50轉接到PDA斜面上，25℃培養活化。兩周後接到100mL PD液體培養基中，25℃100r/min振蕩培養兩周，收集菌絲，放入-20℃冰箱凍存。用改進的CTAB法提取基因組DNA，DNA稀釋至20ng/μL，-20℃冰箱貯藏備用。
(2)香菇菌株野生47和50的特異DNA片斷的獲得採用PCR技術，經過大量的篩選試驗，採用簡單重複序列引物獲得了香菇菌株野生47和50的特異DNA片斷，將該片段克隆測序。
(3)特異PCR擴增引物以得到的DNA序列為基礎，設計特異PCR擴增引物，引物對的序列如下5′GTTCAAAGTCACAGATTAC3′和5′AAGAAGGAGAATGTTCAGCC3′。
(4)SCAR分子標記的PCR擴增擴增體系總體積為25μL，10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L野生47和50菌株檢測專用引物對各1μL，模板DNA 1μL(濃度1ng～10ng/μL)，ddH2O18.6μL。PCR反應條件94℃ 1min；94℃ 15second，60℃ 15second，72℃ 1min，30個循環；72℃ 5min。
為了排除其它菌種的假陰性情況，在SCAR-PCR反應體系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)通用引物對(ITS1、ITS4)，驗證所有模板DNA的完整性。
(5)電泳檢測取上述PCR擴增產物8μL，與1μL加樣緩衝液混勻，點樣於1.5％的瓊醋糖凝膠上，於0.5×TBE緩衝液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結束後，用EB染色，然後在凝膠成像儀上照相。
實施例2對114(為生產用種)個收集自全國各地的香菇生產用菌種及少數野生種共164個菌株進行SCAR擴增。164個菌種中只有野生47和50菌株具有專一擴增條帶。
權利要求
1.一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記，其特徵在於特異性PCR擴增引物對序列為5′GTTCAAAGTCACAGATTAC3′和5′AAGAAGGAGAATGTTCAGCC3′；DNA片斷大小為700bp。
2.一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記的獲得方法，包括如下步驟(1)菌絲培養和基因組DNA的提取；(2)香菇菌株野生47和50的特異DNA片斷的獲得；(3)特異PCR擴增引物的獲得；(4)用特異PCR擴增引物對對野生47和50菌株進行SCAR-PCR擴增；(5)電泳檢測。
3.如權利要求2所述的一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記的獲得方法，其特徵在於所述步驟(2)中香菇菌株野生47和50的特異DNA片斷是通過採用PCR技術，經過大量的篩選試驗，採用簡單重複序列引物獲得，將該片段克隆測序。
4.如權利要求2所述的一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記的獲得方法，其特徵在於所述步驟(3)中特異PCR擴增引物通過下列方法獲得以得到的DNA序列為基礎，設計特異PCR擴增引物，引物對的序列如下5′GTTCAAAGTCACAGATTAC3′和5′AAGAAGGAGAATGTTCAGCC3′。
5.如權利要求2所述的一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記的獲得方法，其特徵在於所述步驟(1)中菌絲培養和基因組DNA的提取包括下列步驟將低溫保藏的香菇菌種轉接到PDA斜面上，25℃培養活化，兩周後接到100mL PD液體培養基中，25℃100r/min振蕩培養兩周，收集菌絲，放入-20℃冰箱凍存；用改進的CTAB法提取基因組DNA，DNA稀釋至20ng/μL，-20C冰箱貯藏備用。
6.如權利要求2所述的一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記的獲得方法，其特徵在於所述步驟(4)中的SCAR-PCR擴增擴增體系總體積為25μL，擴增體系10×PCR buffer 2.5μL，25mmol/L MgCL22μL，10mmol/L dNTP 0.25L，2.5U/μL Taq DNA酶0.5μL，10μmol/L香菇野生47和50菌株檢測專用引物對各1μL，模板DNA 1μL(濃度1ng～10ng/μL)，ddH2O 18.6μL，PCR反應條件94℃1min；94℃15second，60℃15second，72℃1min，30個循環；72℃5min。
7.如權利要求2所述的一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記的獲得方法，其特徵在於所述步驟(4)中SCAR分子標記的PCR擴增反應體系中加入ITS(InternalTranscribed Spacer)，通用引物對(ITS1、ITS4)。
8.如權利要求2所述的一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記的獲得方法，其特徵在於所述步驟(5)電泳檢測為取步驟(4)PCR擴增產物8μL，與1μL加樣緩衝液混勻，點樣於1.5％的瓊醋糖凝膠上，於0.5×TBE緩衝液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結束後，用EB染色，然後在凝膠成像儀上照相。
9.一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記在香菇野生47和50菌種的快速鑑定和檢測中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種香菇野生47和50菌種的分子特異標記及其獲得方法於應用。香菇野生47和50菌種的分子標記DNA片斷大小為400bp，特異性PCR擴增引物對序列為5′AGAGAAAAACAAGAAAAAGAAAAC3′和5′GAAGAAGGTAGTAACAGTCGC3′。方法包括步驟菌絲培養和基因組DNA的提取；香菇菌株野生47和50的特異DNA片斷的獲得；特異PCR擴增引物的獲得；SCAR－PCR擴增；電泳檢測。本發明的分子標記可應用於香菇野生47和50菌種的快速鑑定和檢測。
文檔編號C12Q1/04GK101041858SQ20071004032
公開日2007年9月26日 申請日期2007年4月29日 優先權日2007年4月29日
發明者譚琦, 陳明傑, 尚曉冬, 宋春豔, 秦蓮花, 潘迎捷 申請人:上海市農業科學院食用菌研究所