一種自然殺傷t細胞活化劑多肽及其應用的製作方法
2023-04-25 02:46:56
一種自然殺傷t細胞活化劑多肽及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及藥物領域，具體涉及具有活化自然殺傷T細胞，抑制腫瘤壞死因子釋放酶、具有減輕急性炎症反應對機體破壞的多肽。其序列為FRQSFQKVLCLRKGS是全新的序列，在體內試驗中增加內毒素休克小鼠的生存率，具有潛在的新藥開發價值。
【專利說明】一種自然殺傷T細胞活化劑多肽及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及自然殺傷T細胞活化劑及其應用，具體涉及具有活化自然殺傷T細胞，治療急性淋巴細胞性白血病的多肽。
【背景技術】
[0002]急性淋巴細胞性白血病(ALL)是一種進行性惡性疾病，其特徵為大量的類似於淋巴母細胞的未成熟白細胞。這些細胞可在血液、骨髓、淋巴結、脾臟和其它器官中發現。急性淋巴細胞性白血病佔兒童急性白血病的80%，發病率高峰在3歲至7歲之間。ALL也可發生於成年人，佔所有成年人白血病的20%。近年來隨著醫學研究的深入，對急性淋巴細胞性白血病的認識和治療取得了很大進展。生物靶向治療腫瘤是非常有前景的，靶向治療是阻斷腫瘤發生的某個過程，達到治療腫瘤的目的。
[0003]自然殺傷T (natural killer T cells, NKT)細胞是一種具有特定標誌的T細胞亞群，既表達T細胞表面標誌，如CD3、TCRaB (人類表達Va24 Vfill，小鼠表達Val4 Jal8)，又表達NK細胞的表面標誌。NKT細胞只能識別由⑶Id分子遞呈的特異性糖脂類分子，而不是由主要組織相容性複合物(major histocompatibility complex, MHC)遞呈的多肽。NKT細胞活化後可迅速分泌一系列的細胞壞死相關因子，如穿孔素和TNF-α，增強其殺傷腫瘤細胞的作用；還可通過激活其他具有殺傷活性的效應細胞，如NK細胞和CD8 +細胞，發揮抗腫瘤作用。
[0004]因此，活 化自然殺傷T細胞，抑制急性淋巴細胞性白血病發展，是治療急性淋巴細胞性白血病的新靶點。但是，尚未有開發成熟的自然殺傷T細胞活化劑多肽的治療急性淋巴細胞性白血病的藥物。
[0005]本專利中的自然殺傷T細胞活化劑多肽已證明在急性淋巴細胞性白血病中有效，具有在其他腫瘤模型中開發的前景。
【發明內容】
[0006]發明目的
本發明提供全新的序列，該序列自然殺傷T細胞活化劑，對急性淋巴細胞白血病具有很好的療效。
[0007]技術方案
自然殺傷T細胞活化劑，其特徵在於其序列為FRQSFQKVLCLRKGS。
[0008]自然殺傷T細胞活化劑在製備治療急性淋巴細胞白血病藥物中的應用。
[0009]有益效果
利用固相合成法化學合成自然殺傷T細胞活化劑，該多肽具有全新的序列，該多肽可體外活化自然殺傷T細胞，治療急性淋巴細胞白血病。在體內試驗中增加內毒素休克小鼠的生存率，具有潛在的新藥開發價值。【具體實施方式】
[0010]本發明涉及多肽由吉爾生化(上海)合成。
[0011]實施例1
多肽的化學合成方法
多肽用Fmoc化學方法合成。合成反應從C端向N端進行，Rink介質(可在AdvancedChemTech公司購得)上有自由氨基，順序連接胺基酸。每一步連接過程中，胺基酸殘基都要活化，活化混合物中有4倍於介質上自由氨基的HBTU，HOBt7DIEA和Fmoc-胺基酸。每次胺基酸的連接反應之後，都用一個吡啶/醋酸/N-甲基咪唑(4:1:0.5)的混合物來封閉未連接的自由氨基，封閉反應10 min0每次胺基酸的連接反應之後，下一個胺基酸連接之前，都要把介質上的Fmoc-基團去掉，去Fmoc-基團使用含20%哌啶的二甲基甲醯胺，需15分鐘。最後，當所有胺基酸殘基順序連接之後，多肽用98%三氟乙酸從介質上切割下來，切割在室溫下進行2小時。
[0012]應用上述化學條件可合成並獲得多肽，序列為FRQSFQKVLCLRKGS，該序列為全新序列。
[0013]實施例2 自然殺傷T細胞活化劑I對體外培養腫瘤細胞的生長和存活IC50。
[0014]採用MTT比色法。將對數生長的U937細胞，以1.0X 105加入96孔培養板中，培養24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物自然殺傷T細胞活化劑I和陽性對照藥物長春新鹼；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設五個復孔，培養48h，分別在Oh、2h、8h、14h、20h、24h、36h、，48h 每孔加入 MTT，作用 4h 後，加入 DMSO，孵育 30min，在酶標儀620nm處測定吸光度A值，按公式腫瘤細胞生長抑制率=(1_實驗組吸光值/對照組吸光值)X 100%。計算出實驗藥物的IC50為5.77 μ M0
[0015]實施例3
用內毒素休克模型檢測自然殺傷T細胞活化劑I的體內活力
在建立內毒素休克模型之前，我們首先測定了 LPS(E.coli 0111:B4，sigma公司購買)小白鼠的LD50為50 μg每隻小鼠，在實驗中我們採用了 100 μg每隻小鼠，這樣，對照組的小鼠可全部死亡。在我們前面的科研工作中，發現Regas印in2 (另外一條多肽抑制劑，已公開)可提高C57BL/6小鼠在內毒素休克過程中的生存率。為了在我們的小白鼠上建立內毒素休克模型，我們用Regas印in2做了一個陽性對照實驗。對照組小鼠注射100 μg LPS，而Regasepin2實驗組的小鼠在注射LPS 5分鐘之後,每隻小鼠再注射0.7 mg的多肽。通過製作Kaplan-Meier生存曲線發現Regasepin2可有效的保護注射了 100 Pg的小鼠,提高了生存率。成功地在小白鼠上建立內毒素休克模型之後，用該模型檢測自然殺傷T細胞活化劑I的體內活力。對照組小鼠(12隻)注射100 Pg LPS，而自然殺傷T細胞活化劑I組小鼠(12隻)在注射LPS 5 min後，每隻小鼠注射0.7 mg自然殺傷T細胞活化劑I。用Kaplan-Meier生存曲線分析，自然殺傷T細胞活化劑I可有效地保護小白鼠，提高內毒素休克小鼠的生存率。
[0016]實施例4
整合素阻斷劑多肽1、多肽II和多肽III對黑色素瘤B16F10 C57BL/6黑鼠移植腫瘤生長抑制試驗取生長旺盛期的瘤組織在無菌條件下碾磨，製備成I X 17個/ml細胞懸液，以0.1 ml接種於小鼠右側腋部皮下。小鼠移植瘤用遊標卡尺測量移植瘤直徑，待腫瘤生長至100-200mm3後動物隨機分組。使用測量瘤徑的方法，動態觀察整合素阻斷劑多肽對受試動物腫瘤的抑制效果。腫瘤直徑的測量次數為每2天I次，每次測量同時還需稱量鼠重。實驗組左側腋部皮下注射多肽，陰性組同時給等量生理鹽水，給藥14 d，其中環磷醯胺隔天皮下給藥一次，紫杉醇組每3天皮下給藥一次，多肽低劑量一天給藥兩次組一天給兩次，其它各組一天給藥一次。治療14 d後,小鼠處死,手術剝取瘤塊稱重。腫瘤體積(tumor volume，TV)的計算公式為:
TV = l/2XaXb2
其中a、b分別表示長寬。
[0017]根據測量的結果計算出相對腫瘤體積(relative tumor volume, RTV),計算公式為:RTV = Vt/V0O其中Vtl為分籠給藥時(即(Ici)測量所得腫瘤體積，Vt為每一次測量時的腫瘤體積。抗腫瘤活性的評價指標為相對腫瘤增殖率T/C (%)，計算公式如下:
【權利要求】
1.自然殺傷T細胞活化劑1，其特徵在於其序列為FRQSFQKVLCLRKGS。
2.一種藥物組合物，其特徵在於其包含如權利要求1所述多肽與一種以上藥學上可接受的賦形劑、填充劑、粘合劑、潤滑劑、崩解劑、或穩定劑。
3.如權利要求2所述的藥物組合物，其特徵在於，所述組合物為注射劑。
4.如權利要求1所述的劑多肽，其特徵在於有效劑量為10mg/kg。
5.如權利要求1所述的自然殺傷T細胞活化劑I在製備、治療急性淋巴細胞性白血病藥物中的 應用。
【文檔編號】A61K38/10GK104031126SQ201410295889
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月27日 優先權日:2014年6月27日
【發明者】羅瑞雪 申請人:蘇州普羅達生物科技有限公司