共表達攝取轉運體和藥物代謝酶模型的構建及應用的製作方法
2023-04-24 15:41:36 2
共表達攝取轉運體和藥物代謝酶模型的構建及應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供一種共表達攝取轉運體和藥物代謝酶模型的構建，以人基因OAT1cDNA為模板，擴增獲得人OAT1基因片段，連接到載體pcDNA3.1(+)，獲得質粒pcDNA3.1(+)/OAT1，轉染MDCK細胞，經篩選得到高表達OAT1的MDCK-hOAT1細胞；然後將人CYP1A2基因片度連接到載體pcDNA3.1/Hygro(+)，獲得質粒pcDNA3.1/Hygro(+)/CYP1A2，轉染MDCK-hOAT1細胞，經潮黴素B篩選，得到共表達OAT1和CYP1A2細胞，再對細胞進行mRNA驗證並通過經典底物及抑制劑進行功能驗證。本發明的細胞模型可在基於OAT1和CYP1A2的藥物毒性作用在細胞水平上篩選中的應用，可預測這兩種蛋白對藥物處置過程中的協同作用，為臨床合理用藥提供依據。本發明設計合理，重複性強。
【專利說明】共表達攝取轉運體和藥物代謝酶模型的構建及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬生物【技術領域】，涉及一種共表達攝取轉運體OATl和藥物代謝酶CYP1A2細胞模型的構建及應用。
技術背景
[0002]藥物進入體內之後往往會經過吸收、分布、代謝、排洩等過程。藥物自體外或給藥部位經過細胞組成的屏蔽膜進入血液循環，通過門靜脈進入肝臟，受到肝臟內藥物代謝酶的影響，藥物原型或代謝物經過血液循環迅速分布在各組織。腎臟作為人體的重要排洩器官，在藥物的處置中發揮重要作用。藥物經腎臟的排洩過程包括腎小球濾過、腎小管分泌和重吸收三個過程，其中，轉運體會參與腎小管分泌和重吸收過程。腎臟轉運體在維持體內穩態中發揮重要作用，是外源物、代謝廢物等體內清除的重要途徑，是影響食物/藥物-藥物相互作用的重要因素，影響腎臟疾病的產生等等。人有機陰離子轉運體I (hOATl)，是溶質轉運體超家族(superfamily of Solute carriers, SLC)的成員，主要在近端腎小管上皮細胞基底側表達，負責將藥物或其代謝物從血液攝取到腎小管細胞。OATl底物譜比較廣泛，內源性底物包括環核苷酸、葉酸、前列腺素等，外源性底物包括多種抗病毒藥物(阿昔洛韋、西多福韋)、抗生素(青黴素、先鋒黴素II)、多種利尿劑(布美他尼、利尿磺胺)以及非留體類抗炎藥、甲氨蝶呤、赫麴黴素A等。
[0003]作為腎臟中主要的陰離子轉運體，OATl在藥物的代謝動力學、藥物-藥物相互作用以及藥物的毒理學中發揮著重要作用。研究表明，同時服用青黴素G和OAT的抑制劑丙磺舒可明顯延長前者的半衰期，敲除Oatl的小鼠分泌其經典底物對氨基馬尿酸的能力顯著降低；0AT1還可介導利尿劑、核酸類似物、抗病毒藥物的藥物-藥物相互作用；0ΑΤ可介導內醯胺類抗生素和抗病毒藥物的腎毒性，而服用OAT的抑制劑丙磺舒可降低西多福韋的潛在毒性，在過表達OAT的細胞系中，西多福韋的細胞毒性有較大升高。OATl可以介導多種中藥成分在腎臟的轉運，如黃酮類化合物、酚酸類化合物等。
`[0004]CYP1A2基因定位於人類第15號染色體上，包括7個外顯子和6個內含子。CYP1A2是CYPlA家族中重要的藥物代謝酶，佔整個細胞色素Ρ450的13%-15%，主要分布在肝臟中，另外在腸道，腦，肺中也有少量CYP1A2分布。CYP1A2參與多種藥物在體內的生物轉化以及一些環境毒素的代謝和致癌物質的激活過程。目前已知CYPlA參與咖啡因、華法林、茶鹼、普萘洛爾、美西律、維拉帕爾、硝苯地平、他克林等幾十種藥物的代謝過程。
[0005]目前關於藥物轉運體和代謝酶的協同作用還缺乏全面的了解，可用於該方向研究的體外模型較少。
【發明內容】
[0006]本發明的一個目的是提供一種共表達攝取轉運體和藥物代謝酶模型的構建方法，涉及的是共表達人OATl和CYP1A2細胞模型的構建方法，通過以下步驟實現:
(I)先以人基因例/7 cDNA為模板，通過設計含及^7? I和I雙酶切位點的特定引物SEQ ID No:3和SEQ ID No:4，擴增得到人OATl基因片段NM_004790，其核苷酸序列如SEQ ID如:1所示，經過雙酶切的？0?產物和載體？00嫩3.1(+)片段，通過T4連接酶連接，構建質粒pcDNA3.1 (+) /OATl，轉化大腸桿菌進行質粒擴增，測序；測序正確後，轉染MDCK細胞(ATCC)，經過氨基糖苷類抗生素G418篩選出單克隆細胞，得到穩定高表達OATl的MDCK細胞。(2)然後先從冰凍人肝組織中提取總RNA，經逆轉錄獲得人的cDNA文庫，以該cDNA為模板，通過設計含有及麗7 I和I兩個酶切位點的特定引物SEQ ID No:5和SEQ ID如:6，擴增得到人0￥卩認2基因片段匪_000761，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示。(3)經過雙酶切的PCR產物和帶有潮黴素B篩選標記的載體pcDNA3.1/Hygro (+)片段，通過T4連接酶連接，構建質粒pcDNA3.1/Hygro (+)/CYPlA2,轉化大腸桿菌進行質粒擴增,測序。(4)測序正確後，轉染MDCK-hOATl細胞，經過潮黴素B篩選，得到共表達OATl和CYP1A2細胞，進行mRNA驗證並通過經典底物對氨基馬尿酸及抑制劑丙磺舒進行OATl的功能驗證以及通過經典底物非那西丁進行CYP1A2的功能驗證。
[0007]本發明的另一個目的是提供所述共表達OATl和CYP1A2的細胞模型在OATl和CYP1A2底物或抑制劑初步篩選中的應用，或者考察兩者在介導藥物的細胞毒性中的作用。
[0008]通過以下步驟實現:加入50umol/L待測藥物，孵育48h，置於倒置螢光顯微鏡下觀察細胞形態和數目變化，將細胞用PBS緩衝液洗兩次，加入甲醇固定15min。加入0.5 μ mol/L DAPI染色液室溫避光作用15min。將染色後的細胞置於倒置螢光顯微鏡下觀察細胞核的形態和數量變化，加入0.5mg/mL MTT繼續孵育4h，加入200 μ L DMSO孵育lOmin，於酶標儀570nm處讀取吸光度值。吸光度值越小，細胞成活量越低，表明待測藥物毒性越大。
[0009]本發明提供一種共表達細胞模型，具有穩定高表達人OATl和CYP1A2兩種蛋白的優勢，可以作為基於OATl和CYP1A2的藥物毒性作用在細胞水平上的毒性篩選模型，以及研究OATl和CYP1A2在藥物處置中的協同作用。
[0010]本發明的積極效 果是:
(I)而本發明構建的MDCK-hOATl/CYPIA2細胞共轉染轉運蛋白與代謝酶，可以在體外同時研究兩者在藥物處置中的作用。本發明建立的細胞模型可以作為OATl和CYP1A2的底物的篩選模型，預測藥物在體內的轉運和代謝情況。
[0011](2)越來越多的報導中藥具有腎毒性，因此,中藥腎毒性的快速有效篩選已成為中藥研究開發和臨床應用的障礙。中藥腎毒性早期快速，有效地篩選尤為重要。本發明提供的細胞模型可以預測中藥成分的毒性情況。
[0012](3)目前臨床上多採用聯合用藥方式治療，合用不同藥物可能會引起不良反應，本發明提供的細胞模型可以用來研究基於hOATl和CYP1A2的藥物-藥物相互作用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013]圖1A質粒pcDNA3.1(+)/0ΑΤ1經及I和觔e I雙酶切鑑定電泳圖。條帶Marker為 Marker DL15000,條帶 1,2 分別為質粒 pcDNA3.1 (+)，pcDNA3.1 (+) /OATl 備EcoR I 和Nhe I雙酶切電泳圖。
[0014]圖1B 質粒 pcDNA3.1/Hygro (+) /CYPIA2 HBamH I 和船e I 雙酶切鑑定電泳圖。條帶 Marker 為 Marker III,條帶 I, 2 分別為質粒 pcDNA3.1/Hygro (+),pcDNA3.1/Hygro (+)/CYPIA2經Nhe I和BatnH I雙酶切電泳圖。[0015]圖2 OATl在MDCK-0AT1細胞中的轉錄水平。圖中數據以mean±SD表示，n=3。Mock為轉染空載體細胞，D3和F8分別為轉染OATl的單克隆細胞。
[0016]圖3在有或無抑制劑丙磺舒(lmmol/L)作用下，6-CFL (4Mmol/L)在MDCK-0AT1細胞中的積聚。圖中數據以mean±SD表示，n=4。Mock為轉染空載體細胞，D3和F8分別為轉染OATl的單克隆細胞。
[0017]圖4在有或無抑制劑丙磺舒(lmmol/L)作用下，對氨基馬尿酸(5Mmol/L)在MDCK-0AT1細胞中的積聚。圖中數據以mean±SD表示，n=3。Mock為轉染空載體細胞，D3和F8分別為轉染OATl的單克隆細胞。
[0018]圖5是不同中藥成分對MDCK-0AT1細胞積聚6-CFL的抑制作用。
[0019]圖6是CYP1A2在Mock和MDCK- CYP1A2兩種細胞中的轉錄水平。圖中數據以mean±SD表示，n=4。Mock為轉染空載體細胞，2和6分別為轉染CYP1A2的單克隆細胞。
[0020]圖7是在有或無抑制劑α-萘黃酮(lMmol/L)作用下，螢光底物Luciferin-1A2(6Mmol/L)在Mock和MDCK-CYP1A2兩種細胞中的代謝。圖中數據以mean±SD表示，n=4。Mock為轉染空載體細胞，2和6均為轉染CYP1A2的單克隆細胞。
[0021]圖8是非那西丁(50 μ mol/L)在Mock和MDCK- hOATl/ CYP1A2兩種細胞中的代謝。圖中數據以mean±SD表示，n=4。Mock為轉染空載體細胞，MDCK-0AT1/CYP1A2為共表達OATl和CYP1A2的單克隆細胞。
[0022]圖9是通過MTT實驗檢測不同馬兜鈴酸濃度對Mock、MDCK-0ATl和MDCK- hOATl/CYP1A2細胞的毒性。圖 中數據以mean±SD表示，n=5。25，50分別為馬兜鈴酸I (AAI)的濃度，單位為μ mol/L。
[0023]圖10對照組(0.5%DMS0)和實驗組(50 μ mol/L馬兜鈴酸和0.5%DMS0)對Mock、MDCK-OATI和MDCK- hOATl/ CYP1A2細胞作用48h後細胞數目和形態的變化。馬兜鈴酸母液由DMSO配製，稀釋到50 μ mol/L濃度時DMSO含量為0.5%。
[0024]圖11是對照組(0.5%DMS0)和實驗組(50 μ mol/L馬兜鈴酸和0.5%DMS0)處理過的Mock、MDCK_0ATl和MDCK- hOATl/ CYP1A2細胞經DAPI染色後細胞核數目和形態的變化。
【具體實施方式】
[0025]本發明結合附圖和實施例作進一步的說明。
[0026]實施例1
重組質粒 pcDNA3.1 (+) /OATl 及 pcDNA3.1/Hygro (+) /CYP1A2 的構建
1.1重組質粒pcDNA3.1 (+) /OATl的構建
(I)根據人OATl的DNA序列設計兩條PCR引物。上下遊引物分別設計一個酶切位點，EcoR I和觔e I (下劃線標出)
上遊引物:5』 - CTAGCTAGCGACATGGCCTTTAATGACCTCCTGCAG -3』 ；
下遊引物:5』 - CAGGAATTCTCAGAGTCCATTCTTCTCTTGTGCTGA -3』。
[0027](2)以pCMV6-0ATl質粒為模版進行PCR，反應體系和反應條件見表1。
【權利要求】
1.一種共表達攝取轉運體和藥物代謝酶細胞模型的構建方法，其特徵在於，通過以下步驟實現: (1)以人基因OATlCDNA為模板，通過設計含EcoR I和Nhel雙酶切位點的特定引物SEQ ID No:3和SEQ ID No:4，擴增得到人OATl基因片段NM_004790，其核苷酸序列如SEQID No:1所示，經過雙酶切的PCR產物和載體pcDNA3.1 (+)片段，通過T4連接酶連接，構建質粒pcDNA3.1 (+) /OATl，轉化大腸桿菌進行質粒擴增，測序；測序正確後，轉染MDCK細胞，經過氨基糖苷類抗生素G418篩選出單克隆細胞，得到穩定高表達OATl的MDCK細胞； (2)然後從冰凍人肝組織中提取總RNA，經逆轉錄獲得人的cDNA文庫，以該cDNA為模板，通過設計含有及麗7 I和I兩個酶切位點的特定引物SEQ ID No:5和SEQ ID No:6,擴增得到人CYP1A2基因片段NM_000761，其核苷酸序列如SEQ ID No:2所示； (3)經過雙酶切的PCR產物和帶有潮黴素B篩選標記的載體pcDNA3.1/Hygro (+)片段，通過T4連接酶連接,構建質粒pcDNA3.1/Hygro (+) /CYP1A2,轉化大腸桿菌進行質粒擴增，測序； (4)測序正確後，轉染MDCK-hOATl細胞，經過潮黴素B篩選，得到共表達OATl和CYP1A2細胞，進行mRNA驗證並通過經典底物對氨基馬尿酸及抑制劑丙磺舒進行OATl的功能驗證以及通過經典底物非那西丁進行CYP1A2的功能驗證。
2.根據權利要求1所述的一種共表達攝取轉運體和藥物代謝酶細胞模型的構建方法在OATl和CYP1A2底物或抑制劑初步篩選中的應用。
3.根據權利要求1所述的一種共表達攝取轉運體和藥物代謝酶細胞模型的構建方法在考察OATl和CYP1A2底物或抑制劑在介導藥物的細胞毒性中的作用。
4.根據權利要求2或3 所述的應用，其特徵在於，通過以下步驟實現:加入一定濃度的待測藥物，孵育一定時間，置於倒置螢光顯微鏡下觀察細胞形態和數目變化，將細胞用PBS緩衝液洗兩次，加入甲醇固定15min，加入0.5μπι01/1 DAPI染色液室溫避光作用15min，將染色後的細胞置於倒置螢光顯微鏡下觀察細胞核的形態和數量變化，加入0.5mg/mL MTT繼續孵育4h，加入200 μ L DMSO孵育lOmin，於酶標儀570nm處讀取吸光度值，吸光度值越小，細胞成活量越低，表明待測 藥物毒性越大。
【文檔編號】C12N5/10GK103881977SQ201410066266
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年2月26日 優先權日:2014年2月26日
【發明者】曾蘇, 趙壘, 胡海紅, 餘露山, 蔣惠娣, 周惠, 徐思雲 申請人:浙江大學