煙醯胺腺嘌呤二核苷酸營養缺陷型大腸桿菌的構建及其應用的製作方法

2023-04-24 23:45:06

專利名稱：煙醯胺腺嘌呤二核苷酸營養缺陷型大腸桿菌的構建及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)營養缺陷型埃希氏菌屬(Escherichia)微生物的構建及其應用。更具體地講，是在埃希氏菌屬微生物胞內置入一種可表達NAD跨膜轉運蛋白的載體，並阻斷其天然的NAD生物合成途徑，獲得依賴於外源吡啶核苷酸輔酶生長的工程菌，並應用於生物催化、NAD跨膜轉運蛋白抑制劑篩選、代謝調控、非抗生素篩選標記和蛋白質表達等。
背景技術：
煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)及煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)是非常重要的輔因子。NADH和NADPH分別是NAD和NADP的還原形態，它們在胞內可以相互轉化。NAD、NADH、NADP和NADPH統稱為吡啶核苷酸輔酶。原核微生物細胞內有300個以上的氧化還原反應以它們為輔因子，它們的濃度及相對含量變化會影響代謝網絡及生長特性。在乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)中高表達來源於變形鏈球菌(Streptococcus mutans)的NADH氧化酶，NADH/NAD比例降低，結果導致乳酸乳球菌由單一乳酸發酵變成了混合酸發酵(deFelipe et al. , J Bacteriol, 1998,180, 3804)。在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表達乳酸乳球菌的NADH氧化酶，胞內NADH濃度降低5倍，導致代謝網絡顯著改變，甘油、乙醇、琥珀酸、羥基戊二酸產量明顯降低，而一些氧化型產物乙醛、乙酸、乙偶姻產量增加(Heuxet al. ,Metab Eng, 2006,8, 303)。在大腸桿菌(Escherichia coli)中表達來源於博伊丁假絲酵母(Candida boidinii)甲酸脫氫酶，胞內NADH含量增加，而NAD/NADH總量不變，結果乙醇/ 乙酸的比例從 I. 05 提高到 9. 45 (Sanchez et al. , J Biotechnol, 2005,117,395)。以上研究成功通過表達甲酸脫氫酶或NADH氧化酶調節胞內NADH/NAD比例，但未能有效改變胞內吡啶核苷酸輔酶總水平。通過操作NAD生物合成中間體形成的相關基因或NAD合酶基因，增加NAD⑶總水·平的研究已有報導(San et al. , Metab Eng, 2002,4,182 ；Heuser et al. , Eng Life Sci,2007，7，343)。但由於胞內吡啶核苷酸輔酶水平受到嚴格調控，其生物合成途徑受到胞內輔因子反饋調控(Foster et al. , J Bacteriol, 1990,172,4187),所以胞內總輔因子濃度維持在一定範圍內，難以進行大幅度調控。大腸桿菌中存在兩種NAD生物合成途徑，一是NAD從頭合成途徑，即以天冬氨酸為前體，經過喹啉酸生成煙酸單核苷酸(NAMN)，再經煙醯胺單核苷酸腺苷醯轉移酶(NadD)和NAD合酶(NadE)催化生成NAD。另一種途徑是分支途徑，即以NAD (H)分解中間產物煙醯胺單核苷酸(NMN)為原料，由 NadD 催化生成 NAD (Begley et al.，Vitam Horm，2001，61，103 ；Hove-Jensen et al. ,J Bacteriol, 1996,178, 714)。理論上敲除大腸桿菌基因組中的關鍵基因nadD和nadE,可得到NAD生物合成途徑阻斷的工程菌株。然而，敲除nadD或nadE後菌株不能正常產生NAD，並且微生物因缺少NAD (H)跨膜轉運系統也無法從環境中獲取NAD。因此，nadD或nadE因敲除菌株因缺少細胞生長代謝必需的輔因子NAD而無法生長，即nadD或 nadE 被認為是致死基因(Baba et al.，Mol Syst Biol，2006，2，20060008)。目前文獻中尚沒有成功獲得nadE或nadE基因敲除或缺失的埃希氏菌屬微生物工程菌株的報導。

發明內容
本發明通過在埃希氏菌屬微生物胞內表達NAD跨膜轉運蛋白，並阻斷NAD生物合成途徑，構建NAD營養缺陷型工程微生物，實現對胞內吡啶核苷酸輔酶的調控，並將應用於生物催化、NAD跨膜轉運蛋白抑制劑篩選、代謝調控 、非抗生素篩選標記和蛋白質表達等生物技術領域。為解決NAD跨膜轉運的問題，本發明採取的策略是在埃希氏菌屬微生物中導入一種可自我複製並攜帶NAD轉運蛋白編碼基因的蛋白質表達載體。NAD跨膜轉運蛋白編碼基因包括以下基因，來源於衣原體Protochlamydia amoebophila UWE25的ntt4(NCBIGeneID :2780098) (Haferkamp et al.，Nature，2004，432，622);或來源於釀酒酵母 S288C的ScNDTl(NCBI GeneID :854811)、ScNDT2(NCBI GeneID :856712) (Todisco et al. ,J BiolChem, 2006，281，1524);或來源於擬南芥的 AtNDTl (NCBI GeneID :819362)、AtNDT2 (NCBIGeneID :839124) (Palmieri et al.，J Biol Chem，2009，284，31249)或它們的具有相似功能的突變基因。其中來源於衣原體的ntt4編碼的蛋白NTT4既能轉運MD，也能轉運NADH，但對ATP或GTP等沒有明顯轉運作用，因此，ntt4是優選基因。本發明使用的可自我複製的蛋白質表達載體為常用的含有誘導型啟動子tac、trc、Iac 或 T7 等的表達載體(Sambrook et al. , Molecular cloning A laboratorymanual, 2001, pp. 12171240, New York Cold Spring Harbor Laboratory Press);或含有組成型啟動子的表達載體(Alperatal.，Proc Natl Acad Sci USA，2005，102，12678)。NAD跨膜轉運蛋白編碼基因採用成熟的基因克隆技術插入到蛋白質表達載體中，並進一步採用轉化方法置入到埃希氏菌屬微生物細胞內(Sambrook et al. , Molecular cloning Alaboratory manual, 2001, pp. 9699, New York Cold Spring Harbor Laboratory Press)。為阻斷埃希氏菌屬微生物NAD生物合成途徑，本發明採取的策略是通過基因敲除(替換)或基因斷裂的分子生物學方法，使菌株基因組中編碼煙醯胺單核苷酸腺苷醯轉移酶的基因nadD或編碼NAD合酶的基因nadE的一種或兩種失活。但是，同時失活基因nadD或基因nadE可更完全地去除胞內NAD生物合成能力。埃希氏菌屬微生物基因失活可基於同源重組的原理進行(Nelson ed. ,Lehninger Principles of Biochemistry,4th Edition,2005, pp. 978991, Freeman Press)。依據同源重組臂間插入DNA序列的大小或同源重組臂所對應序列在基因組上位置的差異，所得工程菌株中靶基因對應的DNA片段可以被完全刪除或部分刪除、同時引入或不引入外源DNA序列。基於同源重組技術發展起來的Red重組系統操作簡單、準確率高，是基因失活的優選方法(Datsenko et al. ,Proc Natl Acad SciUSA,2000,97,6640)。本發明在首先將埃希氏菌屬微生物中導入了可自我複製並攜帶NAD轉運蛋白編碼基因的蛋白質表達載體的基礎上，進行NAD生物合成途徑阻斷改造。因此，本發明獲得的工程菌株具有NAD跨膜轉運能力，其生長嚴格依賴於從環境中獲取NAD(H)，即具有吡啶核苷酸輔酶營養缺陷型的表型。本發明所述埃希氏菌屬微生物是一類常見的兼性厭氧原核微生物，它們廣泛應用在生物技術的各個領域，包括蛋白質表達、基因克隆、生物基化學品生產、生物活性物質篩選等。其中MG1655，BW25113等多個菌株已完成全基因組測序。埃希氏菌屬微生物如大腸桿菌 BW25113(CGSC No. 7636)、MG1655 (CGSC No. 6300)、DH5 a (CGSC No. 12384)、W3110 (CGSCNo. 4474)和DHl (CGSC No. 6040)可從CGSC(美國耶魯大學大腸桿菌菌種保藏中心)獲得；BL21 (ATCC No. BAA-1025)和 JM109(ATCC No. 53323)可從ATCC(美國典型菌種保藏中心)獲得。以大腸桿菌 BW25113 為例，基因 nadE(NCBI Gene ID :945248)和基因 nadE(NCBI GeneID :946946)的DNA序列已知，可以準確地敲除或斷裂這兩個基因，阻斷其NAD生物合成途徑。由於埃希氏菌屬微生物基因序列同源很高，採用本發明的策略完全可以對其他菌株進行相同的基因工程改造。本發明構建了一系列埃希氏菌屬微生物基因工程菌株，它們均具有吡啶核苷酸輔酶營養缺陷型的表型，其中 E. coli YJE003 (CGMCC 4988)或 E. coli YJE004(CGMCC 4989)已由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏。本發明獲得的具有NAD營養缺陷型表型的埃希氏菌屬微生物，可在一系列生物技 術領域中應用。首先，通過改變培養環境中吡啶核苷酸輔酶的濃度，可在更大範圍內調控胞內吡啶核苷酸輔酶的濃度，為氧化還原代謝提供更強的動力，促進生物基化學品生產。由於本發明獲得的工程菌株的生長受NAD轉運能力的制約，當培養環境中存在其他物質影響NAD轉運過程時，工程菌株的生長也受到影響，利用該特徵可評估和篩選NAD轉運蛋白及相關生物化學過程的抑制劑，具有篩選新藥物(如抗衣原體感染)的應用價值。本發明獲得的工程菌株生長嚴格依賴於環境中NAD(H)的特點，還可作為非抗生素篩選平臺，用於基因克隆和蛋白質表達，用在抗體和醫藥用蛋白質製備領域。


圖I為NAD營養型缺陷型大腸桿菌菌株YJE003表型的實驗結果。取ImL菌體密度為IOVmL(OD600 = I)的細胞分別稀釋至10-1 10_6，取IOyL點到對應平板上。YJE003能在含有NAD或NADH的LB平板上生長，但不能在含有NAD生物合成的中間體煙醯胺單核苷酸(NMN)，煙酸(NA)平板上生長。說明￥邛003完全依賴於外源的應0 01)才能生長，是NAD (H)
營養型缺陷型菌株。圖2為AMP類似物6e和6i對大腸桿菌YJE003生長影響的實驗結果。在含NAD的M9培養基中，加入AMP類似物6e和6i,72h後YJE003菌體密度OD600分別為3. O和O. 40 ；而不添加AMP類似物時0D_達到3. I。同時，野生型菌株BW25113在含有AMP類似物6i的M9培養基中培養72h後菌體密度0D_也為3. I。說明應用YJE003可以方便地篩選發現對NAD跨膜轉運有抑制作用的活性化合物。圖3為大腸桿菌YJE003作為宿主提高甘油轉化為二羥丙酮效率的實驗結果。利用野生型菌株BW25113在不添加和添加NAD的條件下，二羥丙酮濃度分別為I. Og/L和7. Og/L ;而利用大腸桿菌YJE003作為宿主，在添加NAD的條件下二羥丙酮濃度達到14. lg/L。說明NAD營養型缺陷型菌株可用於提高生物轉化的效率。保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的菌株大腸埃希氏菌 E. coli Y JE003 (Escherichia coli YJE003)，保藏編號CGMCC 4988 ;保藏時間:2011年6月24日；保藏地點北京市朝陽區北辰西路I號院3號；
保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的大腸埃希氏菌E. coli YJE004(Escherichia coli YJE004)，保藏編號:CGMCC4989 ;保藏時間2011 年6月24日；保藏地點北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
具體實施例方式以下實施例有助於了解本專利，但不限定本發明所涉及的菌株、載體及基因材料。實施例I :(I)、將 Red 重組酶表達質粒 pKD46 (NCBI Accession No. AY048746)轉化到BW25113 中，獲得菌株 BW25113(pKD46)。 (2)、NAD轉運蛋白NTT4表達載體構建參照衣原體ntt4(NCBI GeneID :2780098)的序列，委託TaKaRa公司(中國大連)通過全基因合成技術合成ntt4基因。以該合成基因材料為模板，利用ntt4-F/ntt4-R引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)進行聚合酶鏈式反應克隆ntt4，將擴增產物和載體pET15b(Novagen，USA)進行NdeI和BamHII雙酶切，並利用T4連接酶進行連接，得到質粒 pET15b-NTT4。以 pET24b (Novagen，USA)為模板，kan-F/kan-R 為引物克隆卡那黴素抗性編碼基因kan。然後採用RF克隆(van den Ent F and Lowe J, JBiochem Biophys Methods, 2006,67,67)方法將kan替換氨節青黴素抗性編碼基因bla,得到載體pET15k-NTT4，轉化到大腸桿菌BW25113 (pKD46)中，得到菌株BW25113 (pKD46，pET15k-NTT4)。ntt4克隆引物(下劃線表示酶切位點)ntt4-F :5』 -GAGCATATGAGTAAAACAAACCAG-3』 (NdeI)ntt4-R :5』 -TACGGATCCTTATTTTTTTATAAAAG-3，(BamHI)·卡那黴素抗性編碼基因kan克隆引物kan-F :5』-TTAAACATGCCAGTGATGCAAAGGTAGTGCAAGAGCTATGACATATACCTGCCGTTCAC-3』kan-R :5』-TCAGGCGGTCAGTGTATCATCACTCATACTCTGCCCGACACCATGGTCATAGCTGTTTC-3』(3)、nadE敲除盒的構建以 nadE :cat_F/nadE :cat_R 從模板質粒 pKD3 (NCBI Accession No. AY048742)中通過PCR反應擴增帶有氯黴素抗性基因cat的敲除盒nadE :cat。敲除盒nadE cat構建引物nadE :cat_F :5』-CTGTTGTGCCATAAACCCCTGGCGGACGTATTTATCGACGGTTGATATGAtgggaattagccatggtcc-3』nadE :cat_R :5』-CGCATCATGCCCTCCGTAACGACAGGTATCAGCGATACAAGCCTTGTTGgtgtaggctggagctgcttc-3』(引物中大寫鹼基表示nadE基因外側同源重組序列，小寫部分為cat基因序列)。(4)、敲除盒轉化及篩選
將敲除片段nadE cat電轉化到BW25113 (pKD46，pET15k_NTT4)中，塗布於含有50 μ g/mL卡那黴素，25 μ g/mL氯黴素和500 μ M NAD的SOB平板(20g/L蛋白腖，5g/L酵母粉，0.5g/L NaCl, 2. 5mM KCl, ImM MgCl2, ImM MgSO4,15g/L 瓊脂)上，37C，培養 24 天。選取單菌落，於37C在以下平板上梯度稀釋培養，包括含有50 μ g/mL卡那黴素，25 μ g/mL氯黴素和500 μ M NAD 的 LB 平板(10g/L 蛋白腖，5g/L 酵母粉，10g/L NaCl，15g/L 瓊脂)、含有 50 μ g/mL卡那黴素，25 μ g/mL氯黴素和500 μ M NADH的LB平板、含有50 μ g/mL卡那黴素，25 μ g/mL氯黴素和500 μ M NMN的LB平板、含有50 μ g/mL卡那黴素，25 μ g/mL氯黴素和500 μ M煙酸(NA)的LB平板和含有50 μ g/mL卡那黴素和25 μ g/mL氯黴素的LB平板。實施例結果見圖I。發現得到的工程菌株可以在含有50 μ g/mL卡那黴素，25 μ g/mL氯黴素和500 μ M NAD的LB平板或含有50 μ g/mL卡那黴素，25 μ g/mL氯黴素和500 μ MNADH的LB平板上生長，但不能在其他3種平板上生長，說明構建的工程菌株具有NAD (H)營養缺陷型表型。 該菌株命名為大腸桿菌(E. coli)YJE003,已其由中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏，菌株保藏號為CGMCC 4988。實施例2(I)、nadD敲除盒的構建以 nadD :cat_F/nadD :cat_R 從模板質粒 pKD3 (NCBI Accession No. AY048742)中通過PCR反應擴增帶有氯黴素抗性基因cat的敲除盒nadD :cat。nadD :cat_F :5』-CGGGTTAGCTTTAAGGAAGTTTTGTCTTTTCTGTCTGGAGGGGTTCAatgggaattagccatggtcc-3』nadD :cat_R :5』-CTTTTTCGCACAATCCAATATGTGCAAATTATTACTTTTTCCAGAAATCATCgtgtaggctggagctgcttc-3』(引物中大寫鹼基表示nadD基因外側同源重組序列，小寫部分為cat基因序列)。(2)、敲除盒轉化及篩選將敲除片段nadE cat電轉化到實施例I構建好的BW25113 (pKD46，pET15k_NTT4)中，塗布於含有50 μ g/mL卡那黴素，25 μ g/mL氯黴素和500 μ M NAD的SOB平板上，37C，培養24天。選取單菌落，於37C在不同平板上梯度稀釋培養，發現所得工程菌株和Ε. coliYJE003具有相同的NAD(H)營養缺陷型表型。該菌株命名為大腸桿菌(E. coli)YJE004,已其由中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏，菌株保藏號為CGMCC 4989。實施例3 (I)、將 Red 重組酶表達質粒pKD46(NCBI Accession No. AY048746)轉化到MG1655中，獲得菌株MG1655 (pKD46)。(2)、NAD轉運蛋白ScNDTl表達載體構建以釀酒酵母S288C基因組DNA為模板，利用ScNDTl-F/ScNDTl-R引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)進行聚合酶鏈式反應克隆ScNDTl，將擴增產物和載體pET15b(Novagen，USA)進行NdeI和BamHI雙酶切，並利用T4連接酶進行連接，得到質粒 pET15b_ScNDTl。然後米用 RF 克隆(van den Ent F and Lowe J, J BiochemBiophys Methods, 2006,67,67)方法將卡那黴素抗性編碼基因kan替換氨節青黴素抗性編碼基因bla，得到載體pET15k-ScNDTl，轉化到大腸桿菌MG1655 (pKD46)中，得到菌株MG1655(pKD46, pET15k_ScNDTl)。ScNDTl克隆引物(下劃線表示酶切位點)ScNDTl-F 5 ~GAGCATATGACACAGACTGATAATCC~3 (NdeI)ScNDTl-R 5 -TACGGATCCTTAAATTACCATAGTGCTAATATT-3> (BamHI)(3)、敲除盒轉化及篩選 將實施例I構建的敲除盒nadE cat電轉化到MG1655 (pKD46，pET15k_ScNDTl)中，塗布於含有50 μ g/mL卡那黴素，25 μ g/mL氯黴素和500 μ M NAD的SOB平板上，37C，培養24天。選取單菌落，於37C在不同平板上梯度稀釋培養，發現所得工程菌株和Ε. coli YJE003具有相似的NAD(H)營養缺陷型表型，但其生長速度較慢。實施例3說明利用其他NAD轉運蛋白(ScNDTl)和不同埃希氏菌屬微生物菌種(MG1655)，按照本發明的方法，均可以獲得具有NAD營養缺陷型表型的工程菌株。實施例4 (I)、將 Red 重組酶表達質粒 pKD46 (NCBI Accession No. AY048746)轉化到 B121中，獲得菌株B121(pKD46)。(2)、NAD轉運蛋白AtNDT2表達載體構建參照擬南芥AtNDT2 (NCBI Gene ID :839124)的序列，委託TaKaRa公司(中國大連)通過全基因合成技術合成AtNDT2基因。以該合成基因材料為模板，利用AtNDT2-F/AtNDT2-R引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)進行聚合酶鏈式反應克隆AtNDT2，將擴增產物和載體pET15b (Novagen, USA)進行NdeI和BamHI雙酶切，並利用T4連接酶進行連接，得到質粒pET15b-AtNDT2。然後採用RF克隆(van den Ent F and Lowe J,JBiochem Biophys Methods, 2006,67,67)方法將卡那黴素抗性編碼基因kan替換氨節青黴素抗性編碼基因bla，得到載體pET15k-A tNDT2，轉化到大腸桿菌MG1655 (pKD46)中，得到菌株 MG1655 (pKD46, pET15k_AtNDT2)。AtNDT2克隆引物(下劃線表示酶切位點)AtNDT2~F 5 -GAGCATATGATTGAACATGGGAACTCTAC-3> (NdeI)AtNDT2~R 5 -TACGGATCCTTATTTGCTTCCAAGAGGGATATG-3> (BamHI)(3)、敲除盒轉化及篩選將實施例I構建的敲除盒nadE cat電轉化到MG1655 (pKD46，pET15k_AtNDT2)中，塗布於含有50 μ g/mL卡那黴素，25 μ g/mL氯黴素和500 μ M NAD的SOB平板上，37C，培養24天。選取單菌落，於37C在不同平板上梯度稀釋培養，發現所得工程菌株和Ε. coli YJE003具有相似的NAD (H)營養缺陷型表型，但其生長速度非常慢，原因可能是AtNDT2來源於擬南芥，在大腸桿菌活性不足。實施例4進一步說明利用其他NAD轉運蛋白(AtNDT2)和不同埃希氏菌屬微生物菌種(BL21)，按照本發明的方法，均可以獲得具有NAD營養缺陷型表型的工程菌株。實施例5
工程菌株E.coli YJE003在37°C，含有ΙΟΟμΜ NAD的LB液體培養基(10g/L蛋白腖，5g/L酵母粉，10g/L NaCl)中培養12h，收集細胞並用M9培養基(葡萄糖4. Og/L, Na2PO4 · 7H20 12. 8g/L, ΚΗ2Ρ043· Og/L, NaCl 0. 5g/L, NH4Cl I. Og/L, MgSO4 0. 24g/L,CaCl2O. Olg/L)洗滌 2 遍，接種到含 100 μ MAMP 類似物 6e 或 6i (Hou et al.，Bioorg MedChem Lett, 2011, 21,1667)和ΙΟΟμΜ NAD的LB液體培養基中，初始細胞光密度0D_ (細胞懸濁液在波長600nm處的吸收值，光路徑長度為Icm)為O. 04，72h後測定細胞光密度0D_。大腸桿菌BW25113在37°C，含有100 μ MNAD的 LB液體培養基中培養12h，收集細胞並用M9培養基洗滌2遍，接種到含100 μ M AMP類似物6i和100 μ MNAD的LB液體培養基中，初始細胞光密度0D_為0. 04，72h後測定細胞光密度OD6tltl值。實施例結果見圖2。發現在含NAD的M9培養基中，加入AMP類似物6e和6i，72h後YJE003菌體光密度OD600分別為3. O和O. 40 ;而不添加AMP類似物時OD600達到3. I。而野生型菌株BW25113在含有AMP類似物6i的M9培養基中培養72h後菌體密度0D_也為
3.I。表明AMP類似物6i對E. coliYJE003生長有抑制作用，而對BW25113沒有抑制作用。由於E. coli YJE003Y生長依賴NTT4轉運NAD，AMP類似物6i對E. coli YJE003生長有抑制作用說明，類似物6i對NAD轉運過程具有抑制作用。因此，NAD營養缺陷型菌株可以方便地發現對NAD跨膜轉運有抑制作用的活性化合物，用於建立抗衣原體的藥物活性篩選平臺。實施例6 (I)、催化甘油生成二羥丙酮菌株構建以大腸桿菌BW25113基因組DNA為模板，利用gldA-F/gldA-R引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)進行聚合酶鏈式反應克隆得到甘油脫氫酶基因 gldA(NCBI GeneID :948440);以 Enterococcus faecalis V583 基因組 DNA 為模板，利用 EfN0X-F/EfN0X-R 克隆得到 NADH 氧化酶基因 Efnox (NCBI GeneID :1200486)。隨後以 gldA-F/EfNOX-R 為引物、gldA 及 EfNOX 為模板，通過重疊延伸 PCR(Horton，R. M. et al,Gene, 1989, 77,61)獲得雙基因表達盒 gldA-Efnox。然後通過 RF 克隆(van den Ent F andLowe J, J Biochem Biophys Methods, 2006,67,67)將 gldA-Efnox 克隆到 pTrc99A (NCBIAccession No. U13872)載體的Trc啟動子後面獲得雙基因表達質粒pTr99A-gldA_efN0X。分別將質粒 pTr99A-gldA-efN0X 轉化到 E. coli BW25113 和 E. coli YJE003 中，得到菌株E.coli GNOl 和 E. coli GN03。雙基因gldA-Efnox表達載體構建引物gldA-F CAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGACCGCATTATTCAATCACgI dA-R GTGTATATCTCCTTCTCTAGTAGCGATCTATTATTCCCACTCTTGCAGGefN0X-F CTACTAGAGAAGGAGATATACACATGAAAGTCGTAGTCGTAGGe FNOX-R CAAAACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTACATATTTTCTAAAGCGGCTTG(2)、工程菌株GNOl和GN03細胞催化轉化甘油生成二羥丙酮E. coli GNOl在37°C，含有100 μ M NAD的LB液體培養基中培養12h，收集細胞並用M9培養基洗滌2遍，接種到含100 μ M NAD的LB液體培養基中，初始細胞光密度0D_為
0.04，培養至細胞光密度0D_為0. 40. 6，加0. 5mM異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導20h，收集細胞用IOOmM Na2HPO4緩衝液(pH 9. 4)清洗2遍，重懸於含有100 μ M NAD的IOOmM Na2HPO4緩衝液(pH 9.0)中，細胞密度為2g幹菌體(DCW)/L，加入30g/L甘油，37°C，200rpm反應3h,測定二輕丙酮濃度。以E.coli GN03為菌株材料，按照上述條件操作，測定二羥丙酮濃度。實施例結果見圖3。利用E. coli GN03在不添加和添加NAD的條件下，二羥丙酮濃度分別為I. Og/L和7. Og/L ;而利用E. coli GNOl在添加NAD的條件下二羥丙酮濃度達到14. lg/L。說明NAD營養型缺陷型菌株可用於提高生物轉化的效率。實施例6說明NAD營養缺陷型菌株R. coli YJE003可作為氧化還原催化體系的宿主，通過在培養基中增加輔因子供給，提高催化轉化效率。實施例7 (I)、催化丙酮酸生成D-乳酸菌株構建 以大腸桿菌BW25113基因組DNA為模板，利用ldhA_F/ldhA-R引物和PrimeSTAR HS DNA聚合酶(TaKaRa，中國大連)進行聚合酶鏈式反應，克隆得到D-乳酸脫氫酶基因 ldhA(NCBI GeneID :946315);以博伊丁假絲酵母 C.boidinii ATCC 46498 基因組DNA為模板，利用CbFDH-F/CbFDH-R克隆得到甲酸脫氫酶基因Cbfdh (NCBI AccessionNo. AF004096)。隨後以ldhA-F/CbFDH-R為引物、IdhA及CbFDH為模板，通過重疊延伸PCR(Horton et al.，Gene，1989，77，61)獲得雙基因表達盒 ldhA-fdh。然後通過 RF 克隆(van den Ent F and Lowe J, J Biochem Biophys Methods, 2006,67,67)將 ldhA-fdh 克隆到pTrc99A(NCBI Accession No. U13872)載體的Trc啟動子後面，獲得到雙表達質粒pTr99A-ldhA-fdh。分別將質粒pTr99A-ldhA-fdh轉化到E. coli YJE004和E. coli BW25113中，得到菌株 E.coli LFOl 和 E.coli LF03。IdhA-F CAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAACTCGCCGTTTATAGIdhA-R GTGTATATCTCCTTCTCTAGTAGCGATCTATTAAACCAGTTCGTTCGGcbFDH-F GATCGCTACTAGAGAAGGAGATATACACATGAAGATCGTTTTAGTCcbFDH-R AAAACAGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGTTATTTCTTATCGTGTTTAC(2)、工程菌株LFOl和LF03細胞催化轉化丙酮酸生成D-乳酸溶 E.coli LFOl在37°C，含有100 μ M NAD的LB液體培養基中培養12h，收集細胞並用M9培養基洗滌2遍，接種到含100 μ M NAD的LB液體培養基中，初始細胞光密度0D_為0. 04，培養至細胞光密度 OD600 為 O. 40. 6，加 O. 5mM IPTG 誘導 30h,收集細胞用 IOOmM Na2HPO4 緩衝液(pH 8. 0)清洗2遍，重懸於含有IOOmM Na2HPO4緩衝液(pH 8.0)中，細胞密度為以2. 5g DCW/L，加入一定濃度的丙酮酸鈉和一定濃度的NADH，370C，200rpm反應3h，測定乳酸濃度。以E.coli LF03為菌株材料，按照上述條件操作，測定乳酸濃度。實施例結果見表I。在不添加NADH的條件下，工程菌株LFOl和LF03催化反應的乳酸沒有明顯差別。但是，當反應體系中加入ΙΟΟμΜ NADH後，工程菌株LFOI比LF03取得了更高乳酸產率。並且，增加反應體系中NADH的濃度，可以促進乳酸生成。增加丙酮酸初始濃度，雖然乳酸產率下降，但乳酸濃度明顯提高。說明NAD營養型缺陷型菌株可用於提高生物轉化的效率。實施例7說明NAD營養缺陷型菌株Ε. coli YJE004也可作為氧化還原催化體系的宿主，通過增加輔因子供給，提高催化效率。表I :工程菌株LFOl和LF03轉化丙酮酸的實驗結果
權利要求
1.一種煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)營養缺陷型的埃希氏菌屬(Escherichia)微生物，其構建過程如下， 1)將一種表達NAD跨膜轉運蛋白編碼基因的可自我複製的載體導入埃希氏菌屬微生物細胞內； 2)採用基因敲除和/或基因斷裂的方法使埃希氏菌屬微生物基因組中編碼煙醯胺單核苷酸腺苷醯轉移酶的基因nadD、編碼NAD合酶的基因nadE中的一種或兩種失活。
2.按照權利要求I所述的微生物，其特徵在於所述NAD跨膜轉運蛋白編碼基因是衣原體的基因 ntt4(NCBI GeneID :2780098)、或酵母的基因 ScNDTl (NCBI GeneID :854811)、或酵母的 ScNDT2 (NCBI GeneID :856712)、或擬南芥的基因 AtNDTl (NCBI GeneID :819362)、或擬南芥的AtNDT2(NCBI GeneID :839124)、或它們的具有相似功能的突變基因。
3.按照權利要求I所述的微生物，其特徵在於其生長依賴於培養環境中存在的NAD或其還原態化合物NADH、或煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或其還原態化合物NADPH中的一種或多種組合。
4.按照權利要求1、2或3所述的微生物，其特徵在於該微生物為保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的菌株大腸埃希氏菌E. coli YJE003，保藏編號CGMCC 4988 ;保藏時間2011年6月24日；保藏地點北京市朝陽區北辰西路I號院3號； 或該微生物為保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)的大腸埃希氏菌E. coli YJE004，保藏編號CGMCC 4989 ;保藏時間2011年6月24日；保藏地點北京市朝陽區北辰西路I號院3號。
5.—種權利要求1、2、3或4所述微生物的應用,其特徵在於所述微生物生長培養時，通過在埃希氏菌屬微生物培養基中添加總濃度為O. 005mmo 1/L lOmmol/L的吡啶核苷酸輔酶，調控胞內吡啶核苷酸輔酶的濃度，改善細胞的代謝行為，進而獲得一種或多種埃希氏菌屬微生物代謝物產量。
6.—種權利要求1、2、3或4所述微生物的應用,其特徵在於所述微生物生長培養時，通過在埃希氏菌屬微生物培養基中添加終濃度分別為O. 005mmol/L IOmmoI/L的吡啶核苷酸輔酶和待篩選的化合物，通過觀測該微生物的生長速度變化，獲知被篩選的化合物對NAD跨膜轉運蛋白的抑制性能。
7.一種權利要求1、2、3或4所述微生物的應用，其特徵在於所述微生物通過下述方式之一，應用於蛋白質表達I)向所述微生物導入攜帶表達特定蛋白質編碼基因的可自我複製的載體，或，2)向所述微生物導入攜帶表達特定蛋白質編碼基因並且表達nadD基因或nadE基因的可自我複製的載體。
全文摘要
本發明公開了煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)營養缺陷型埃希氏菌屬(Escherichia)微生物的構建及其應用。通過向埃希氏菌屬微生物引入NAD轉運蛋白，並且阻斷胞內NAD生物合成途徑，構建出依賴於外源吡啶核苷酸輔酶生長的埃希氏菌屬工程菌。NAD營養缺陷型埃希氏菌可在生物技術領域用於篩選吡啶核苷酸輔酶代謝的抑制藥物、提高氧化還原生物轉化效率、建立基因克隆和蛋白質異源表達的非抗生素篩選平臺等。
文檔編號C12N15/70GK102925398SQ201110227540
公開日2013年2月13日 申請日期2011年8月9日 優先權日2011年8月9日
發明者趙宗保, 周雍進, 林心萍, 張素芳 申請人:中國科學院大連化學物理研究所