一種產α-澱粉酶的黑麴黴菌株及其應用的製作方法

2023-04-24 11:28:31

一種產α-澱粉酶的黑麴黴菌株及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種α-澱粉酶，其胺基酸序列為SEQ?ID?NO:1。本發明另一方面提供了一種表達上述α-澱粉酶的黑麴黴P11-51（Aspergillus?niger?P11-51），菌株編號為CCTCC?NO:M2014017。本發明通過紫外誘變方法獲得的突變菌株黑麴黴P11-51能夠高效表達來源於棒麴黴的α-澱粉酶，其發酵酶活高達486.45CU/mL，是出發菌株的1.99倍。所述黑麴黴P11-51是食品安全菌（GRAS），其生產的α-澱粉酶可廣泛應用於食品加工領域。所述α-澱粉酶可以使麵包的比容增加10-15%，減小麵包皮和麵包心的硬度，改善麵包質地，提高麵包的焙烤品質，還能改進麵包的體積，改良麵包的口感，使麵包等產品體積更大，顆粒更柔軟，顯著提高麵包的品質。
【專利說明】—種產Cl-澱粉酶的黑麴黴菌株及其應用【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物誘變篩選【技術領域】，具體涉及一種產α -澱粉酶的黑麴黴誘變菌株及其應用。
【背景技術】
[0002]α-澱粉酶(a-amylase)是一種內切酶,它以在澱粉分子的內部隨機切開α-1，4糖苷鍵的方式作用於澱粉從而澱粉分子迅速降解，失去粘性，同時使水解物的還原力增加。
[0003]澱粉酶是一種用途極廣的生物催化劑，α -澱粉酶是較早發現並應用於工業的重要酶製劑之一。α-澱粉酶廣泛應用於澱粉加工業，如製造葡萄糖、麥芽糖、各種糊精等；食品工業中，如麵包烘焙、飴糖、味精、果汁、香料等行業；釀造發酵工業，如啤酒、白酒、醋、醫油等；紡織工業，α-澱粉酶用於化學纖維、高質量的絲綢及人造棉的退漿工藝；製藥、醫療方面，α-澱粉酶可製成不同品種的工業酶、醫用酶、消化藥、診斷酶等。在洗滌劑工業中，澱粉酶與鹼性蛋白酶、脂肪酶等添加到洗衣粉中協同作用，使其發揮更好的洗滌效果；還有造紙工業、飼料工業等等。
[0004]已報導有多種α -澱粉酶基因在不同宿主中得到表達，其中真菌α -澱粉酶基因的異源表達主要集中在真核表達系統。與原核表達系統(如大腸桿菌表達系統或芽孢桿菌表達系統等)相比，真核表達系統在表達真核來源的異源蛋白時具有很大的優勢，如翻譯後加工修飾(如糖基化、二硫鍵的形成)、內含子的識別、信號肽的剪除和肽鏈的正確摺疊與分泌等。此外，有 多種真菌表達系統被美國FDA列為GRAS (generally recognized assafe)菌株，使得對一些食品或醫藥用異源蛋白的生產和應用更易獲得相關機構的認可和批准。
[0005]目前，已有大量來自麴黴屬(Aspergillus, sp)的α -澱粉酶被報導並用於工業生產，這些澱粉酶具有優良的酶學性質，但其生產菌株的表達量普遍較低，嚴重製約了澱粉酶的廣泛應用。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種高產α -澱粉酶的黑麴黴菌株及其應用。本發明通過將來源於棒麴黴(Aspergillus clavatus)的α -澱粉酶基因導入黑麴黴(Aspergillusniger)中，構建得到重組表達異源α -澱粉酶的黑麴黴工程菌株，並經過誘變篩選後獲得一種α -澱粉酶表達量顯著提高的黑麴黴突變株。
[0007]本發明一方面提供了一種α -澱粉酶，其胺基酸序列為SEQ ID NO:1。
[0008]編碼上述α -澱粉酶的一種編碼mRNA序列為SEQ ID NO: 2。
[0009]本發明另一方面提供了一種表達上述α -澱粉酶的黑麴黴Pll-51 (AspergillusnigerPll-51)，並已於2014年I月12日保藏於中國武漢武漢大學的中國典型培養物保藏中心，菌株編號為CCTCC N0:M2014017o
[0010]上述黑麴黴Pll-51用於生產α-澱粉酶。[0011]本發明通過紫外誘變方法獲得的突變菌株黑麴黴Pll-51能夠高效表達來源於棒麴黴的α-澱粉酶，其發酵酶活高達486.45⑶/mL，是出發菌株的1.99倍。所述黑麴黴P11-51是食品安全菌(GRAS)，其生產的α-澱粉酶可廣泛應用於食品加工領域。本發明所述α -澱粉酶可以使麵包的比容增加10-15%，減小麵包皮和麵包心的硬度，改善麵包質地，提高麵包的焙烤品質，還能改進麵包的體積，改良麵包的口感，使麵包等產品體積更大，顆粒更柔軟，顯著提高麵包的品質。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1:突變株黑麴黴Ρ11-51與出發菌株菌絲形態對比圖；
[0013]圖2:突變株黑麴黴Ρ11-51與出發菌株菌落形態對比圖；
[0014]圖3:突變株黑麴黴Ρ11-51發酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，箭頭所指處即為重組表達的α-澱粉酶。
【具體實施方式】
[0015]本發明用到了在遺傳工程和分子生物學領域中常用的常規技術和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed.(Sambrook, 2001)和 CURRENT PROTOCOLSIN MOLE⑶LAR BI OLOGY(AusubeI, 2003)等參考書中所記載的技術。但是，這並不意味著將本發明限定於實施例中所記載的具體方法、實驗方案和試劑，本領域的普通技術人員可以選用已公開的技術來實施本發明實施例中記載的方案。
[0016]除非在本文中另作限定，本文所用的全部技術術語和科學術語具有本發明所屬領域的普通計數人員通常所理解的相同含義。DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULARBIOLOGY, 3nd Ed.(Singleton et al.，2006)和 COLLINS DICTIONARY BIOLOGY(Hale etal.，2003)為技術人員提供了本發明中所使用的許多術語的一般性解釋，具體如下:
[0017]如本文所用，術語「澱粉」指植物的複雜多糖碳水化合物構成的任何物質，包括具有(C6H1005)x的直鏈澱粉和支鏈澱粉，其中X可以是任何數字。
[0018]如本文所用，術語「 α -澱粉酶」指催化1，4- α -糖苷鍵水解的酶。這些酶也被描述為在含有1，4- α -連接的D-葡萄糖單位的多糖中完成1，4- a -D-糖苷鍵的外切或內切水解的酶。另一個用於描述這些酶的術語是「糖原酶(glycogenase) 」。
[0019]如本文所用，術語「重組」當被用於指代細胞、核酸、蛋白或載體是，表示該細胞、核酸、蛋白或載體已通過導入異源核酸或蛋白或者通過改變天然核酸或蛋白而被修飾，或者所述細胞來自於如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在天然(非重組)形式的該細胞中不曾發現的基因，或者表達天然基因，但這些基因異常表達、表達不足或者完全不表達。
[0020]如本文所用，術語「蛋白質」和「多肽」在本文中可以互換使用。本文使用胺基酸殘基的傳統的單字母或三字母代碼。
[0021]如本文所用，術語「基因」指參與生產多肽的DNA片段，包括編碼區之前和之後的區域，以及各編碼片段(外顯子)之間的插入序列(內含子)。
[0022]如本文所用，術語「核酸」包括DNA、RNA,單鏈或雙鏈的，以及它們的化學修飾物。
[0023]除非另作說明，核酸是按5,至3,方向從左至右書寫；胺基酸是按氨基至羧基的方向從左至右書寫。
[0024]如本文所用，術語「核酸」和「多核苷酸」在本文中可以互換使用。
[0025]如本文所用，術語「載體」指被設計用來將核酸導入一種或多種細胞類型的多核苷酸序列。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、噬菌粒、序列盒以及類似物。
[0026]如本文所用，術語「表達載體」表示包含DNA序列的DNA構建物，所述DNA序列被可操縱的連接於能夠影響該DNA在合適宿主中表達的合適的控制序列。此類控制序列可以包括完成轉錄的啟動子、可選的控制轉錄的操縱子序列、編碼mRNA上合適的核糖體結合位點的序列、增強子以及控制轉錄和翻譯的終止的序列。
[0027]如本文所用，術語「啟動子」表示參與結合RNA聚合酶以啟動基因轉錄的的調控序列。啟動子可以是誘導型啟動子或組成型啟動子。
[0028]如本文所用，當描述蛋白或編碼它們的基因是，用於該基因的術語一般用斜體表示(例如編碼AclaPll澱粉酶的基因可以表示為AclaPll)。用於蛋白的術語一般不用斜體表示(例如，由AclaPll基因編碼的澱粉酶可以表示為AclaPll)。
[0029]與另一序列具有某一百分比的序列同一性的多核苷酸或多肽是指，當被連配時，在比較這兩個序列 時所述百分比的鹼基或胺基酸殘基是相同的。所述連配以及同源性或同一性百分比可以用本領域已知的任何合適的軟體程序確定，例如BLAST(Altschulet al.Basic local alignment search tool.Journal of MolecularBiology, 1990, 215(3):403 - 410)。由於遺傳密碼是簡併的，所以可以使用一種以上的密碼子來編碼特定胺基酸，本發明包括編碼特定的胺基酸序列的多核苷酸。
[0030]如本文所用，術語「宿主菌株」或「宿主細胞」是指表達載體或DNA構建物的合適宿主，所述表達載體或DNA構建物包含本發明的編碼α-澱粉酶的多核苷酸。具體而言，宿主菌株優選地是絲狀真菌細胞。該宿主細胞可以是野生型絲狀真菌宿主細胞或者經遺傳修飾的宿主細胞。術語「宿主菌株」或「宿主細胞」指由絲狀真菌菌株細胞所產生的細胞核原生質體。
[0031 ] 如本文所用，術語「麴黴」或「麴黴屬某種」指以前或目前被分類為麴黴屬的任何
真菌屬。
[0032]如本文所用，術語「培養」指使一群微生物細胞在適當條件下在液體或固體培養基中生長。
[0033]如本文所用，有關多核苷酸或蛋白質的術語「異源」指在宿主細胞中並非天然存在的多核苷酸或蛋白質。該術語意圖包含由天然發生的基因、突變基因和/或合成基因編碼的蛋白質。
[0034]如本文所用，有關多核苷酸或蛋白質的術語「內源」至在宿主細胞中天然存在的多核昔Ife或蛋白質。
[0035]如本文所用，有關細胞所用的術語「轉化的」、「穩定轉化的」和「轉基因的」表示該細胞含有非天然的(例如異源的)核酸序列，所述核酸序列被整合入其基因組或者作為被保持多代的附加體質粒。
[0036]在關於將核酸序列中插入細胞中的上下文中，術語「導入」表示「轉染」、「轉化」或「轉導」，包括表示將核酸序列整合入真核或原核細胞，其中該核酸序列可以被整合入該細胞的基因組(例如染色體、質粒、質體或線粒體DNA)中、轉變成自發複製子或者被瞬時表達(例如轉染的mRNA)。
[0037]如本文所用，術語「酶活力單位」指在特定條件下每給定的時間內產生給定量的產物的酶量。在一些實施方式中，術語「澱粉酶活力單位」(CU)被定義為在給定的溫度及pH條件下,在過量熱穩定性α-葡萄糖苷酶(a-glucosidase)存在的條件下，每分鐘從non-reducing-end blocked p-nitrophenylmaltoheptaoside (BPNPG7)底物中釋放 I 微摩爾對硝基苯酹(p-nitrophenol)所需的酶量。
[0038]「CGMCC」指中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，北京100101，中國，
[0039]「ATCC」指美國典型培養物保藏中心，Manassas, VA20108, USA,
[0040]「NRRL」美國北方農業研究所培養物保藏中心，Peoria, IL61604, USA,
[0041]重組表達的酶和宿主細胞:
[0042]在本發明的一些實施方式中，微生物被遺傳改造以表達異源α-澱粉酶，優選的宿主細胞是絲狀真菌細胞。
[0043]—些優選的真菌宿主細胞包括構巢麴黴(A.nidulans)、泡盛麴黴、米麴黴、棘孢麴黴(A.aculeatus)、黑麴黴、日本木黴(A.japonicus)、裡氏木黴、綠色木黴、尖孢鐮刀菌(F.0xysporum)和爺腐鐮刀菌(F.solani)。
[0044]在一些實施方式中，絲狀真菌宿主細胞是麴黴屬某種的菌株。有用的麴黴宿主菌株包括但不限於構巢麴黴(Yelton et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1984, 81:1470-1474;Mullan ey et al., Mol.Gen.Genet., 1985, 199:37-45;Johnstoneet al.EMBO J.，1985,4:1307-1311);黑麴黴(Kelly et al.,EMBO J.，1985, 4:475-479);泡盛麴黴(NRRL3112、UVK143f(USP5364770)、ATCC22342、ATCC44733 和 ATCC14331)和米麴黴(ATCC11490)。在進一步的實施方式中，絲狀真菌宿主細胞是黑麴黴菌株。
[0045]根據本發明，包含編碼α -澱粉酶(諸如AclaPll)的核酸的DNA構建物被構建以便導入宿主細胞。在一些實施方式中，通過表達載體將DNA構建物導入宿主細胞，所述表達載體包括可操縱地連接於α-澱粉酶(諸如AclaPll)編碼序列的調控序列。
[0046]在一些實施方式中，編碼α-澱粉酶(AclaPll)的核酸被可操縱的連接於合適的啟動子，該啟動子在真菌宿主細胞中表現出轉錄活性。該啟動子可以來源於編碼與宿主細胞同源或者異源的蛋白的基因。優選地，啟動子是在麴黴宿主中有用的。有用的啟動子的非限制性實例包括來源於編碼泡盛麴黴和黑麴黴葡糖澱粉酶(glaA) (Nunberg etal.,Mol.Cell Biol.，1984, 4:2306-2315;USP5364770;USP6590078;Gwynne et al., Nat.Biotechnol., 1987，5:713-719;Boel et al., EMBO J., 1984，3:1581-1585)、黑麴黴 α -澱粉酶、米麴黴TAKA澱粉酶和黑麴黴中性α-澱粉酶基因的啟動子。在進一步的實施方式中，啟動子是編碼黑麴黴葡糖澱粉酶基因的啟動子。
[0047]在一些實施方式中，α -澱粉酶(AclaPll)的編碼序列可操縱的連接於信號序列。編碼信號序列的DNA優選地與將被表達的基因天然相關。在進一步的實施方式中，與α -澱粉酶編碼序列相連接的信號序列由編碼α-澱粉酶的基因編碼(例如，AclaPll的信號序列由AclaPll基因編碼)。
[0048]在一些實施方式中，表達載體也包括終止序列。有用的終止子的非限制性實例包括編碼黑麴黴、塔賓麴黴(A.tubingensis)和泡盛麴黴葡糖澱粉酶基因的終止子(Nunberget al.,Mol.Cell Biol., 1984，4:2306-2315 和 Boel et al., EMBO J., 1984,3:1581-1585)。在進一步的實施方式中，終止序列是編碼塔賓麴黴葡糖澱粉酶基因的終止子。
[0049]在一些實施方式中，表達載體包括選擇性標記。優選的選擇性標記的實例包括但不限於賦予抗微生物劑耐性的標記(例如潮黴素、博來黴素、氯黴素和腐草黴素)。賦予代謝優勢的基因，諸如營養選擇性標記，也可用於本發明，包括本領域已知的那些標記如amdS、argB和pry4。在進一步的實施方式中，選擇性標記是構巢麴黴amdS基因，其編碼乙醯胺酶，使被轉化的細胞能夠以乙醯胺為氮源進行生長。構巢麴黴amdS基因作為選擇性標記的應用在 Kelly et al., EMBO J.，1985, 4:475-479 和 Penttila etal.，Gene, 1987，61:155-164 中被描述。
[0050]包含帶有編碼α -澱粉酶的多核苷酸的DNA構建物的表達載體可以是能夠在給定的真菌宿主生物中自我複製或整合進宿主DNA中的任何載體。在一些實施方式中，該表達載體是質粒。在進一步的實施方式中，表達載體中的啟動子是編碼黑麴黴糖化酶基因的啟動子，終止子是是編碼塔賓麴黴糖化酶基因的終止子，選擇性標記是構巢麴黴amdS基因。 [0051]用於將編碼α -澱粉酶(諸如AclaPll)的多核苷酸插入表達載體的方法是本領域熟知的。一般是通過在方便的限制性位點進行酶切和連接反應來完成的。在一些實施方式中，所用的限制性酶切位點是AflII和NotI。
[0052]宿主細胞的轉化、表達和培養:
[0053]將DNA構建物或載體導入宿主細胞包括各種技術諸如轉化、電穿孔、核微注射、轉導、轉染(例如脂轉染法介導的轉染和DEAE-Dextrin介導的轉染)、與磷酸鈣溫浴沉澱DNA、用DNA包被的微射彈進行高速轟擊和原生質體融合。一般的轉化技術是本領域已知的。對於轉化麴黴菌株，參考 Yelton et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 1984,81:1470—1474和 EP238023。
[0054]優選地，遺傳穩定的轉化子用載體系統構建，由此編碼的α-澱粉酶(諸如AclaPll)的核酸被穩定整合進宿主菌株染色體中，然後可以通過已知的技術純化轉化子。
[0055]在一種非限制性實例中，包含amdS標記的穩定轉化子通過其在含乙醯胺的固體培養基上更快的生長速度以及形成光滑的而非邊緣粗糙的圓形克隆而與非穩定轉化子相區別。此外，在一些情況下，進一步的穩定性測試可以通過使轉化子在固體的非選擇性培養基(即缺乏乙醯胺的培養基)上生長，從該培養基收穫孢子，以及確定隨後發芽並在含乙醯胺的選擇性培養基上生長的這些孢子的百分比來進行。可選的，本領域已知的其他方法可以被用於選擇轉化子。
[0056]在一些實施方式中，用於轉化的麴黴屬某種的製備包括來自真菌菌絲體的原生質體的製備(參見Campbell et al., Curr.Genet., 16:53-56)。菌絲體是從萌發的營養孢子獲得的。將菌絲體用消化細胞壁的酶處理，產生原生質體。然後通過懸浮培養基中存在的滲透壓穩定劑對原生質體加以保護。這些穩定劑包括山梨醇、甘露醇、氯化鉀、硫酸鎂和類似物。通常這些穩定劑的濃度在0.8~1.2M之間變化。
[0057]宿主菌株對DNA的攝入可以由鈣離子濃度決定。一般而言，10~IOmM的CaC12可以被用在社區攝取溶液中。在攝取溶液中除了對鈣離子的需求，一般被包括的其他化合物是緩衝體系諸如TE緩衝液(IOmMTris (ρΗ7.4)和ImMEDTA)或IOmM MOPS (ρΗ6.0)緩衝液和聚乙二醇(PEG)。
[0058]通常在轉化中使用含有宿主細胞或原生質體諸如麴黴屬某種的原生質體或細胞的懸浮液，所述原生質體或細胞已經以約IO7個/mL的密度經過滲透性處理。在一些實施方式中，將大約100 μ L體積的這些原生質體或細胞的適當溶液(例如1.2Μ山梨醇和50mMCaCl2)與期望的DNA混合。在一些實施方式中，將高濃度的PEG加入攝取溶液中。可以向原生質體懸浮液中加入0.1~I體積的25%PEG4000。然而,優選地向原生質體懸浮液中加入大約0.25體積。添加劑諸如二甲亞碸、肝素、亞精胺、氯化鉀和類似物也可以被加入到攝取溶液中並幫助轉化。類似的方法可以用於其他真菌宿主細胞(參考USP6022725和6268328)。
[0059]一般的，然後將混合物在大約(TC溫浴10~30min。向混合物中加入額外的PEG以進一步加強對所需基因或DNA序列的攝取。在一些實施方式中，加入轉化混合物的5至15倍體積的25%PEG4000。但是，更多或更少的體積都可能是合適的。25%PEG4000優選地是轉化混合物體積的大約10倍。加入PEG後，可以將轉化混合物在室溫溫浴或者在冰上冰浴，然後加入山梨醇和CaCl2溶液。然後將原生質體懸浮液進一步加入到熔化的小量等份生長培養基中。當生長培養基包括生長選擇條件(例如乙醯胺或抗生素)是，其僅允許轉化子生長。
[0060]—般而言，細胞被培養在含生理鹽和營養劑的標準培養基中(SMPourquieetal.，BIOCHEMISTRY AND GENETICS OF CELLULOSE DEGRADATION, Academic Press, 1988，71-86和 Ilmen et al., App1.Environ.Microbiol., 1997, 63:1298-1306)。普通的商業配置培養基(例如 Yeast Malt Extract (YM)肉湯、Luria Bertani (LB)肉湯和 Sabouraud Dextrose (SD)肉湯)也可以用於本發明。
[0061]培養條件也是標準的(例如將培養物在搖床培養器中，在合適的培養基中大約30°C下溫浴直至達到所需的α-澱粉酶(諸如AclaPll)表達水平)。給定的絲狀真菌的培養條件是本領域已知的並且可以在科學文獻中和/或從該真菌的來源諸如美國典型培養物保藏中心(ATCC)和真菌遺傳學保存中心(FGSC)找到。
[0062]酶表達的分析和酶活力的測定:
[0063]為了評價α -澱粉酶(諸如AclaPll)的表達，可以在蛋白水平或核酸水平進行分析。可以應用的分析方法包括Northern印跡、斑點印跡(DNA或RNA分析)、Southern印跡、放射自顯影、RT-PCR(反轉錄酶聚合酶鏈式反應)和含有適當標記的探針(基於核酸編碼序列)進行的原位雜交。此外，基因表達可以通過免疫學方法，諸如細胞、組織切片的免疫組織化學染色或者組織培養基的免疫試驗。例如通過Western印跡或ELISA來評估。這樣的免疫試驗可以用於定性地和定量地評價α-澱粉酶(諸如AclaPll)的表達。此類方法的細節是本領域技術人員已知的，並且用於實施此類方法的許多試劑是可商業獲得的。在一些實施方式中，α-澱粉酶(諸如AclaPll)的表達的通過SDS-PAGE進行分析。
[0064]α -澱粉酶(AclaPll)的活力可以通過 Miller, Anal.Chem.，1959，31:426-428 中所述的DNS法來測量。酶活力也可以通過測定單位時間液化可溶性澱粉的能力來進行測定(參考GB8275-2009和GB/T24401-2009)。在一些實施方式中，α -澱粉酶的活力通過使用α-澱粉酶活力測定試劑盒(Megazyme)進行測定。
[0065]下面結合具體實施例對本發明的α -澱粉酶和誘變菌株進行描述。
[0066]在以下的公開內容和實驗部分中，應用下列縮略語:
[0067]AclaPlK具有SEQ ID NO:1所述的胺基酸序列的α -澱粉酶)、°C (攝氏度)、rpm(每分鐘的轉速)、dlH20(去離子水，Mill1-Q過濾)、kD(千道爾頓)、g (克)、mg (毫克)、yg(微克)、cm(釐米)、μπι(微米)、L(升)、mL(毫升)、yL(微升)、M(摩爾濃度)、mM(毫摩爾濃度)、CU(酶活單位)、min(分鐘)、h(小時)、d(天)、Tris (三輕甲基氨基甲烷)，SDS (十二烷基硫酸鈉)、PAGE (聚丙烯醯胺凝膠電泳)、MOPS (嗎啉丙磺酸)。
[0068]實施例1: α -澱粉酶基因AclaPll的克隆
[0069]按照製造商的說明書，使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從棒麴黴CGMCC3.5289過夜培養物中提取基因組DNA。
[0070]根據NCBI上的編號為XM_001271888的α -澱粉酶基因序列設計PCR引物，用於克隆棒麴黴中的AclaPll基因的正向引物AclaPll-F序列如下:
[0071]5， -ACGGCCTTAAGAAGATGCCTCGGATTTGGTCCTC
[0072](下劃線所示序列為AflII酶切位點)，
[0073]反向引物AclaPll-R序列為:
[0074]5』 -ATTGCGGCCGCAGCTCAAGCACAGATCTTGCTTC
[0075](下劃線所示序列為NotI酶切位點)。
[0076]將該基因用Phusion DNA聚合酶(Thermo scientific)從棒麴黴基因組DNA中擴增出來。 [0077]擴增條件:
[0078]第一步:98°C保持3min。
[0079]第二步:98°C保持10s，然後72°C保持75s，此步驟重複30次。
[0080]第三步:72O保持IOmin。
[0081]使用凝膠純化試劑盒將上述PCR產物純化，用限制性內切酶AflII和NotI (Fermentas)對純化了的PCR產物進行酶切；同時，用限制性內切酶AfIII和NotI對質粒PGm (遺傳圖譜見圖1)進行酶切。使用凝膠純化試劑盒將酶切產物純化，並用T4DNA連接酶(Fermentas)將上述兩個酶切產物連接。將連接產物轉化進Trans5 α大腸桿菌(Transgen),用氨節青黴素進行選擇。為確保準確,對若干克隆進行測序(Invitrogen)。
[0082]按照製造商的說明書，使用質粒中量製備試劑盒(Axygen)從測序結果正確的大腸桿菌克隆中純化質粒。將所得質粒命名為pGm-AclaPll，測序結果顯示上述本發明PCR擴增得到的α -澱粉酶的編碼核苷酸序列為SEQ ID Ν0:2，其翻譯的胺基酸(蛋白)序列為SEQID NO:1。
[0083]實施例2 =PEG介導的原生質體融合轉化黑麴黴
[0084]吸取黑麴黴Gl孢子懸浮液於CMA平板中心(9cm培養皿)，待菌落長滿整個培養皿，切1/4大小的培養基於200mL CMA液體培養基中，在30°C、200rpm的條件培養14~16h。
[0085]用無菌Miracloth濾布收集菌絲體,並用溶液A清洗一次,在無菌條件下將清洗過的菌絲體轉移到40mL原生質體化溶液，在30°C、200rpm的條件下溫浴I~2h，用顯微鏡觀察檢測原生質體化進展。
[0086]用無菌Miracloth濾布過濾上述溫浴液體，所得濾液即為原生質體溶液。將原生質體溶液分裝於兩個50mL無菌的一次性離心管中，並將每管的體積用溶液B定容至45mL,在4000rpm條件下離心8min以獲得沉澱並棄去上清液。用20mL溶液B再清洗沉澱兩次。將沉澱重懸浮於IOmL溶液B中，並用血球計數板對原生質體計數。將原生質體再次離心並棄去上清液，根據血球計數板計數結果，加入適量溶液B重懸沉澱，使得原生質體數目在I X IO7 個/mL。
[0087]在冰上，將100 μ L上述原生質體溶液加入預冷的無菌15mL離心管中，每個轉化反應用I管。加入10 μ g質粒。加入12.5 μ L溶液C,溫和混勻後再冰上放置20min。
[0088]將麗SA頂層瓊脂試管熔化並保持在55°C。從冰中移出上述15mL離心管，並向管中加入ImL溶液C和2mL溶液B，溫和混勻各管，所得混合物即為原生質體混合物。向3個頂層瓊脂試管中的每一個中加入ImL上述原生質體混合物，並立即傾倒與MMSA平板上，並將平板在30°C下培養7~10d。
[0089]溶液A:2.5mLlM K2HPO4, 2.5mLlM KH2PO4,48.156g MgSO4,加 Λ dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0090]溶液B:5mLlMTris(pH7.5)，2.77g CaCl2,109.32g 山梨醇，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0091]溶液C:250g PEG4000, 2.77g CaCl2, 5mLlMTris (ρΗ7.5)，加入 dlH20 至終體積500mL,用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0092]原生質體化溶液:將0.6g 裂解酶(Lysing Enzyme from Trichoderma harzianum,Sigma)溶解於40mL溶液A中，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0093]MMSA 平板:0.59 g 乙醯胺(Sigma) ,3.4gCsCl (Sigma)，0.52gKCl, 1.52g KH2P04,218.5g山梨醇，ImL痕量元素(見下)，20g瓊脂，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌後加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04。
[0094]MMSA 頂層瓊脂試管:0.59g 乙醯胺(Sigma), 3.4gCsCl (Sigma), 0.52gKCl, 1.52gKH2PO4, 218.5g山梨醇，Iml痕量元素(見下)，IOg低熔點瓊脂糖，加入dlH20至終體積972.5mL,高壓蒸汽滅菌後，在培養基未凝固時，加入用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌的25mL40%葡萄糖和2.5mL20%MgS04,之後立即分裝於無菌試管中，每管10mL。
[0095]痕量元素:在250mL dlH20 中加入 Ig FeSO4.7Η20，8.8g ZnSO4.7Η20，0.4gCuSO4.5Η20，0.15g MnSO4.4Η20，0.Ig Na2B4O7.IOH2O, 50mg (NH4) 6Μο7024.4Η20，0.2mL 濃 HC1，完全溶解後用dlH20定容至1L，用0.22 μ m的微孔濾膜過濾除菌。
[0096]CMA平板:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白腖，15g瓊脂，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0097]CMA液體培養基:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白腖，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0098]待平板上長出菌落後，挑選25個菌落，按照製造商的說明書，使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從其過夜培養物中提取基因組DNA。按實施例1中所述實驗步驟進行PCR驗證，對所得PCR產物進行測序。將所得陽性克隆和黑麴黴Gl (對照組)的孢子懸浮液分別接種於25mL TSB發酵培養基中，在30°C，200rpm的條件下培養3d，所得發酵液用8層紗布過濾，濾液在14000 Xg條件下離心10min，收集上清液；將上清液在濃度為8%的SDS-PAGE膠上進行電泳檢測；對在55kD處(本發明所述α -澱粉酶的理論分子量大小為55kD)有明顯蛋白條帶的陽性克隆，利用α-澱粉酶活力測定試劑盒(Megazyme)測定其上清液中澱粉酶的活力，選取酶活力最高的陽性克隆，命名為黑麴黴AclaPll，其酶活約為244.87⑶/mL，而作為對照組，宿主細胞黑麴黴Gl發酵上清液的酶活僅為46⑶/mL，說明本發明構建的工程菌株黑麴黴AclaPll能高效異源表達棒麴黴的α-澱粉酶。
[0099]實施例3出發菌株黑麴黴AclaPll的紫外誘變與篩選
[0100]CMA平板:20g葡萄糖，20g麥芽浸出物，Ig蛋白腖，15g瓊脂，加入dlH20至終體積1000mL,高壓蒸氣滅菌。
[0101]以黑麴黴AclaPll作為出發菌株進行紫外誘變與篩選。
[0102]紫外誘變方法:
[0103]1、孢子懸液的製備:將黑麴黴AclaPll接種至斜面CMA培養基，30°C培養5d。加IOmL的無菌生理鹽水，將孢子洗下，通過帶脫脂棉的漏鬥過濾，置於裝有玻璃珠的滅菌三角瓶中，震蕩均勻，製成單孢子懸液，在光學顯微鏡下用血球計數儀計數後用無菌生理鹽水將孢子懸液稀釋到IO6個/mL，即為待誘變處理的孢子懸液；
[0104]2、預熱紫外燈30min ;將IOmL孢子懸液倒入無菌平皿(直徑9cm)中，並將平皿置於距離44w紫外燈18cm的紫外誘變箱中；
[0105]3、紫外燈預熱後，開始紫外誘變，打開皿蓋，計時；在Omin, 5min, IOmin, 20min,30min分別吸取100 μ L孢子懸液，做系列梯度稀釋；
[0106]4、誘變結束後，關閉紫光燈，利用紅光燈源而非白光燈以避免光修復；將上述各點取出的孢子懸液做梯度稀釋；每個稀釋度取出100 μ L塗布篩選平板，在30°C培養箱中避光培養，每個樣品做三個平行；
[0107]5、紫外誘變結果觀察:
[0108]培養36小時後，觀察菌落形態，並進行菌落計數，計算紫外誘變致死率。計算公式如下:
[0109]
【權利要求】
1.一種α-澱粉酶，其特徵在於，所述α-澱粉酶的胺基酸序列為SEQIDN0:1。
2.一種編碼權利要求1所述的α-澱粉酶的基因，其特徵在於，所述的基因的核苷酸序列為 SEQ ID NO:2。
3.—種重組表達載體，其特徵在於，所述的重組表達載體攜帶有權利要求2所述的基因。
4.一種工程菌，其特徵在於，所述的工程菌為攜帶有權利要求3所述的重組表達載體的菌株。
5.如權利要求4所述的工程菌，為黑麴黴Pll-51(Aspergillus niger Ρ11-51)，菌株編號為 CCTCC N0:M2014017o
【文檔編號】C12N15/80GK104004729SQ201410032677
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】王華明, 林豔梅 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司