肽基精氨酸脫亞胺酶1在製備腫瘤臨床診斷試劑中的應用的製作方法
2023-04-24 11:02:51
肽基精氨酸脫亞胺酶1在製備腫瘤臨床診斷試劑中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了肽基精氨酸脫亞胺酶1在製備診斷腫瘤的臨床診斷試劑或檢測物中的應用，所述腫瘤選自子宮癌、肝癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、肺癌。具體應用時，以常規方法製備抗肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體，建立檢測肽基精氨酸脫亞胺酶1的定性或定量方法及配套試劑盒。本發明還公開了一種診斷腫瘤的血液診斷試劑，包括肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體、HRP-IgG抗體，以及血液診斷試劑中的常規試劑。所述血液診斷試劑中的常規試劑包括碳酸鹽緩衝液、PBST洗液、封閉液、顯色液和終止液。本發明首次發現PAD1可以作為腫瘤血液標誌物進行應用，經實驗證明，PAD1作為腫瘤標誌物具有可行性。
【專利說明】肽基精氨酸脫亞胺酶1在製備腫瘤臨床診斷試劑中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及肽基精氨酸脫亞胺酶1作為腫瘤血液標誌物在製備腫瘤臨床血液診 斷試劑中的應用。
【背景技術】
[0002] 肽基精氨酸脫亞胺酶（Peptidylarginine deiminase, PAD或PADI)是在人體組 織中一種酶，目前，共發現了五種PAD酶（即PAD/PADI1、2、3、4和6)。這些酶由坐落在人 類染色體lp36區域上的一簇基因所編碼，並具有不同的組織分布。它可以在鈣離子存在 的情況下對其它一些組織蛋白進行後翻譯修飾（post-translational modification)。這 個酶可將多肽鏈中的精氨酸（arginine)的氨基催化成羰基，從而使精氨酸轉化成瓜氨酸 (citrulline)。瓜氨酸是一個非自然胺基酸。這個由PAD催化的多肽中精氨酸轉化成瓜氨 酸的過程被稱做瓜氨酸化（citrullination)。蛋白發生瓜氨酸化後由於結構發生變化，導 致其酶活性、代謝活性、調節功能和結構功能均發生改變。因此，瓜氨酸化是和磷酸化、乙醯 化、糖基化、甲基化、泛素化一樣重要的蛋白翻譯後修飾方式。
[0003] 近年來，通過免疫學、細胞生物化學和分子遺傳學的研究，PAD4(肽基精氨酸脫亞 胺酶4, Peptidylarginine deiminase 4,或PADI4)被證明在人類類風溼性關節炎發病過 程中起著非常重要的作用，且可作為腺癌標誌物，在製備腺癌臨床診斷試劑中進行應用。 PADl (肽基精氨酸脫亞胺酶 1，Peptidylarginine deiminase 1，或 PADI1)和 PAD4 雖然同 為肽基精氨酸脫亞胺酶，但具有不同的組織分布，目前並未有關於PADl作為腫瘤血液標誌 物的相關報導。
【發明內容】
[0004] 針對上述現有技術，本發明通過研究得到了一種新的腫瘤血液標誌物一肽基精 氨酸脫亞胺酶I (PAD1/PADI1)，可用於腫瘤的臨床診斷。
[0005] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0006] 本發明通過實驗研究首次發現，與良性腫瘤患者血清、慢性炎症患者血清和正常 人血清相比，PADl在肝癌、結/直腸癌、乳腺癌、食管及賁門癌等惡性腫瘤患者血清中的表 達水平明顯增高。PADl能同時在多種惡性腫瘤患者血清中表達，這在目前使用的腫瘤標 記物中是比較少的（目前腫瘤血液標記物敏感性和特異性不理想，臨床現有腫瘤血清標記 物達20餘種，但絕大多數往往只能用於檢測一種腫瘤，敏感性和特異性差，通常只能採用 聯合檢測才能為臨床診斷提供有意義的數據）。本發明將PADl在血液中的表達水平與已 知腫瘤標記物水平進行比較，發現PADl腫瘤檢測陽性率和特異性不亞於CEA，廣譜性高於 CA125、CA199、PSA、CA242 等。
[0007] 基於以上發現，PADl作為腫瘤血清標記物應用具有更高的特異性，為此，本發明研 發了診斷範圍廣、敏感性強、特異性高的腫瘤診斷試劑盒及檢測方法，可廣泛用於臨床腫瘤 初步調查和健康普查，為臨床診斷提供可靠依據。
[0008] 具體地，以常規方法製備抗肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體，建立檢測肽基精氨酸脫 亞胺酶1的定性或定量方法及配套試劑盒。
[0009] -種診斷腫瘤的血液診斷試劑，包括肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體、HRP-IgG抗體， 以及血液診斷試劑中的常規試劑。
[0010] 所述血液診斷試劑中的常規試劑包括碳酸鹽緩衝液、PBST洗液、封閉液、顯色液和 終止液。
[0011] 進一步地，定性的檢測方法為間接ELISA方法，其原理為利用酶標記的抗抗體（抗 人免疫球蛋白抗體）以檢測與固相抗原結合的受檢抗體，具體方式如下：
[0012] (1)將待檢測血樣用碳酸鹽緩衝液（pH9. 6)稀釋10倍後，加至空白酶標板中，37°C 溫育2h ;
[0013] ⑵棄去孔內液體，PBST洗液洗板三次（所述PBST洗液是指PBS溶液加上 Tween-20, PBS溶液的pH為7. 4, Tween-20的濃度為0? 1 %，體積百分數）；
[0014] (3)每孔加封閉液（0? 5% BSA，質量百分數）200ii L/孔，37°C溫育Ih ;
[0015] (4)棄去孔內液體，PBST洗液洗板三次；
[0016] (5)每組加PADl抗體稀釋液（1:2000稀釋）IOOii L/孔，37°C溫育Ih ;
[0017] (6)棄去孔內液體，PBST洗液洗板三次；
[0018] (7)每孔加 HRP-IgG 抗體稀釋液（1:3000 稀釋）100ii L，37°C溫育 Ih ;
[0019] (8)棄去孔內液體，PBST洗液洗板五次；
[0020] (9)每孔加顯色液A、B【顯色劑A (含過氧化氫）為供氫體（DH2)，底物B就是顯 色劑B (含TMB，3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺）】各50 ii L，37°C顯色lOmin。
[0021] (10)每孔加50 i! L終止液（2M H2SO4溶液）終止顯色，振勻，用酶標儀檢測OD45tol值；
[0022] (11)計算：以陰性血清（正常人血清）為對照，檢測陰性血清OD45tlnm均值（是以 多份陰性血清為對照檢測出來再平均的值）；將OD45tlnm值代入公式P/N值=待測血樣OD45tol值/陰性血清OD45tlnm均值，計算得到待檢測血樣的P/N值；
[0023] (12)判斷：若待檢測血樣的P/N值大於或等於2. 1，則該待檢測血樣的檢測結果為 陽性，該待檢測血樣所屬的患者有可能患有腫瘤，可作為臨床診斷的依據之一。
[0024] 上述所涉及的抗體，為通過常規方法製備得到。上述所涉及的各種試劑，均為現有 技術中已有的常規試劑。
[0025] 同理，進行定量檢測時，也採用上述檢測原理，配製系列濃度的標準品，然後繪製 標準品濃度與OD45tlnm值或OD63tol值的標準曲線，並得到線性回歸方程，然後將待檢測血樣的 OD45tol值或OD63tol值代入標準曲線，求得樣品中的濃度。
[0026] 進一步地，定量檢測時，採用雙抗體夾心ELISA檢測PAD1，步驟如下：
[0027] (1)包被：將PADl單克隆抗體1用包被液（pH9. 6的碳酸鹽緩衝液）稀釋成I ii g/ mL，加至空白酶標板中，100 ii L/孔，4°C飽和溼度下放置過夜；
[0028] (2)洗板：棄去孔內液體，每孔加入PBST洗液300 ii L (所述PBST洗液是指PBS溶 液加上Tween-20, PBS溶液的pH為7. 4, Tween-20的濃度0? 1 %，體積百分數），浸泡15秒， 甩棄液體。連續洗板三次；
[0029] (3)封閉：每孔加封閉液（0? 5% BSA，質量百分數）200ii L/孔，37°C溫育Ih ;
[0030] (4)洗板三次，同步驟⑵；
[0031] (5)設定：留一孔作空白對照，暫不加任何液體；另設PADl標準品7孔，各加 100 y L標準品；
[0032] (6)加樣：將待檢測血樣用PBST稀釋10倍後，按順序加至反應孔中，室溫孵育 I. 5h ；
[0033] (7)洗板三次，同步驟（2);
[0034] (8)加酶：每個孔加入100 ii LHRP標記的PADl單克隆抗體稀釋液（1/3000)(不包 括空白對照），室溫孵育45min ;
[0035] (9)洗板三次，同步驟（2);
[0036] (10)顯色：每孔依次加入顯色液A、B【顯色劑A(含過氧化氫）為供氫體（DH2)， 底物B就是顯色劑B (含TMB，3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺）】各50 ii L (包括空白對照），震蕩 混勻，室溫避光顯色10分鐘；
[0037] (11)終止：每孔加入終止液各50 ii L (包括空白對照），震湯混勾終止反應；
[0038] (12)測定：用空白對照孔調零，並於30分鐘內用酶標儀單波長450nm測定各孔OD 值；也可用雙波長450nm/630nm測定各孔OD值；
[0039] (13)計算：以系列標準品濃度值的對數值為橫坐標（X軸），以標準品OD值的對數 值為縱坐標（Y軸），建立（log-log)標準曲線，計算待測樣本的PADl含量。
[0040] 另外，定性的檢測方法也可為膠體金法，其檢測原理為：採用雙抗體夾心法和膠體 金免疫技術，在膠體金墊上預加入抗PADl抗體膠體金結合物，在硝酸纖維素膜的檢測線和 對照線上分別包被有抗PADl抗體。當進行檢測時，如為陽性樣本，樣本中的PADl可與金標 抗PADl抗體結合形成複合物，由於層析作用複合物沿試紙向前移動，再與檢測線預包被的 抗體結合形成"金標抗體-PADl-抗體"複合物而凝集顯色。硝酸纖維膜上同時包被有一條 質控線作為對照，故當出現一條紅色質控線和一條紅色反應線時判為陽性。當待檢標本中 無PADl抗原時，只出現一條紅色質控線判為陰性。作為質控，不管結果為陽性或陰性，都會 出現一條紅色質控線。若無紅線（或只有反應線）出現，則檢測無效。具體的檢測方法為：
[0041] (1)用潔淨的容器收集少量樣本（血清樣本按常規方法靜脈採集；採集的樣本在 五天內檢測，需放置4°C保存，五天以上需放置-20°C保存，避免反覆凍融；如果樣本出現渾 濁或沉澱，應離心或過濾澄清後再檢測）；打開內包裝，取出檢測試紙。
[0042] (2)依據產品型號進行操作：
[0043] ①檢測條：將檢測條標有MX字樣的一端浸入樣本中30秒（注意：液面不要沒過 MAX線）取出平放於檯面上。
[0044] ②檢測卡：在檢測卡標有"S"字樣的加樣孔中，用滴管滴加4滴樣本（約100 ill)。
[0045] (3)待檢測條質控線（C線）出現後計時，20分鐘內觀察結果，20分鐘以後觀察結 果無效。
[0046] 檢驗結果的解釋：
[0047] ⑴陰性結果：僅出現質控線（C線）。
[0048] (2)陽性結果：出現兩條線，即質控線（C線）和檢測線（T線）。
[0049] (3)無效結果：無線出現，或僅出現檢測線（T線），須重新檢測。
[0050] 本發明首次發現PADl可在子宮癌、肝癌、胃癌、食管癌、肺癌和卵巢癌等多種惡性 腫瘤的細胞中以及血液中高表達，因此，PADl可以作為腫瘤血液標誌物進行應用，經實驗證 明，其特異性不亞於CEA，廣譜性高於CA242、CA125、PSA、CA199等。儘管PADl在多種腫瘤中 表達，達不到絕對的特異性，但是，所屬領域技術人員公知，臨床檢測指標的特異性的非絕 對唯一併不能否定檢測指標作為診斷相關疾病的手段之一的可行性，例如醫生經常將幾種 檢測指標結合臨床表現作出最後診斷。因此，PADl作為腫瘤標誌物具有可行性；儘管PADl 具有非唯一的特異性，但將PADl作為腫瘤血液標誌物結合其它檢測指標及臨床表現也足 以用於檢測腫瘤（這種方式也是目前臨床上的常見方式）。另外，本發明還發現，PADl還可 作為血液標誌物應用於炎症等其他疾病的檢測，如B肝、普通炎症（具有白細胞、中性粒細 胞增多，淋巴細胞比率降低的症狀）、腎病（包括腎病症候群、腎衰竭、腎炎）、尿毒症（包括 尿毒症和尿路感染），也可作為炎症等其它疾病的臨床診斷依據之一。
【具體實施方式】
[0051] 下面結合實施例對本發明作進一步的說明。
[0052] 下述實施例中所涉及的試劑、方法等，若無特別說明，均為現有技術中的常規試 劑、方法。
[0053] 實施例I PADl作為腫瘤血液標誌物的檢測實例1
[0054] 以PADl作為腫瘤血液標誌物，對腫瘤患者的血液進行檢測，腫瘤患者的例數以及 所患腫瘤的種類詳見表1。
[0055] 檢測方法為：
[0056] (1)將待檢測血樣用碳酸鹽緩衝液（pH9. 6)稀釋10倍後，加至空白酶標板中，37°C 溫育2h ;
[0057] (2)棄去孔內液體，PBST洗液洗板三次（所述PBST洗液是指PBS溶液加上 Tween-20, PBS溶液的pH為7. 4, Tween-20的濃度為0? 1 %，體積百分數）；
[0058] (3)每孔加封閉液（0? 5% BSA，質量百分數）200ii L/孔，37°C溫育Ih ;
[0059] (4)棄去孔內液體，PBST洗液洗板三次；
[0060] (5)每組加PADl抗體稀釋液（1:2000稀釋）100 ii L/孔，37°C溫育Ih ;
[0061] (6)棄去孔內液體，PBST洗液洗板三次；
[0062] (7)每孔加 HRP-IgG 抗體稀釋液（1:3000 稀釋）100 ii L，37°C溫育 Ih ;
[0063] (8)棄去孔內液體，PBST洗液洗板五次；
[0064] (9)每孔加顯色液A、B【顯色劑A (含過氧化氫）為供氫體（DH2)，底物B就是顯 色劑B (含TMB，3, 3'，5, 5' -四甲基聯苯胺）】各50 ii L，37°C顯色lOmin。
[0065] (10)每孔加50 ii L終止液（2M H2SO4溶液）終止顯色，振勻，用酶標儀檢測OD45tlnm 值；
[0066] (11)計算：以陰性血清（正常人血清）為對照，檢測陰性血清OD45tlnm均值（是以 多份陰性血清為對照檢測出來再平均的值）；將OD45tlnm值代入公式P/N值=待測血樣OD45tol值/陰性血清OD45tlnm均值，計算得到待檢測血樣的P/N值；
[0067] (12)判斷：若待檢測血樣的P/N值大於或等於2. 1，則該待檢測血樣的檢測結果為 陽性。
[0068] 結果：陽性例數及陽性率見表1，其它腫瘤標誌物的陽性率見表2(為現有技術中 能公開的數據），通過表1、表2可以看出，PADl作為腫瘤血液標誌物，具有良好的特異性， 廣譜性。
【權利要求】
1. 肽基精氨酸脫亞胺酶1在製備診斷腫瘤的臨床診斷試劑或檢測物中的應用。
2. 根據權利要求1所述的應用，其特徵在於：所述腫瘤選自子宮癌、肝癌、胃癌、食管 癌、卵巢癌、肺癌。
3. 肽基精氨酸脫亞胺酶1在製備診斷炎症的臨床診斷試劑或檢測物中的應用，所述炎 症選自B肝、普通炎症、腎病、尿毒症。
4. 根據權利要求1或2或3所述的應用，其特徵在於：以常規方法製備抗肽基精氨酸 脫亞胺酶1抗體，建立檢測肽基精氨酸脫亞胺酶1的定性或定量方法及配套試劑盒。
5. -種診斷腫瘤的血液診斷試劑，其特徵在於：包括肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體、 HRP-IgG抗體，以及血液診斷試劑中的常規試劑。
6. 根據權利要求5所述的診斷腫瘤的血液診斷試劑，其特徵在於：所述腫瘤選自子宮 癌、肝癌、胃癌、食管癌、卵巢癌、肺癌。
7. 根據權利要求5或6所述的診斷腫瘤的血液診斷試劑，其特徵在於：所述血液診斷 試劑中的常規試劑包括碳酸鹽緩衝液、PBST洗液、封閉液、顯色液和終止液。
8. -種診斷炎症的血液診斷試劑，其特徵在於：包括肽基精氨酸脫亞胺酶1抗體、 HRP-IgG抗體，以及血液診斷試劑中的常規試劑；所述炎症選自B肝、普通炎症、腎病、尿毒 症。
9. 根據權利要求8所述的診斷炎症的血液診斷試劑，其特徵在於：所述血液診斷試劑 中的常規試劑包括碳酸鹽緩衝液、PBST洗液、封閉液、顯色液和終止液。
【文檔編號】G01N33/573GK104360062SQ201410714949
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月28日 優先權日:2014年11月28日
【發明者】常曉天, 邢豔秋, 馬芳, 楊冬霞 申請人:山東創新藥物研發有限公司