磁性納米材料的新功能及新用途的製作方法

2023-04-25 05:43:46

專利名稱：磁性納米材料的新功能及新用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於納米材料學、納米生物學和納米醫學研究領域。更具體而言，本發明涉及磁性納米材料作為過氧化物酶的應用。
背景技術：
磁性納米材料指具有磁響應性的納米材料，在外加磁場的作用下這些納米材料具有強的磁響應信號。常用的磁性納米材料為三氧化二鐵、四氧化三鐵、鐵鈷合金等。磁性材料可通過不同的方法製備出不同尺度(1-1000nm)和不同形貌的納米結構，如零維的納米顆粒，一維的納米線、納米棒，二維的納米薄膜，三維的納米錐等，還可利用有機高分子包埋技術在磁性納米顆粒的基礎上製備微米級的磁性微球。
磁性納米材料具有較好的磁響應性，在生物醫學和電子等方面應用前景廣泛，尤其是生物醫藥領域。(1)通過DNA或蛋白質分子偶聯到磁性納米材料表面，結合納米材料的磁性可以製備親和層析用於生物樣品的快速分離和高效純化(參見，J.M.Nam，C.S.Thaxton，C.A.Mirkin，Science301，1884(2003)；Q.A.Pankhurstl，J.Connolly，S.K.Jones，J.Dobson，J.Phys.DAppl.Phys.36，R167(2003)；和I.Safarik，M.Safarikova，BiomagnRes Technol.2，7(2004))；(2)通過磁性納米材料表面進行合適的化學修飾，使材料表面的電荷發生改變，或者特定的化學基團，可以將藥物分子或基因結合在材料表面，利用外加磁場的導向，可以將藥物或外源基因向特定的部位進行輸送，從而實現藥物或基因的靶向運輸(參見，J.Panyam，V.Labhasetwar，Adv Drug Del Rev 55，329(2003)；和5.N.Morishita，et al.，Biochem Biophys Res Commun.334，1121(2005))；(3)磁性納米顆粒可以用於活體或細胞水平的磁共振成像，建立高空間解析度的活體實時成像技術，已經進入臨床用於活體成像診斷(參見，M.G.Harishingani，et al.，N.Engl.J.Med.348，2491(2003)；A.S.Arbab，et al.，Radiology 229，838(2003)；和I.J.de Vries，et al.，Nat Biotechnol.23，1407(2005))；(4)磁性納米材料可以用於腫瘤的治療，通過藥物靶向和磁靶向把磁性納米顆粒集中在腫瘤部位，在外加磁場的作用下，磁性納米顆粒可以產生高熱，殺死腫瘤部位的細胞，實現腫瘤治療的目的(參見，A.Ito，et al.，Cancer Lett.212，167(2004)；和F.Sonvico，et al.，Bioconjug Chem.16，1181(2005))。上述磁性納米材料的應用都是利用了納米材料的磁性特徵。
辣根過氧化物酶(HRP)是免疫酶標技術中最為常用的工具酶之一，常用於標記抗體，在酶聯免疫分析、免疫印跡和免疫組化等技術。這種酶含有正鐵原卟啉(血紅素)，能利用過氧化氫(H2O2)氧化供氫體(DH2，多為無色的還原型染料)，通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下
HRP的這種催化功能主要是藉助正鐵原卟啉中的鐵實現其催化功能的(參見洪偉傑等，生命的化學，25，33(2005))，而磁性納米顆粒中含有豐富的鐵，所以具備過氧化物酶催化功能的物質基礎。

發明內容
本發明突破了磁性納米材料的磁性物理特徵，首次發現這種磁性納米材料具有蛋白酶的催化活性，能夠催化過氧化氫或其它過氧化物，從而產生與過氧化物酶相類似的催化功能，這種催化機理遵循的是Fenton反應機理(參見V.Kavitha，et al.Chemosphere 55，1235(2004))，即在鐵離子存在下，可以催化H2O2產生自由基。通過對磁性納米材料酶學行為的研究以及與過氧化物酶的比較，確定磁性納米材料具有過氧化物酶的酶學活性。
因此，本發明提供以下(1)磁性納米材料作為過氧化物酶的應用。
(2)根據上面(1)所述的應用，其中將磁性納米材料用於直接分離和鑑定細胞、核酸和蛋白質；工業催化和發酵；監測環境中有害物質；淨化汙水；或預防和控制與自由基相關的疾病。
(3)根據上面(2)所述的應用，包括以下步驟在H2O2水溶液的存在下，磁性納米材料催化過氧化物酶的底物，生成相應的產物，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產生的自由基，所述的自由基與氫供體底物反應，導致氫供體生成有色或發光產物。
(4)根據上面(1)-(3)中任何一項所述的應用，其中所述的磁性納米材料為Fe3O4磁性納米顆粒。
(5)根據上面(3)所述的應用，其中H2O2在反應混合物中的濃度為0.2μM至1.3μM，並且磁性納米材料催化過氧化物酶的底物的反應是在pH3-6、25-55℃的溫度下進行的。
(6)根據上面(1)所述的應用，其中所述的磁性納米材料的粒徑為1-3000nm。
(7)根據上面(1)所述的應用，其中所述的磁性納米材料是被聚乙二醇、葡聚糖、二氧化矽、羥基和氨基修飾的。
(8)根據上面(1)所述的應用，其中所述的過氧化物酶為辣根過氧化物酶。
(9)一種將磁性納米材料用於檢測和分離蛋白的方法，該方法包括以下步驟磁性納米材料標記蛋白；標記蛋白後的磁性納米材料與其它蛋白結合；在H2O2水溶液的存在下，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產生自由基與過氧化物酶底物反應，導致顯色反應，從而檢測蛋白的結合。
(10)一種將磁性納米材料用於檢測和分離核酸的方法，該方法包括以下步驟磁性納米材料標記抗生物素蛋白；和標記抗生物素蛋白後的磁性納米材料在H2O2水溶液的存在下，與生物素化的DNA探針分子結合，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產生自由基與底物反應，導致顯色，從而檢測核酸的結合。
通過對磁性納米材料酶學行為的研究以及與過氧化物酶的比較，確定磁性納米材料具有過氧化物酶的酶學活性。這一新功能的發現，使磁性納米材料集磁性和催化活性為一體，豐富了磁性納米材料的新用途，將推動磁性納米顆粒在生物醫學等領域的應用。例如(1)利用磁性納米材料的磁性和催化活性，直接分離和鑑定細胞、核酸和蛋白質等生物樣品；(2)利用磁性納米材料的催化活性，應用於過氧化物酶所應用的工業催化和發酵；(3)利用磁性納米材料的酶催化活性，監測環境中有害物質，應用於汙水淨化等；(4)磁性納米材料應用於與自由基相關的疾病預防和控制。


圖1.磁性納米顆粒催化底物TMB反應產生顏色產物，其中A.不同尺度和形貌的磁性納米材料；B.磁性磁性納米顆粒在H2O2存在的條件下，催化TMB產生顏色反應；C.磁性磁性納米顆粒催化反應原理。
圖2.Fe3O4磁性納米顆粒催化TMB的表觀酶促動力學曲線，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性納米顆粒，HRP指辣根過氧化物酶作對照。
圖3.Fe3O4磁性納米顆粒催化TMB隨H2O2的變化，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性納米顆粒，HRP指辣根過氧化物酶作對照。
圖4.Fe3O4磁性納米顆粒催化TMB在不同pH體系中的變化，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性納米顆粒，HRP指辣根過氧化物酶作對照。
圖5.Fe3O4磁性納米顆粒催化TMB隨溫度的變化，其中Fe3O4NP指Fe3O4磁性納米顆粒，HRP指辣根過氧化物酶作對照。
圖6.不同尺度的磁性納米材料都具有過氧化物酶活性，但磁性納米顆粒尺度與酶活性成反比，尺度越小，酶活性越高。
圖7.不同基團修飾的Fe3O4磁性納米顆粒均具有過氧化物酶催化活性，然而不同基團修飾後的磁性納米顆粒顯示出不同的酶活性。
圖8.磁性納米顆粒作為標記物可直接用於探測蛋白質分子相互識別。
圖9.protein A標記的磁性納米顆粒在ELISA中的應用。NP-proteinA/BSA作陰性對照，NP-protein A/mIgG指利用Fe3O4磁性納米顆粒探測protein A與mIgG的識別，HRP-GAmIgG/biotin-mIgG作為陽性對照。
圖10.磁性納米顆粒作為標記物可直接用於探測核酸分子相互識別。
圖11.avidin標記的磁性納米顆粒用於核酸的檢測，其中NP-avidin指avidin偶聯的Fe3O4磁性納米顆粒，NP-avidin/biotin-DNA指Fe3O4磁性納米顆粒直接用於檢測核酸分子，HRP-avidin/biotin-DNA作為陽性對照。
圖12示意Fe3O4磁性納米顆粒用於分離和檢測mIgG。
圖13.Fe3O4磁性納米顆粒分離和檢測mIgG，其中NP-protein A/BSA作陰性對照，NP-protein A-biotin-mIgG指Fe3O4磁性納米顆粒先分離biotin-mIgG然後再檢測，HRP-GAmIgG/biotin-mIgG作為陽性對照。
圖14.Fe3O4磁性納米顆粒分離和檢測核酸。
圖15.Fe3O4磁性納米顆粒分離和檢測核酸分子，其中NP-avidin作陰性對照，NP-avidin-biotin-probe指Fe3O4磁性納米顆粒先分離biotin-DNA然後再檢測，HRP-avidin/biotin-DNA作為陽性對照。
具體實施例方式
實施例一、磁性納米材料具有催化活性試劑3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料均購自北京化學試劑公司。使用的磁性納米材料是由水熱法合成(參見，W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.Chen，C.Y.Hong，J.Magn.Magn.Mater.283，210(2004)；和H.Deng，X.L.Li，Q.Peng，X.Wang，J.P.Chen，Y.D.Li，Angew.Chem.Int.Ed.44，2782(2005))。
方法取20μg Fe3O4磁性納米材料(25nm，150nm，300nm，2300nm)，溶於500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μlTMB(10mg/ml，溶於二甲亞碸)，觀察顏色反應。
結果在Fe3O4磁性納米材料、H2O2和TMB三者都存在時，溶液出現藍色反應(圖1B)，只有Fe3O4磁性納米材料和H2O2時沒有顏色反應，只有Fe3O4磁性納米材料和TMB時沒有顏色反應，只有H2O2和TMB時沒有顏色反應。磁性納米材料包括不同尺度大小，也包括不同形貌(圖1A)，表明磁性納米材料在H2O2存在下催化TMB產生藍色反應，遵循Fenton催化反應機理(圖1C)。
實施例二、磁性納米材料具有過氧化物酶的催化活性試劑3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米材料合成材料均購自北京化學試劑公司。使用的磁性納米材料是Fe3O4磁性納米顆粒由水熱法合成(參見，W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.Chen，C.Y.Hong，J.Magn.Magn.Mater.283，210(2004)；和H.Deng，X.L.Li，Q.Peng，X.Wang，J.P.Chen，Y.D.Li，Angew.Chem.Int.Ed.44，2782(2005))，納米粒子直徑300nm。
方法在每個反應體系中，取20μg Fe3O4磁性納米顆粒，溶於500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH 4.5)，加入32μl的30％H2O2，分別加入不同容量(0，0.5，1，2，4，6，8，10μl)的TMB溶液(10mg/ml，溶於DMSO)，日立UV2010紫外可見分光光度計檢測652nm下的光吸收值，時間掃描600s，反應溫度25℃。辣根過氧化物酶(0.2ng)也在同樣條件下監測催化TMB的過程。
結果以反應最初20秒內652nm光吸收值的變化作圖，計算其斜率，即可得到反應初速度v，然後以TMB摩爾濃度為橫坐標，以v為縱坐標作圖，經origin處理得到酶促反應動力學曲線。米氏方程
v＝Vmax×[S]/(Km+[S])分析發現，Fe3O4磁性磁性納米顆粒表觀酶促催化動力學曲線與HRP酶促動力學一致，計算得到的表觀米氏常數Km(111.3±0.154μM)要小於HRP的Km(492.8±3.91μM)，表明底物與Fe3O4磁性納米顆粒的結合要優於HRP(圖2)。表明Fe3O4磁性納米顆粒具有與HRP相似的活性，表明Fe3O4磁性納米顆粒具有過氧化物酶活性，分析表明一個Fe3O4磁性納米顆粒的催化能力相當於約45個HRP分子。
實施例三、H2O2調節Fe3O4磁性納米顆粒催化酶學反應試劑3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料均購自北京化學試劑公司。Fe3O4磁性納米顆粒大小直徑為300nm。
方法取20μg Fe3O4磁性納米顆粒，溶於500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH4.5)，加入適量的30％H2O2，然後加入10μl的10mg/ml的TMB(溶於二甲亞碸)，日立UV2010紫外可見分光光度計檢測652nm下的光吸收值，時間掃描600s，反應溫度25℃。Fe3O4磁性納米顆粒催化，加入30％H2O2(μl)濃度梯度0，2，4，8，16，32，64，128。辣根過氧化物酶(0.2ng)也在同樣條件下監測催化TMB的過程，加入30％H2O2(μl)濃度梯度0，0.0625，0.125，0.25，0.5，1，2，4。
結果以反應最初20秒內652nm光吸收值的變化作圖，計算其斜率，即可得到反應初速度v，然後加入H2O2量換算成的摩爾濃度為橫坐標，以v為縱坐標作圖，Fe3O4磁性納米顆粒對H2O2的最適濃度在0.2-1.3μM之間，在H2O2低於0.2μM時催化反應速度較低，當H2O2高於1.3μM時催化反應受到抑制。而對於HRP，對H2O2的最適濃度在2.0-9.0nM之間。Fe3O4磁性納米顆粒與HRP在催化反應中對H2O2的反應基本一致，但前者在催化反應中需要的H2O2要遠高於後者(圖3)，同時表明Fe3O4磁性納米顆粒清除H2O2的能力要高於HRP。
實施例四、反應溶液pH調節Fe3O4磁性納米顆粒催化酶學反應試劑3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料均購自北京化學試劑公司。Fe3O4磁性納米顆粒大小直徑為300nm。
方法取20μg Fe3O4磁性納米顆粒，溶於500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液，加入0.5μl的30％H2O2，然後加入的10μl的10mg/ml的TMB(溶於DMSO)，日立UV2010紫外可見分光光度計檢測652nm下的光吸收值，時間掃描600s，反應溫度25℃。0.2M醋酸鈉緩衝液(pH)1.5，2.5，3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，8.5，9.5，10.5。辣根過氧化物酶(0.2ng)也在同樣條件下監測催化TMB的過程。
結果以反應最初20秒內652nm光吸收值的變化作圖，計算其斜率，即可得到反應初速度v，然後以pH為橫坐標，以v為縱坐標作圖，發現Fe3O4磁性納米顆粒催化反應緩衝液最適pH在3.5-5.5之間，當pH低於3或高於6時，反應受到抑制，HRP催化反應緩衝液最適pH在3.5-5.5之間。這表明Fe3O4磁性納米顆粒與HRP的最適pH值範圍一致(圖4)，進一步表明Fe3O4磁性納米顆粒具有過氧化物酶活性。
實施例五、溫度調節Fe3O4磁性納米顆粒催化酶學反應試劑3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料均購自北京化學試劑公司。Fe3O4磁性納米顆粒大小直徑為300nm。
方法取20μgFe3O4磁性納米顆粒，溶於500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2，然後加入10μl的10mg/ml的TMB，日立UV2010紫外可見分光光度計檢測652nm下的光吸收值，時間掃描600s。溫度處理(℃)25，30，35，40，45，50，55。辣根過氧化物酶(0.2ng)也在同樣條件下監測催化TMB的過程。
結果以反應最初20秒內652nm光吸收值的變化作圖，計算其斜率，即可得到反應初速度v，然後以溫度濃度為橫坐標，以v為縱坐標作圖，發現Fe3O4磁性納米顆粒和HRP對反應溫度的敏感性一致，其最適溫度基本一致(圖5)，進一步表明Fe3O4磁性納米顆粒具有過氧化物酶活性。
實施例六、不同尺度的磁性納米材料具有過氧化物酶的催化活性試劑3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP，EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料均購自北京化學試劑公司。
使用的磁性納米材料150nm和300nm的Fe3O4磁性納米顆粒由水熱法合成，25nm的Fe3O4磁性納米顆粒由共沉澱法合成(參見，W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.Chen，C.Y.Hong，J.Magn.Magn.Mater.283，210(2004)；和H.Deng，X.L.Li，Q.Peng，X.Wang，J.P.Chen，Y.D.Li，Angew.Chem.Int.Ed.44，2782(2005))。
方法取300nm大小的20μg Fe3O4磁性納米顆粒，溶於500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH 4.5)，加入32μl的30％H2O2，然後加入10μl的10mg/ml的TMB(溶於二甲亞碸)，日立UV2010紫外可見分光光度計檢測652nm下的光吸收值，時間掃描400s，反應溫度25℃。150nm和25nm的Fe3O4磁性納米顆粒進行相同的操作結果25nm、150nm和300nm的Fe3O4磁性納米顆粒均具有過氧化物酶催化活性，在相同質量時，催化活力25nm＞150nm＞300nm(圖6)實施例七、不同修飾的磁性納米材料具有過氧化物酶活性試劑葡聚糖(Dextran-40)，聚乙二醇(polyethylene glycol 8000，PEG-8000)，3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP EC 1.11.1.7，＞300units/mg)，購自Sigma-Aldrich Inc.(USA)。30％H2O2和醋酸鈉以及Fe3O4磁性納米顆粒合成材料及修飾均購自北京化學試劑公司。
方法Fe3O4磁性納米顆粒PEG和Dextran修飾參見文獻[11]，SiO2和NH2修飾參見文獻(P.Tartaj，T.Gonzalez-Carreno，C.J.Serna，Adv Mater 13，1620(2001))。取不同修飾的Fe3O4磁性納米顆粒各20μg，分別溶於500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2，然後加入10μl的10mg/ml的TMB(溶於二甲亞碸)，日立UV2010紫外可見分光光度計檢測652nm下的光吸收值，時間掃描400s，反應溫度25℃。
結果不同基團修飾的Fe3O4磁性納米顆粒均具有過氧化物酶催化活性(圖7)。然而，不同的修飾材料影響其酶活性。無修飾的Fe3O4磁性納米顆粒酶活性最高，其次是葡聚糖修飾高於聚乙二醇修飾，二氧化矽和氨基修飾的磁性納米顆粒酶活力最低。
實施例八、磁性納米顆粒標記用於蛋白檢測由於Fe3O4磁性納米顆粒具備了HRP的酶催化功能，所以可以應用於HRP所應用的領域，取代HRP用來標記生物分子，實現放大信號的檢測功能。如圖8示意。
試劑葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，金黃色葡萄球菌蛋白A(protein A)，生物素(NHS-biotin)，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(HRP labeled goatanti-mouse IgG，HRP-GAmIgG)，3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，購自Sigma-Aldrich Inc.(USA)方法Fe3O4磁性納米顆粒的葡聚糖(Dextran)修飾參見參考文獻(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我們使用的葡聚糖Dextran-40。利用carboxyl diimidazole(CDI)將Fe3O4磁性納米顆粒上Dextran-40中的羥基活化，然後加入protein A使活化的羥基與蛋白中的氨基反應，通過這種共價偶聯使protein A固定在Fe3O4磁性納米顆粒表面，形成複合物NP-protein A。後者與酶標二抗類似，能夠通過與一抗的結合，直接發生顯色反應。這種protein A修飾的磁性納米顆粒可應用於ELISA、western blot和免疫組織化學等免疫反應。例如，在ELISA實驗中，將鼠IgG(mIgG)包被在ELISA免疫96孔中，經3％BSA封閉1小時，加入NP-protein A在37℃作用1小時，然後加入100μl顯色液(配方500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室溫顯色10min，加入50μl 2M H2SO4終止反應，450nm下檢測光吸收值。HRP標記的羊抗鼠(HRP-GAmIgG)在本實驗中作為陽性對照。牛血清白蛋白(BSA)包被的孔作陰性對照。
結果Fe3O4磁性納米顆粒標記protein A(NP-protein A)後，能夠與鼠抗體結合併發生顯色反應，其OD450吸收值與HRP-羊抗鼠二抗顯色的光吸收值相當(圖9)，表明Fe3O4磁性納米顆粒可以用於的HRP所應用的ELISA等各種免疫檢測和臨床診斷。
實施例九、Fe3O4磁性納米顆粒標記用於核酸檢測由於Fe3O4磁性納米顆粒具備HRP的酶催化功能，所以可以應用於HRP所應用的領域，取代HRP用來標記生物分子，實現放大信號的檢測功能。圖10示意磁性納米顆粒標記用於核酸檢測。
試劑葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，親和素(avidin)，生物素(NHS-biotin)，辣根過氧化物酶標記的親和素(HRP-avidin)，3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，購自Sigma-Aldrich(USA).Biotin-probe DNA(biotin-5』-ATCCTTATCAATATT-3』)由賽泰克公司(中國)合成。
方法Fe3O4磁性納米顆粒的葡聚糖(Dextran)修飾參見參考文獻(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我們使用的葡聚糖Dextran-40。利用羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)將Fe3O4磁性納米顆粒上Dextran-40中的羥基活化，然後加入親和素avidin使活化的羥基與avdin中的氨基反應，通過這種共價偶聯使avidin固定在Fe3O4磁性納米顆粒表面，得到NP-avidin複合物。在ELISA實驗中，將生物素化的DNA探針分子(biotin-DNA)包被在ELISA免疫96孔中，經3％BSA封閉1小時，加入NP-avidin在37℃作用1小時，然後加入100μl顯色液(配方500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室溫顯色10min，加入50μl 2M H2SO4終止反應，450nm下檢測光吸收值。HRP-avidin在本實驗中作為陽性對照。BSA包被的孔作陰性對照。
結果Fe3O4磁性納米顆粒標記avidin後，能夠與生物素化的DNA探針分子(biotin-DNA)結合併產生顯色反應，其OD450吸收值與HRP-avidin顯色的光吸收值相當(圖11)，表明Fe3O4磁性納米顆粒可以用於核酸的檢測。
實施例十、Fe3O4磁性納米顆粒分離—檢測蛋白由於Fe3O4磁性納米顆粒具備磁性和催化雙重功能，而磁性使它具備了分離DNA、蛋白質、細胞等功能，所以將磁性與酶催化活性相結合可以實現分離與檢測的一體化，即分離—檢測「separation-detection」。如圖12示意Fe3O4磁性納米顆粒用於分離和檢測mIgG。
試劑葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，protein A，生物素(NHS-biotin)，辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(HRP labeled goat anti-mouse IgG，HRP-GAmIgG)，3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，購自Sigma-Aldrich Inc.(USA)方法Fe3O4磁性納米顆粒的葡聚糖(Dextran)修飾參見參考文獻(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我們使用的葡聚糖Dextran-40。利用carboxyl diimidazole(CDI)將Fe3O4磁性納米顆粒上Dextran-40中的羥基活化，然後加入protein A使活化的羥基與蛋白中的氨基反應，通過這種共價偶聯使protein A固定在Fe3O4磁性納米顆粒表面，形成複合物NP-protein A。將biotin-mIgG與BSA混合，加入NP-protein A，37℃作用1小時，然後收集Fe3O4磁性納米顆粒，PBS洗滌三次，得到NP-protein A-biotin-mIgG複合物，然後將複合物加入到avidin包被的免疫96孔中，在37℃作用1小時，然後加入100μl顯色液(配方500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室溫顯色10min。加入50μl 2M H2SO4終止反應，450nm下檢測光吸收值。NP-protein A與BSA混合的樣品作陰性對照。HRP-GAmIgG作陽性對照，操作是先加入同樣量的biotin-mIgG然後加入HRP-GAmIgG檢測。
結果同時將Fe3O4磁性納米顆粒的分離(separation)與檢測(detection)功能相結合，實現了Fe3O4磁性納米顆粒分離物質的直接檢測，結果顯示Fe3O4磁性納米顆粒「separation-detection」得到的光吸收值與在直接顯色的實驗相當(圖13)，表明Fe3O4磁性納米顆粒的分離和檢測功能可以同時得到應用。
實施例十一、Fe3O4磁性納米顆粒的分離—檢測核酸由於Fe3O4磁性納米顆粒還具備獨特的磁學性能，而磁性使它具備了分離提出DNA、蛋白質、細胞等功能，所以將磁性與酶催化相結合可以實驗分離與檢測的一體化，即「separation-detection」。如圖14示意。下述實施例給出了Fe3O4磁性納米顆粒用於分離和檢測核酸識別的例證。
試劑葡聚糖(Dextran-40)，羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)，鼠IgG(mouse immunoglobulin G，mIgG)，親和素(avidin)，生物素(NHS-biotin)，辣根過氧化物酶標記的親和素(HRP-avidin)，3，3，5，5-四甲基聯苯胺(3，3，5，5-Tetramethylbenzidine，TMB)，購自Sigma-Aldrich Inc.(USA).Biotin-probe DNA(biotin-5』-ATCCTTATCAATATT-3』)and target DNA(5』-GGATTATTGTTAAATATTGATAAGGAT-3』)由賽泰克公司(中國)合成。
方法Fe3O4磁性納米顆粒的葡聚糖(Dextran)修飾參見參考文獻(W.Q.Jiang，H.C.Yang，S.Y.Yang，H.E.Horng，_J.C.Hung，Y.C.)。我們使用的葡聚糖Dextran-40。利用羰基二咪唑(carboxyl diimidazole，CDI)將Fe3O4磁性納米顆粒上Dextran-40中的羥基活化，然後加入親和素avidin(圖14)使活化的羥基與avidin中的氨基反應，通過這種共價偶聯使avidin固定在Fe3O4磁性納米顆粒表面，得到NP-avidin複合物。將生物素化DNA探針(biotin-DNA)與無關DNA混合，加入NP-avidin，37℃作用1小時，然後收集Fe3O4磁性納米顆粒，PBS洗滌三次，得到NP-avidin-biotin-DNA複合物，然後將複合物加入到目標DNA(target DNA，可以與biotin-DNA配對識別雜交)包被的ELISA免疫96孔中(圖14)，在37℃作用1小時，然後加入100μl顯色液(配方500μl的0.2M醋酸鈉緩衝液(pH4.5)，加入32μl的30％H2O2和10μl的10mg/ml的TMB)室溫顯色10min。加入50μl 2M H2SO4終止反應，450nm下檢測光吸收值。NP-avidin與無關DNA混合檢測作陰性對照。HRP-avidin作陽性對照，操作是先加入同樣量的biotin-DNA然後加入HRP-avidin檢測。
結果同時將Fe3O4磁性納米顆粒的分離(separation)與檢測(detection)功能相結合，實現了Fe3O4磁性納米顆粒分離物質的直接檢測，結果顯示Fe3O4磁性納米顆粒「separation-detection」得到的光吸收值與在直接顯色的實驗相當(圖15)，表明Fe3O4磁性納米顆粒的分離和檢測功能可以同時得到應用。
權利要求
1.磁性納米材料作為過氧化物酶的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其中將磁性納米材料用於直接分離和鑑定細胞、核酸和蛋白質；工業催化和發酵；監測環境中有害物質；淨化汙水；或預防和控制與自由基相關的疾病。
3.根據權利要求2所述的應用，包括以下步驟在H2O2水溶液的存在下，磁性納米材料催化過氧化物酶的底物，生成相應的產物，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產生的自由基，所述的自由基與氫供體底物反應，導致氫供體生成有色或發光產物。
4.根據權利要求1-3中任何一項所述的應用，其中所述的磁性納米材料為Fe3O4磁性納米顆粒。
5.根據權利要求3所述的應用，其中H2O2在反應混合物中的濃度為0.2μM至1.3μM，並且磁性納米材料催化過氧化物酶的底物的反應是在pH 3-6、25-55℃的溫度下進行的。
6.根據權利要求1所述的應用，其中所述的磁性納米材料的粒徑為1-3000nm。
7.根據權利要求1所述的應用，其中所述的磁性納米材料是被聚乙二醇、葡聚糖、二氧化矽、羥基和氨基修飾的。
8.根據權利要求1所述的應用，其中所述的過氧化物酶為辣根過氧化物酶。
9.一種將磁性納米材料用於檢測和分離蛋白的方法，該方法包括以下步驟磁性納米材料標記蛋白；標記蛋白後的磁性納米材料與其它蛋白結合；在H2O2水溶液的存在下，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產生自由基與過氧化物酶底物反應，導致顯色反應，從而檢測蛋白的結合。
10.一種將磁性納米材料用於檢測和分離核酸的方法，該方法包括以下步驟磁性納米材料標記抗生物素蛋白；和標記抗生物素蛋白後的磁性納米材料在H2O2水溶液的存在下，與生物素化的DNA探針分子結合，其中磁性納米材料中包含的鐵在H2O2存在下，催化H2O2產生自由基與底物反應，導致顯色，從而檢測核酸的結合。
全文摘要
本發明發現磁性納米材料具有蛋白酶的催化活性。磁性納米材料在H
文檔編號C12N9/02GK101037676SQ20061005741
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月13日 優先權日2006年3月13日
發明者閻錫蘊, 高利增, 聶稜, 王太宏 申請人:中國科學院生物物理研究所