細胞培養生物成套生產裝置製造方法

2023-04-24 15:39:11 1

細胞培養生物成套生產裝置製造方法
【專利摘要】本實用新型涉及細胞培養生物成套生產裝置，主要解決的是採用現有技術中的細胞培養生物反應裝置進行細胞培養時，生物反應器中可達到的最大細胞密度低的問題，技術方案是：細胞培養生物成套生產裝置，包括細胞培養生物反應器、培養液增氧塔；所述增氧塔內部具有如下布置：上部空間設置液體分布器、下部設置有與增氧氣體入口相連通的增氧塔氣體分布器，液體分布器和增氧塔氣體分布器之間設置填料層；所述增氧塔頂部具有增氧塔尾氣排放口；所述成套生產裝置具有從所述反應器內取出液體物料並輸送至所述增氧塔頂部並與液體分布器相通的增氧塔進料通道I；所述成套生產裝置具有從所述增氧塔底部取出液體物料並輸回所述反應器的液體物料回輸通道II。
【專利說明】細胞培養生物成套生產裝置

【技術領域】
[0001] 本實用新型涉及細胞培養生物成套生產裝置。

【背景技術】
[0002] 動物細胞培養，是細胞源人用疫苗和細胞源動物用疫苗、抗體藥物以及部分重組 蛋白藥物的基礎。單位體積培養增殖的細胞數量，是上述產物產量基礎。盡力提高動物細 胞培養密度，為進一步的產品增產提供更有利條件，始終是上述產物產業化、工程化關注的 焦點。
[0003] 動物細胞培養，更多的是貼壁依賴細胞的培養，即細胞必須附著在一個適宜的表 面上生長、代謝和增殖。
[0004] 為給細胞提供生長的附著面，最初是將細胞和培養液置於方瓶中，方瓶平放，一個 較大的側面在下，細胞就在這個側面上生長。瓶子本身就小，利用量就很有限；瓶子6個面 只有一個面被利用，顯然利用率很低。
[0005] 後來，將細胞和培養液置於圓柱形瓶子（轉瓶）中，轉瓶橫放，下部部分瓶壁浸於 培養液中。轉瓶緩慢旋轉，貼附於瓶內壁的細胞周期性浸潤到培養液中，離開培養液後，在 轉瓶上部仍由培養液液膜提供營養。所以轉瓶的瓶身內壁都成為細胞生長面。單位容積所 提供的細胞生長面比用方瓶增加了 一個數量級。
[0006] 轉瓶培養的缺點是佔地面積大、勞動強度高。
[0007] 1980年代發展出細胞培養生物反應器，即細胞培養罐。生物反應器內裝培養液中， 加入若干微載體，微載體表面即是細胞生長面。微載體以美國GE的Cytodex系列及美國 NBS的DISK為兩種典型微載體代表。Cytodex系列葡聚糖球形微載體，DISK為小塑料片支 撐的紙質微載體。Cytodex系列提供的比表面積更大，可以達到6000 (cm) 2/g。1克Cytodex I微載體約相當於2個IOL的轉瓶提供的生長面。球形微載體更容易實現放大生產。除了 Cytodex外，球形微載體還有明膠微載體、瓊脂糖微載體、殼聚糖微載體等，主要是選用生物 相容性更好的原材料來製造微載體。
[0008] 動物細胞，基本上都是好氧生長代謝，而且只能利用溶解於培養液的溶解氧。氧在 培養液中的飽和溶解度很低，37°c，常壓下只有約3?5mg/L培養液。所以溶解氧是細胞生 長代謝的限制因素，供氧能力是細胞培養生物反應器的限制因素。
[0009] 現有技術中，採用的反應裝置如圖1所示的通氣攪拌式細胞培養生物反應器、圖2 所示的湍動床式細胞培養生物反應器、圖3所示的氣升式細胞培養生物反應器。現有細胞 培養生物反應器用於細胞培養時，可達到的最大細胞密度尚低。 實用新型內容
[0010] 本實用新型所要解決的技術問題是採用現有技術中的細胞培養生物反應裝置進 行細胞培養時，生物反應器中可達到的最大細胞密度低的問題。提供一種新的細胞培養生 物成套生產裝置，其具有生物反應器中可達到的最大細胞密度高的優點。
[0011] 為解決上述技術問題，本實用新型的技術方案如下：細胞培養生物成套生產裝置， 包括細胞培養生物反應器、培養液增氧塔13 ;
[0012] 所述反應器具有反應器進料口 1、反應器取樣口 2、反應器接種口 4、反應器排氣口 6、pH檢測裝置和溶解氧檢測裝置；
[0013] 所述增氧塔13內部具有如下布置：上部空間設置液體分布器14、下部設置有與增 氧氣體入口相連通的增氧塔氣體分布器16,液體分布器14和增氧塔氣體分布器16之間設 置填料層15 ;所述增氧塔頂部具有增氧塔尾氣排放口 12 ;
[0014] 所述成套生產裝置具有從所述反應器內取出液體物料並輸送至所述增氧塔頂部 與液體分布器14相通的增氧塔進料通道I ;
[0015] 所述成套生產裝置具有從所述增氧塔底部取出液體物料並輸回所述反應器的液 體物料回輸通道II。
[0016] 所述增氧氣是指可以提供需氧細胞培養所需氧氣的任何氣體，例如純氧、空氣、氮 氣氧氣混合物、氧氣二氧化碳混合物，氧氣氮氣二氧化碳混合物等等。優先使用空氣與二氧 化碳混合氣體。
[0017] 通道I和通道II採用的輸送動力的來源和種類沒有特別要求，在本實用新型說明 書記載的基礎上本領域技術人員能夠合理選擇。例如通道I和通道II之一可以採用反應 器和增氧塔的位置高低使得其中一個通道通過液位差提供輸送動力，而另一個通道的輸送 動力需要藉助於輸送泵或壓力罐或真空泵。例如通過調高增氧塔的高度或者調低反應器的 高度的方法可以實現通道II的輸送動力來自液位差，而通道I藉助輸送泵；或者通過調低 增氧塔的高度或者調高反應器的高度的方法可以實現通道I的輸送動力來自液位差，而通 道II藉助輸送泵。還可以通道I和通道II均採用輸送泵等提供輸送動力。本實用新型裝 置的放料口沒有特別限制，可以設置在反應器（例如反應器的放料口 5)，也可以設置在通 道I，當通道I設置輸送泵時可將放料口設置在鄰近輸送泵的出口端（例如圖4?9所示裝 置的放料口 11)。
[0018] 作為本實用新型的優選方案之一，所述通道I設置輸送泵10。
[0019] 上述技術方案中，優選所述通道I在所述反應器和輸送泵10之間設置細胞分離器 17,所述細胞分離器為固液分離器，所述固液分離器的進料口與通道I的近反應器方向相 接；所述固液分離器具有輕物料輸出口和重物料輸出口，所述輕物料輸出口與輸送泵10的 進料口連接，所述重物料輸出口輸回所述反應器。
[0020] 所述的固液分離器沒有特別限制，例如可以採用旋液分離器，也可以採用沉降器 等。所述的沉降器可以用斜管沉降器，此時固液分離器的進料口和重物料輸出口合併為共 用口並與通道I的近反應器方向相接。斜管沉降器可以是具有或者不具有擴張管的斜管沉 降器，但為達到更好的分離目的優先採用有擴張管的斜管沉降器。所述輕物料也即是貧含 細胞的物料，所述重物料也即是富含細胞的物料。
[0021] 上述技術方案中，優選所述通道I在輸送泵10和增氧塔13之間設置細胞碎片分 離器18。本實用新型裝置在細胞培養過程中，藉此細胞碎片分離器18將培養過程中產生的 細胞碎片從液態物料中除去，淨化生物反應器的培養環境。
[0022] 上述技術方案中，所述反應器自身可以不帶混合機構。
[0023] 上述技術方案中，所述的反應器自身可以帶有混合機構。所述混合機構包括但不 限於攪拌槳混合機構、氣升式混合機構，湍動式混合機構。例如所述的反應器為攪拌式反應 器；再例如所述的反應器為具有從反應器的底部進行通氣的細胞培養攪拌式生物反應器； 再例如所述的反應器為湍動床式細胞培養生物反應器或氣升式細胞培養生物反應器等等。
[0024] 上述技術方案中，對增氧塔內的填料層15中填料的材質和形狀沒有特別限制，均 可以採用現有技術中已有的那些。例如可選填料的材質可以為但不限於316L不鏽鋼、高硼 玻璃、聚四氟乙烯；填料的形狀可以是但不限于波紋板、絲網、鞍狀、拉西環、泡罩板、篩板、 纖維堆積體等。
[0025] 本領域技術人員知道，在通道I和/或通道II使用輸送泵的場合，為了降低在細 胞培養過程中流量的波動，從而有利於培養過程更平穩地運行，還可以在相應的通道中設 置中間槽，使中間槽與輸送泵的入口相連通；本領域技術人員還知道，為了提高增氧塔的生 產負荷，還可以為增氧塔自身建立循環迴路。為了更方便監測細胞培養過程中反應器內的 培養液的溫度，還可以在反應器上設置溫度電極，從而有利於調節反應器內培養液的溫度； 為監測裝置運行過程中裝置內由於液體與氣體混合造成的泡沫情況，還可以在在生物反應 器設置消泡電極，從而有利於通過適時加入適量的消泡劑將裝置內的泡沫控制在較小的 範圍內；為了更方便監測細胞培養過程中反應器內的壓力，還可以在反應器上設置壓力表； 為了將反應器中所有物料排空，可以採用多種方法實現，但為了更加方便地進行排空操作， 可以設置專門用於排空物料的物料排空口，從而能夠將反應器最底部的物料排空，而反應 器上的物料排空口的位置也沒有特別要求，例如可以設置在反應器頂部而通過管道直達反 應器內的最底部物料，當然還可以把物料排空口設置在反應器的最底部位置；等等。
[0026] 本實用新型實施例和比較例中，使用了 pH檢測裝置和溶解氧電極等，但未在相應 的說明書附圖中標出。
[0027] 本實用新型中【具體實施方式】和實施例中所涉及的溶解氧濃度，以相對飽和溶解度 來表示，剛經過121°C滅菌後降溫到所需培養溫度（36.8°C ±0.2°C)的培養液，溶解氧電 極測到的溶解氧濃度信號作為〇%，然後通增氧氣體至溶解氧達飽和，溶解氧的濃度不再增 加，此時溶解氧電極電信號走平，此時溶解氧濃度作為100%。溶解氧濃度可以控制在10% 以上，例如10?100%，更常用的是控制在40%以上，例如40?100%。本實用新型實施 例中反應器內的溶解氧濃度均控制在40%以上。為了提高溶解氧濃度，可以通過提高增氧 氣體的用量和/或降低待增氧液體的用量等方式實現；反之亦然，為了降低溶解氧濃度，可 以通過減少增氧氣體的用量和/或增加待增氧液體的用量等方式實現。本實用新型實施例 均通過調節通入增氧塔的增氧氣體的流量使生物反應器內培養液的溶解氧濃度在40%以 上，而比較例則是通過調節通入生物反應器內的增氧氣體的流量將培養液的溶解氧濃度在 40%以上。
[0028] 本實用新型裝置對細胞的種類沒有特別限制，只要是培養過程中消耗氧的那些細 胞均可以採用本實用新型裝置進行培養，均具有可比的技術效果。例如但不限於動物細胞， 動物細胞中例如但不限於CHO細胞、Vero細胞、BHK細胞、293細胞、二倍體細胞、SP20細胞、 淋巴細胞、地鼠腎細胞、豬睪丸細胞等。
[0029] 實驗表明，採用本實用新型裝置後，由於增氧的地點全部或者部分在增氧塔進行， 消除（當僅在增氧塔增氧不在反應器增氧時）或減少（當同時在增氧塔增氧和反應器增氧 時）了增氧過程中氣泡對細胞的物理傷害，從而更有利於細胞的繁殖，提高了反應器中細 胞密度；當本實用新型裝置進一步包括細胞分離器17時，使生物反應器中細胞密度得到進 一步提高；當本實用新型裝置同時包括，採用細胞分離器17和細胞碎片分離器18時，生物 反應器中細胞密度得到更進一步提高。
[0030] 下面結合說明書附圖和【具體實施方式】對本實用新型進行詳細的說明。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0031] 圖1為現有通氣攪拌式細胞培養生物反應器。
[0032] 圖2為現有湍動床式細胞培養生物反應器。
[0033] 圖3為現有氣升式細胞培養生物反應器。
[0034] 圖4為本實用新型第一種實施方式示意圖；其中的反應器自身具有攪拌槳，但反 應器自身沒有通氣裝置。
[0035] 圖5為本實用新型第二種實施方式示意圖；其中的反應器自身具有攪拌槳，但反 應器自身沒有通氣裝置。通道I設置細胞分離器17 (以具有擴張管的斜管沉降器為例）。
[0036] 圖6為本實用新型第三種實施方式示意圖；其中的反應器自身具有攪拌槳，但反 應器自身沒有通氣裝置。通道I設置細胞分離器（以具有擴張管的斜管沉降器為例）、輸送 泵和細胞碎片分離器18 (以旋液分離器為例）。
[0037] 圖7為本實用新型第四種實施方式示意圖；與圖6的區別僅僅是採用的反應器為 圖1所示的現有具有用於從反應器的底部進行通氣的攪拌式細胞培養生物反應器。
[0038] 圖8為本實用新型第五種實施方式示意圖；與圖6的區別是採用的反應器為圖2 所示的現有湍動床式細胞培養生物反應器。
[0039] 圖9為本實用新型第六種實施方式示意圖。與圖6的區別是採用的反應器為圖3 所示的現有氣升式細胞培養生物反應器。
[0040] 圖10是實施例1的培養時間與反應器中細胞密度關係曲線。
[0041] 圖11是實施例2的培養時間與反應器中細胞密度關係曲線。
[0042] 圖12是實施例3的培養時間與反應器中細胞密度關係曲線。
[0043] 圖13是比較例1的培養時間與反應器中細胞密度關係曲線。
[0044] 圖14是比較例2的培養時間與反應器中細胞密度關係曲線。
[0045] 圖1?9中，1為反應器進料口，2是反應器取樣口，3為反應器的攪拌槳，4為反應 器的接種口，5為反應器的放料口，6為反應器排氣口，7為反應器內氣體分布器，8為反應器 的多孔板，9為上下開口的導流筒，10為通道I上設置的輸送泵；11為本實用新型裝置的放 料口；12為增氧塔尾氣排放口，13為增氧塔，14為液體分布器，15為填料層，16為增氧塔內 部的氣體分布器；17為細胞分離器（以具有擴張管的斜管沉降器為例），18為細胞碎片分 離器（以旋液分離器為例）。圖1?9的反應器中還設置了 pH檢測裝置和溶解氧檢測裝 置，但未在圖中示出。

【具體實施方式】
[0046] 【實施例1】
[0047] -、實驗裝置
[0048] 採用圖4所示的成套生產裝置，其中
[0049] 5L生物反應器（工作體積3. 5L)及控制櫃：瑞士比歐公司；
[0050] 增氧塔：自製
[0051] 增氧塔塔體為外徑200mm、壁厚5mm的玻璃管，高度450mm，填料為直徑為5mm的高 硼矽酸鹽玻璃球，填料層高度為250mm。
[0052] 二、實驗材料
[0053] Vero細胞：來自中國科學院上海細胞庫；
[0054] 微載體cytodex I :美國GE公司；
[0055] 基礎培養基M199 (不含NaHCO3):美國Hyclone公司；
[0056] M199基礎培養液：將9. 45重量份的基礎培養基M199加900重量份注射用水溶解， 然後用濃度為5w%的碳酸氫鈉水溶液調節pH為7. 20?7. 30,再用注射用水稀釋到1000 重量份，除菌過濾，即得M199基礎培養液，待用；
[0057] 新生牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；
[0058] 完全培養液：按照體積比計，M199基礎培養液：新生牛血清=90:10混合；
[0059] 消化液：將0. 25重量份的胰蛋白酶和0. 02重量份的EDTA - 2Na溶解於100重量 份的生理鹽水中得到；
[0060] 生理鹽水：0· 85w% NaCl的注射用水溶液；
[0061] 增氧氣體：空氣與二氧化碳的混合物，其中空氣與二氧化碳體積比為95:5。
[0062] 三、操作方法
[0063] 1、細胞準備
[0064] I. 1細胞消化分散
[0065] 傾去培養有Vero細胞的轉瓶中的培養液，用生理鹽水洗滌掉瓶子殘餘培養液，潔 淨室內溫度（22?26°C )下，每個轉瓶加500ml消化液進行消化，目測瓶壁上細胞開始收 縮時，棄去消化液，每個轉瓶用500ml生理鹽水洗滌一次，洗去殘留消化液。加入完全營養 液，吹打，計數，得到的細胞懸液用於下述步驟1. 2貼壁。
[0066] L 2 貼壁
[0067] 稱取140g(Cytodex I)微載體用8000ml生理鹽水浸泡溶脹過夜，再121°C滅菌30 分鐘。降至室溫，棄上層清液，然後用微載體視體積2倍的完全培養液換洗3次，待用。
[0068] 取I. 1中得到的含7. 50 X IO8個細胞/ml的懸液250ml和含140g微載體的完全 培養液加入到移種瓶，加完全培養液至8000ml，放入36. 8°C ±0. 2°C二氧化碳培養箱中（培 養箱中的氣氛為空氣與二氧化碳混合物，空氣與二氧化碳的體積比為95:5)，每隔15分鐘 輕輕晃動移種瓶，使細胞和微載體充分接觸，以利細胞在微載體均勻貼壁。重複4次。然後 繼續在所述培養箱中培養4小時，得到微載體貼壁細胞。倒掉部分培養液，保留微載體貼壁 細胞，剩餘至體積3000ml刻度，作為移種混合液，備用。
[0069] 2、生產裝置準備
[0070] 2. 1、經反應器進料口 1向反應器中注入濃度為20mmol/L、pH = 7. 20的磷酸鹽緩 衝液3500毫升，滅菌，待用；
[0071] 2. 2、將圖4中所用器材經滅菌後，按圖4在無菌條件下連接。
[0072] 2. 3、將反應器內物料降至36. 8°C ±0. 2°C，校準溶解氧電極的溶解氧濃度顯示為 0%〇
[0073] 2. 4、排空生物反應器內的磷酸鹽緩衝液。
[0074] 2. 5、邊注入完全培養液，邊開啟輸送泵10,控制培養液進入增氧塔的流速為 500ml/分鐘，使生物反應器內液面穩定在2L刻度處。同時通過增氧塔的氣體分布器連續向 增氧塔通入無菌增氧氣體，無菌增氧氣體向上通過填料層15然後從增氧塔排氣口 12排出； 直至培養液在反應器和增氧塔之間達到穩定循環，控制生物反應器攪拌為30轉/分；控制 生物反應器溫度為36. 8 °C ±0. 2 °C ;控制生物反應器中液體的pH為7. 20?7. 30, pH調節 劑是濃度為5w %的碳酸氫鈉水溶液，並且溶解氧電極顯示走平。
[0075] 2. 6、校準溶解氧電極溶解氧濃度顯示為100%。
[0076] 3、細胞培養和取樣分析
[0077] 3. 1、排空生物反應器內的完全培養液。經接種口 4將步驟1. 2獲得的移種混合液 轉接到生物反應器，經進料口 1補充完全培養液至反應器內液面在3. 5L刻度處，然後維持 以5. 85升/小時的速度從進料口 1連續補充完全培養液，同時從放料口 11連續取出培養 液以維持反應器內的液面高度為3. 5L處不變，通過調節增氧氣體流速控制生物反應器溶 氧濃度不低於40%，並開始培養計時。
[0078] 3. 2、取樣和分析
[0079] 從反應器的取樣口 2定時取樣1ml，棄去上層清液，樣品沉積物用IOml生理鹽水洗 滌一次，再以1000轉/分鐘離心處理，棄上清液。沉積物用10毫升消化液消化，將貼壁於 微載體的細胞消化下來。用生理鹽水稀釋後用血球計數板對細胞計數，換算出相應時刻的 生物反應器中的細胞密度。
[0080] 表1給出了實施例1的培養時間和生物反應器中的細胞密度。為便於直觀考察培 養時間和細胞密度的關係，根據表1的數據繪製了圖10。從圖10可以看出，培養96小時時 達到了細胞密度的最大值I. 50X IO8個/毫升。96小時後細胞處在平衡期並出現細胞少量 衰亡。
[0081] 表 1

【權利要求】
1. 細胞培養生物成套生產裝置，包括細胞培養生物反應器、培養液增氧塔（13); 所述反應器具有反應器進料口（1)、反應器取樣口（2)、反應器接種口（4)、反應器排氣 口（6)、pH檢測裝置和溶解氧檢測裝置； 所述增氧塔（13)內部具有如下布置：上部空間設置液體分布器（14)、下部設置有與增 氧氣體入口相連通的增氧塔氣體分布器（16)，液體分布器（14)和增氧塔氣體分布器（16) 之間設置填料層（15);所述增氧塔頂部具有增氧塔尾氣排放口（12); 所述成套生產裝置具有從所述反應器內取出液體物料並輸送至所述增氧塔頂部與液 體分布器（14)相通的增氧塔進料通道I ; 所述成套生產裝置具有從所述增氧塔底部取出液體物料並輸回所述反應器的液體物 料回輸通道II。
2. 根據權利要求1所述的成套生產裝置，其特徵是所述通道I設置輸送泵（10)。
3. 根據權利要求2所述的成套生產裝置，其特徵是所述通道I在所述反應器和輸送泵 (10)之間設置細胞分離器（17)，所述細胞分離器為固液分離器，所述固液分離器的進料口 與通道I的近反應器方向相接；所述固液分離器具有輕物料輸出口和重物料輸出口，所述 輕物料輸出口與輸送泵（10)的進料口連接，所述重物料輸出口輸回所述反應器。
4. 根據權利要求3所述的成套生產裝置，其特徵是所述通道I在輸送泵（10)和增氧塔 (13)之間設置細胞碎片分離器（18)。
5. 根據權利要求1?4中任一項所述的成套生產裝置，其特徵是所述反應器自身不帶 混合機構。
6. 根據權利要求1?4中任一項所述的成套生產裝置，其特徵是所述的反應器自身帶 有混合機構。
7. 根據權利要求6所述的成套生產裝置，其特徵是所述的反應器為攪拌式反應器。
8. 根據權利要求6所述的成套生產裝置，其特徵是所述的反應器為具有從反應器的底 部進行通氣的細胞培養攪拌式生物反應器。
9. 根據權利要求6所述的成套生產裝置，其特徵是所述的反應器為湍動床式細胞培養 生物反應器或氣升式細胞培養生物反應器。
【文檔編號】C12M3/02GK204162726SQ201420630123
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月28日 優先權日:2014年10月28日
【發明者】朱文洲, 朱孜謙 申請人:上海尚優生物科技有限公司