肝細胞的長期培養方法

2023-04-25 06:33:11 2

專利名稱：肝細胞的長期培養方法
技術領域：
本發明涉及長期培養新鮮肝細胞並保持細胞的酶活性和酶誘導活性的方法。
背景技術：
肝細胞不僅產生白蛋白，還產生藥物代謝酶如那些屬於細胞色素P450(CYP)家族的酶和血凝固-纖維蛋白溶解相關的酶如α1-抗胰蛋白酶。因此，新鮮肝細胞的培養產物被廣泛用於測量這些酶的活性。
從肝臟收集的肝細胞通常保存在4℃或更低的冷藏環境中，以防止酶失活，此後，在用於進行各種試驗之前將溫度升至大約37℃並長期培養細胞。
近年來，由於人的肝細胞已經難以獲得，就需要將已經獲得的肝細胞長期保存或長途運輸(如跨國運輸)。為了滿足這種需求，必須將新鮮肝細胞保存至少2天，同時不引起酶活性或酶誘導活性的任何損失。
然而，在不高於4℃的常規低溫保存條件下，在2天或更長時間的保存期內，酶活性和酶誘導活性通常會降低30％到60％，因此妨礙了這種活性的正確測量。
因此，本發明的一個目的是提供一種長期培養肝細胞而不降低細胞的酶活性或酶誘導活性的方法。

發明內容
本發明人研究了能滿意地長期培養新鮮肝細胞的條件並獲得了下列發現。更確切地說，當肝細胞在大約37℃下保存時(這代表了生理條件)，與細胞在常規採用的低溫(4℃)條件下保存相比，細胞的酶活性和酶誘導活性被保持在一定的較好的水平。然而，當細胞在室溫下(即15到30℃之間)保存1到6天，然後再回到生理條件培養時，非常出乎意料的是，與在37℃下保存相比，甚至保持了更高的酶活性和酶誘導活性，活性被長期保持，當長途運輸肝細胞時，生物學試驗如藥物代謝酶誘導試驗得以準確進行。在這些發現的基礎上完成了本發明。
因此，本發明提供了長期培養肝細胞的方法，其特徵在於在15到30℃的培養基中保持新鮮肝細胞1到6天，接著在生理條件下培養。
附圖簡要說明

圖1顯示了在各種條件下保存48小時以後培養的猴肝細胞的尿素合成(也就是尿素生成)能力。
圖2顯示了在25℃保存48小時以後培養的猴肝細胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
圖3顯示了在25℃保存96小時以後培養的猴肝細胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
圖4顯示了在25℃保存48小時以後培養的猴肝細胞的CYP3A4誘導能力(RIF表示暴露於利福平，UT表示沒有暴露於利福平)。
圖5顯示了在25℃保存48小時以後培養的人肝細胞的尿素合成(也就是尿素生成)能力。
圖6顯示了在25℃保存96小時以後培養的人肝細胞的尿素合成能力。
圖7顯示了在25℃保存144小時以後培養的人肝細胞的尿素合成能力。
圖8顯示了在25℃保存96小時以後培養的人肝細胞的白蛋白合成能力。
圖9顯示了在25℃保存96小時以後培養的人肝細胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
圖10顯示了在25℃保存48小時、96小時或144小時以後培養的人肝細胞的CYP3A4誘導能力(RIF表示暴露於利福平，UT表示沒有暴露於利福平)。
發明的最佳實施方式施用本發明方法的肝細胞是新鮮肝細胞，其從組織中取出後還沒有經過傳代培養。換句話說，它們是原代培養的肝細胞。肝細胞的例子包括那些從哺乳動物尤其從靈長類動物獲得的肝細胞。尤其優選人肝細胞。
根據本發明，新鮮肝細胞必須在15到30℃的培養基中保持1到6天。當肝細胞保持在低於15℃例如4℃(這是通常的保存溫度)的溫度下時，肝細胞的酶活性和酶誘導活性降低。同樣地，當肝細胞保持在高於30℃例如大約37℃(這是生理條件)的溫度下時，和在15到30℃保存細胞的情況相比，肝細胞的酶活性和酶誘導活性降得更低。肝細胞保持的溫度優選18到27℃，更優選20到25℃。
用在本發明中保持新鮮肝細胞的培養基可以是用於動物細胞的常規培養基。這種培養基的例子包括Lanford’s培養基、William’s E(WME)培養基、Isom’s培養基、Leibovitz L15培養基、添加了聚乙二醇的Leibovitz L15培養基及其任意組合。尤其優選的培養基至少包含Lanford’s培養基。
加到保持新鮮肝細胞的培養基中的肝細胞數量是0.5×106到10×106細胞/mL，優選1×106到10×106細胞/mL。
肝細胞在15到30℃的保持時間是1到6天，優選2到6天。
肝細胞在15到30℃保持1到6天以後，細胞在生理條件下培養。優選地，在生理條件下的培養是在37±1℃的常規培養基中進行。如此處所用的，對於培養基沒有特別限制，只要它能用於常規培養所用的動物細胞。優選地，培養基和保持上述新鮮肝細胞時所採用的培養基是一樣的。特別優選使用至少包含Lanford’s培養基的培養基。
當肝細胞如上所述在生理條件下進行了持續培養時，細胞的酶活性和酶誘導活性經過較長時間，也就是說，經過1個月或更長時間也不會降低，因此，肝細胞可以用於酶活性或藥物代謝的酶誘導活性的準確測量。可測量的酶活性的例子包括α1-抗胰蛋白酶活性、穀氨醯胺-S-轉移酶(GST)、GOT、GPT的尿素生成和白蛋白合成能力。酶誘導活性的例子包括誘導屬於CYP家族的酶，如CYP1A1、CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2E6和CYP3A4。
肝細胞尤其是人肝細胞的獲得並不容易。尤其當從生物體獲得肝細胞的位置遠離進行試驗的位置時，例如在跨越國界的情況下，肝細胞的運輸通常需要2天或更多天。本發明的方法特別適合於長途運輸細胞以後進行試驗的情況。
實施例下面將以實施例的形式更詳細地描述本發明，這不應當看作是對本發明的限制。
A.材料和方法(1)肝細胞的原代培養從四個病人身上取出人肝。從年輕雄性猴子身上獲得猴肝。
從用已知方法(Drug Metab.Dispos.18595-606(1990)，Mol.Pharmacol.411047-1055(1992)，J.Pharmacol.Exp.Ther.269384-392(1994))進行了肝葉切除術的肝臟收集人肝細胞並培養。用臺盼藍排除試驗檢查將進行平皿培養的細胞的活力，發現是80％到90％。在放在培養瓶(25cm2)中的覆蓋有膠原I(5μm/cm2)的Isom’s培養基裡接種肝細胞，以獲得融合(12.4×104細胞/cm2)。所採用的培養基是Ham F12和William’s E的1∶1混合物，它是按照Proc.Nat.Acad.Sci.USA；816378-6382(1984)中的描述製備的。在細胞接種後頭4個小時內加入5％小牛血清以促進細胞粘著。肝細胞平皿培養後4小時，去除添加了小牛血清的標準培養基，取而代之加入Lanford’s培養基。因此，在培養的第1天，更換了培養基，接著，在5％CO2、37℃的潮溼環境下保持肝細胞的培養產物3天或4天。按照這種方法，一旦確定了肝細胞培養體系，通過抽吸去除Lanford’s培養基。用5％CO2平衡的95％空氣淨化燒瓶內部，裝入Lanford’s培養基(簡寫為「Lnf」)、添加了5％聚乙二醇的Leibovitz L15(Sigma化學品公司)培養基(簡寫為「L15+5％PEG」)或Isom’s培養基(37℃)。然後在冰凍條件或室溫下保持燒瓶2、4或6天。接著，含肝細胞的燒瓶的培養基被再次更換為Lnf，並在37℃長期培養。為了評價培養基、溫度和保存期對肝細胞活力和功能的影響，測試每次更換培養基後的24小時收集的細胞的代表細胞表型的幾個參數。特別地，測試參數包括尿素合成能力(通過酶/光譜分析)和α1-抗胰蛋白酶或白蛋白合成能力(通過蛋白質印跡法)。以與最初值和對照組數據相比較的方式顯示結果(對照在試驗期間於37℃下保持在Lnf中的那組)。此外，還研究了在細胞色素P450酶的誘導方面(利福平對CYP3A4的誘導)的細胞的反應。這種反應被認為是最好的表徵了肝特異的表型是否得以保持的指數，由於它可以預期藥物相互作用，因此，在藥物開發中被用作評價因素。
(2)培養基組合物所採用的培養基組合物示於表1、2和3中。
表1Lanford’s培養基(Lnf)

表2L15+5％PEG


表3Isom’s培養基

(3)溶解產物的製備使用離心機，用已知方法從培養的細胞製備溶解產物，並保存至使用的時候。用bicinchoninate法測量溶解產物的蛋白質濃度(Pierce化學品公司)。
(4)培養肝細胞的細胞外培養基中包含的血清蛋白的量用人蛋白特異的抗體通過蛋白質印跡法(western blotting)測量細胞外培養基(5到20μL培養基)中包含的白蛋白和α1-抗胰蛋白酶的量。從2個燒瓶(其中培養了細胞)中收集培養基樣品。合併收集的樣品，接著於11,000×g離心分離5分鐘並在-80℃保存直到用於分析。
(5)培養的肝細胞中包含的CYPs的量根據《肝臟病學》221143-1153(1995)中描述的方法，使用特異的多克隆或單克隆抗體，通過溶解產物的免疫印跡法(immunoblotting)對CYPs進行定量。加到每個凝膠中的標準品是含有遺傳表達的CYP2C9、CYP2C19或CYP3A4(Gentest)的微粒體。
在轉移到硝化纖維素膜上之前，對溶解產物進行電泳(SDS 10％聚丙烯醯胺凝膠)。用ECL(增強的化學螢光)(Amersham)展開樣品點。根據LE程序進行掃描，根據NIH成像1.6/ppc程序進行質量分析計算CYP的相對含量。
(6)細胞外培養基中包含的培養肝細胞的尿素合成能力用酶/光譜分析試劑盒(Sigma化學品公司)測量尿素合成能力。
B.結果(1)保存溫度對尿素合成能力的影響在0℃或25℃下，在Lnf或L-15+5％PEG中保持猴肝細胞2天。接著在37℃下於Lnf中培養細胞。培養了1、2、3、8或11天後，猴肝細胞的尿素合成能力顯示在圖1中。從圖1清楚的看到，和在37℃下於Lnf中保存後再培養的對照組細胞的尿素合成能力相比，在0℃下保存再被培養的細胞組的尿素合成能力在下列兩種情況下都比較低；也就是說，細胞在Lnf中培養的情況和細胞在L-15+5％PEG中培養的情況。相反，發現在25℃保存後再在Lnf中培養的細胞組和在25℃保存後再在L-15+5％PEG中培養的細胞組都保持了較相應的對照組高的尿素合成能力。Lnf比L-15+5％PEG提供了更好的結果。
(2)α1-抗胰蛋白酶合成能力和CYP3A4誘導能力在Lnf或L-15+5％PEG中，在25℃下保持猴肝細胞2天(48小時)或4天(96小時)。接著，在Lnf中，在37℃下培養細胞，測量細胞的α1-抗胰蛋白酶合成能力。結果顯示在圖2和3中。圖2和3中顯示的數據是相對於細胞從一開始就在37℃下保存和培養的試驗中獲得的數據相比的相對值。
圖2和3清楚的顯示，細胞在25℃下保存了2天或4天後再培養的情況與細胞從一開始就在37℃下保存和培養的情況相比，在培養期的第8到15天保持了較高的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
猴肝細胞在25℃下分別在Lnf中或L-15+5％PEG中保持了2天(48小時)。接著在Lnf中，在37℃下培養細胞，測量細胞的CYP3A4誘導能力。結果顯示在圖4中。圖4還顯示了細胞從一開始就在37℃下保存和培養的情況獲得的相對值。
圖4清楚的顯示，細胞在25℃下保持了2天後再培養的情況與細胞從一開始就在37℃下保存和培養的情況(1.8倍)相比，在培養的第10到14天觀察到了較強的CYP3A4誘導能力(2.3倍和2.4倍)。
(3)對尿素合成能力的影響(人肝細胞)在25℃下，在Lnf或Isom中保存人肝細胞2、4或6天。接著在37℃下，在Lnf中培養細胞，測量細胞的尿素合成能力。結果顯示在圖5、6和7中。
圖5、6和7清楚的顯示，與細胞從一開始就在37℃下保存和培養的對照組相比，在25℃下，在Lnf或Isom中保存了2、4或6天後再被培養的細胞顯示了較強的尿素合成能力。
(4)白蛋白合成能力和α1-抗胰蛋白酶合成能力(人肝細胞)在25℃下，在Lnf或Isom中保存人肝細胞4天。接著在37℃下，在Lnf中培養細胞，測量白蛋白合成能力和α1-抗胰蛋白酶合成能力。結果顯示在圖8和9中。
圖8和9清楚的顯示，與細胞從一開始就在37℃下保存和培養的對照組相比，在25℃下保存了4天後再培養的細胞顯示了較強的白蛋白合成能力和較強的α1-抗胰蛋白酶合成能力。
(5)CYP3A4誘導能力(人肝細胞)在25℃下，在Lnf中或L-15+5％PEG中保持人肝細胞2、4或6天。接著在37℃下，在Lnf中培養細胞，測量細胞的CYP3A4誘導能力。結果顯示在圖10中。
圖10清楚的顯示，與細胞從一開始就在37℃下保存和培養的對照組相比，在25℃下，在Lnf中或L-15+5％PEG中保存了2、4或6天後再培養的細胞顯示了較強的CYP3A4誘導能力。
工業實用性本發明的方法可以長期培養肝細胞而不會引起酶活性或酶誘導活性降低。而且，由於細胞可以在近似於室溫的條件下保存1到6天，本發明的方法對於肝細胞分離後長途運輸是很有用的。
權利要求
1.一種長期培養肝細胞的方法，其特徵在於在15到30℃下，在培養基中保持新鮮肝細胞1到6天，接著在生理條件下培養。
2.根據權利要求1的長期培養肝細胞的方法，其中，新鮮肝細胞的培養基至少含有Lanford’s培養基。
3.根據權利要求1或2的長期培養肝細胞的方法，其中，在生理條件下培養是在37±1℃下，在至少含有Lanford’s培養基的培養基中進行的。
全文摘要
一種長期培養肝細胞的方法，其特徵在於在15到30℃下，在培養基中保持新鮮肝細胞1到6天，接著在生理條件下培養。本發明的方法可以長期培養肝細胞而不會引起酶活性或酶誘導活性降低。而且，由於細胞可以在近似於室溫的條件下保存1到6天，本發明的方法對於肝細胞分離後長途運輸是很有用的。
文檔編號C12N5/071GK1628166SQ0282898
公開日2005年6月15日 申請日期2002年4月4日 優先權日2002年4月4日
發明者島田典招, P·毛雷爾 申請人:第一化學藥品株式會社