進行轉基因的方法

2023-04-24 19:36:16 2

專利名稱：進行轉基因的方法
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目前，在動物轉基因方面有幾種方法。前細胞核顯微注射是最先得到廣泛應用的方法。這個方法是在20世紀80年代早期通過老鼠實驗發展起來的，它需要把轉移基因DNA注射到單細胞胚胎的一個前體細胞核中。在這個方法的首次報導(Gordon,J.W.,Scangos,G.A.,Plotkin,D.J.,Barbosa,J.A.Ruddle,F.H.,Proceedings ofthe National Academy of Science USA 77,7380)中，在出生的78隻幼犬中只有兩隻帶有轉移DNA，轉基因效率不到3％(2/78)。隨著人們對這個方法的不斷改進，目前利用前細胞核顯微注射法在老鼠中進行轉基因的效率已增加到15％左右的通常的數值。然而，對於其它物種，如牛、綿羊、豬及山羊(具有商業價值的物種的例子)，相對應的轉基因的效率非常低(1％左右)。這可能反映了老鼠單細胞胚胎的獲得和處理與其它物種單細胞胚胎的獲得和處理的困難相比是相對容易的。同老鼠的單細胞的胚胎不同，當在標準光學顯微鏡下觀察這些具有商業價值物種的單細胞的胚胎時，看到的結果非常模糊(由於這些物種含有高水平的脂類內含物)。這對於前細胞核顯微注射來說是一重大的缺陷，因為該方法要求注射針被精確的注射到一個卵(前體細胞核)的一個特定的腔體中。前體細胞核必須被定位，因此它必須是可見的。在試圖解決這個問題的嘗試中引入了低速離心這個附加的步驟。
由於基因的整合位點及整合進宿主基因組基因拷貝數量的隨機性，利用前體細胞核顯微注射法進行轉基因還不能對轉移基因的插入結果進行控制和預測。通過利用胚胎幹細胞(通常是老鼠的，ES)可以對整合的結果進行較好的控制。這樣的胚胎幹細胞是通過具有靶基因組同源重組的結構進行轉染而得到的。被轉染的胚胎幹細胞可以在體外進行篩選、鑑定從而去確認那些結構上的整合位點。接下來，那些帶有如胚胎幹細胞靶基因的重組胚胎可以被用於產生嵌合後代(雜種後代)。這種基因改變的方法目前被限定到那些已建成的有利於生殖系胚胎幹細胞存在的老鼠身上，而在其它物種上還沒有可以被證實的應用。
由於修飾哺乳動物基因系方法的現有策略的限制，促使人們尋找可替代的方法。這些方法包括應用重組的逆轉錄酶病毒去感染卵母細胞預移植的胚胎、複製缺陷型的腺病毒所介導的轉移體系或者以精子作為在體外受精期間DNA轉移的載體。在最後的一種方法中，活的精子被用做在體外把重組DNA引入卵母細胞的一個載體。因為生物學上的現象很難被鑑定到，而且由於它的不可靠性而限定了它的應用。
以前曾經報導過下面的將細胞質內的精子注射(ICSI)進入處於細胞分裂中期Ⅱ老鼠卵母細胞的事件。精子的頭部，由於它們在注射時是不可移動的，曾被認為是「死的」，儘管如此，它們仍舊能支持精子充分發育。更重要的是，細胞膜被破壞的精子也能支持精子的充分發育。(Perry,A.C.F.,Wakayama,T. Yanagimachi,R.Biology of Reproduction 60,747)。在下面的精子的細胞膜的結構在整個生物學上是高度保留的。這種結構(主要是細胞核和細胞核周基質)的主要蛋白成分是帶有正電荷的鹼性蛋白質。這表示它們能支持如包括DNA和RNA這樣的核酸在內的多聚陰離子相互間靜電作用。這些特點已在一種新的轉基因方法的研究發展中被利用，而這種方法就是在此要敘述的。這種方法與現存的方法比較有明顯的優越性它可以高效率的產生轉基因後代；它可以用於各種不同物種的轉基因動物的生產；它的靈活性允許相對比較寬範圍不同類型的轉移基因和其它分子導入；它可以對非受精卵進行生物學上的操作；它支持轉基因中的一個分枝-所謂的基因靶向。利用基因靶向方法在一個完整的基因組中能夠進行特定位點的改變。該項發明的方法將在此後進行敘述。
該項發明的概況該發明提供了引入轉移基因(tg)核酸(NA)進入如動植物這樣生物體的細胞中，或通過注射轉移基因核酸進入體外培養的細胞中，或利用事先和細胞核混合好的轉移基因核酸共注射到一個未成熟的卵母細胞、一個未受精的卵母細胞或去核的卵母細胞(自此以後就稱為卵母細胞)中的方法。
在本發明的一個實施例中，那些未受精的卵母細胞在細胞減數分裂的中期Ⅱ階段被抑制了。中期Ⅱ的卵母細胞在該階段正常參加哺乳動物受精。本發明進一步提供了將轉移基因核酸(NA)引入一個含有殘餘細胞核成分細胞中的方法，隨後進行發育激活。
在這裡用的專業術語「轉基因核酸」(或「tg NA」)意圖包括任何可以被引入一個卵母細胞而誘導到此時為止仍為天然型的基因組的順序變化的核酸及其衍生物，這種變化改變了基因組。在一個實施例中，轉基因的核酸是脫氧核糖核酸即DNA。專業術語「細胞核」在此指的是整個核或對胚胎發育完全或進一步發育所必需的部分。在一個最佳實施例中，這個核是一個精子的細胞核。
該項發明進一步提供了通過轉移基因和細胞核共插入而產生轉基因動物的方法。例如，在這個方法中，通過混合在一起使這個細胞核接觸轉移基因核酸。在一個實施例中，細胞核是細胞膜已被去掉或破壞的精子的細胞核。該項發明允許使用各種各樣的破壞膜的方法。
在本發明的一個最佳實施例中，細胞核是通過顯微注射法或最好是採用壓電激活顯微注射法插入卵母細胞中。壓電激活顯微注射法(相對傳統的方法而言)促進了顯微注射的過程，使過程更加迅速。這樣就減少了細胞損傷，增加了胚胎的存活率。以這種方式重組的細胞使發育成為可能。在一個實施例中，發育產生了相當大數量的同基因型的細胞(例如幹細胞)。在進一步的實施例中，重組細胞可以在隨後的體外培養發育成一個胚囊。而且得到的胚胎在這時或胚胎發育前一個階段可以被轉移到一個合適的代理母親(受體母親)中以便進行充分的發育。
在此我們驗證了通過一個精子頭部和一個轉移基因DNA共插入的方法而產生活的轉基因後代的研究結果。我們驗證了不僅轉移基因存在於後代中，而且這些轉移基因在後代中進行了表達而改變了後代的特徵。在本發明的不同的最佳實施例中，我們證實細胞膜已經被破壞的精子頭部高效率地促進了轉基因。細胞膜的破壞可以用不同的方法獲得，這包括用清潔劑、凍融或冷凍乾燥法處理精子。精子頭部細胞膜的破壞足以表明了精子細胞適合應用在這種方法中。我們在這裡用精子的頭部，包括細胞膜受到損傷的精子的頭部，去證明該項發明的原理。在本發明的一個實施例中，細胞膜的損傷允許轉移基因DNA接近亞細胞核元素，這些亞細胞核元素包括但不限於核周基質(就精子而言)、核基質、染色質及基因組DNA。
在本發明的一個實施例中，轉移基因核酸是一個經編碼的易於檢測的表現型標記的線形的DNA片段。通過細胞核和DNA共插入得到的轉基因的胚胎和後代擁有了基因組的改變。這種基因組的改變可以以一種易於檢測的方式(表現型)改變它們的特性。可以適用的易於檢測的標記包括螢火蟲螢光素酶(Luc)、大腸桿菌β-半乳糖甘酶(LacZ)和Aequoria victoria的綠色螢光蛋白(GFP)。
最好是，在用一個微量移液器共注射之前進行轉移基因核酸和細胞核的混合。在另一個最佳實施例中，共注射進入一個在細胞減數分裂中期Ⅱ被抑制的胚胎。我們在這裡用的是編碼Aequoria victoria的綠色螢光蛋白(GFP)的DNA或大腸桿菌β-半乳糖甘酶的DNA(LacZ)，從而通過表明該發明的方法產生轉基因胚胎中的轉移基因序列以一個高的頻率被表達以證明本發明的原理。本發明的另一個實施例中，轉移基因核酸是和人工染色體，諸如哺乳動物、酵母及細菌的人工染色體是相對應的(分別是MAC、YAC、BAC:Schindelhauer,D.Bioessays21,76；Peterson,K.R.Method in Enzymology 306,186；Kim,U.J.,Birren,B.W.,Spleak,T.,Mancino,V.,Boysen,C.,Kang,H.L.,Simon,M.I., Shizuya,H.Genomics34,213)。在本發明的進一步實施例中，轉移基因核酸對應於核糖核酸(RNA)，例如信使RNA(mRNA)，或對應於RNA-DNA異源雙鏈(至少有一個錯配的嵌合體)，或對應於肽核酸。
因此，該發明通過一個核和轉移基因DNA共注射到一個未受精的卵母細胞中從而為產生轉基因後代提供了一種高效率的方法。本發明可以應用於所有的生物體和變異細胞及幹細胞的集合。而這些變異細胞及幹細胞可以或可能隨著一個細胞核插入到一個未受精的卵母細胞而產生。這些細胞核的來源沒有限制，它包括來源於兩棲動物、魚、鳥(諸如家雞、火雞、鵝等等)及哺乳動物，諸如靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、山羊、貓、犬、馬、鼠等等。在本發明的一個實施例中，細胞核來源於精子，同精子細胞核關係密切的一些屬性被保留了。(見Kimura,Y.,Yanagimachi,R.,Kuretake,S.,Bortkiewicz,H.,Perry,A.C.F Yanagimachi,HBiology ofReproducticn 58,1407)。
利用顯微注射法進行轉移基因DNA/細胞核物質的共同導入的方法和需要人工或通過在體外提高細胞融合方法有時空上的不同。(Lavitrano,M.,Camaioni,A.,Fazio,V.M.,Dolci,S.,Farace,M.G. Spadafora,C.Cell 57,717)。在一個實施例中，顯微注射法首先需進行細胞核(和核酸)的篩選，接下來它們的沉積物通過穿透卵母細胞的原生質膜而進入卵母細胞。
利用該項發明方法進行的轉移基因和細胞核的共注射不需要從活細胞中獲得細胞核。這進一步使該項發明的方法區別於那些認為活的精子和轉移基因DNA(在體內成體外)被混合，然後通過授精引入DNA例證解釋的方法。而且，根據該項發明的方法，轉移基因DNA和一個來源於膜被破壞細胞的細胞核的共同注入，允許可能對程序的結果有效的、受到精確地控制的試劑的共導入。這樣的試劑可以包括酶，抗體或藥理上信號轉導的抑制劑，它們可以通過調節重組或/和胚胎發育來促進轉基因，這些試劑可以在轉移基因DNA核酸和細胞核共導入胚胎之前、期間或之後導入胚胎。
圖2表明了轉基因的胚胎是通過single-shot double transgenesis(「單打二」轉基因)而產生的。用將pCX-LacZ和pCX-EGFP轉移基因混合進行預培養過的精子顯微微注射卵母細胞。如例3所示。圖中表明了用霍夫曼氏紫染色調整和未染色的顯微鏡觀察3.5天後到的同樣的胚胎(X400)情況的對比(A),(B)是在長波(480nm)紫外線下綠色螢光蛋白(GFP)的表達情況，而(C)是表示用X-gal染色後的β-半乳糖苷酶的表達情況。
圖3表示對來源於轉基因的建立者與非轉基因對照組的尾尖活體解剖分析。(A)為來自於非轉基因(X40)(a:#16老鼠)和轉基因綠色螢光種系(b；#3老鼠)的尾尖的綠色螢光顯微鏡檢查。通過非-綠色毛，綠色螢光的皮可以被觀察到。(B)為利用pCX-EGFP基因片段做探針，分別對對照B6D2F1(0),#3(5-9),#19(＞50),#28(5-9)和#41(2)做southem雜交分析總的DNA含量。(括號中數字為估計的轉移基因在每個基因組中的拷貝數)。(C)為利用聚合酶鏈式反式(PCR)對#16、#17、#30、#36、#47、#49、和對照B6D2F1,#3、#19、#28、#41進行分析的結果，見例5。
本發明的詳細說明進行轉基因的方法本發明描述了產生含有一個被整合的轉基因的細胞的一套獨特的方法。該項發明的方法包括以下步驟(Ⅰ)使外源基因-轉移基因核酸與細胞核成分接觸(細胞核，或其一部分，包括染色體)；(Ⅱ)顯微注射轉移基因核酸-細胞核的混合物或轉移基因核酸進入一個未受精的卵中；(Ⅲ)使得到的細胞發育。發育的結果可能產生變異細胞或幹細胞，之後形成胚胎、胚胎移植到受體母親身上產生一個個體。我們現在就更加詳細的描述每個步驟，而且表明這些步驟是如何獨到地被安排的。Ⅰ、外源轉移基因核酸暴露於細胞核成分該方法允許在顯微注射之前外源轉移基因核酸暴露於細胞核成分，細胞核可以來源於體細胞或其它的細胞，外源轉移基因核酸可以通過例證的方法，但不限於，如電穿孔、脂質轉染法，轉染法，混合或細胞核插入前的顯微注射法引導進入細胞，這些方法對熟悉這一領域的人來說是熟知的。
在本發明的一個實施例中，pCX-EGTP DNA片段(見例1或例2)在冰上或在25℃條件下和非轉基因的精子通過研磨混合30-180秒，而這些精子的細胞膜已通過清潔劑處理被破壞，這些清潔劑諸如Triton X-100、(3-[3-乙醇胺)二甲基氨)1-丙烷磺酸酯)(CHAPS)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、十二烷基硫酸鈉(SLS)、烷基三甲基胺溴化物(ATAB)，但也不僅限於此。本發明的進一步實施例中，精子的細胞膜是通過凍/融或冷凍乾燥方法破壞的。這些方法引使精子受到了充分的損傷而損失了一部分精子。細胞膜被破壞的程度按下列順序遞增新分離的精子＜TritonX-100＜反覆凍/融＜冷凍乾燥。
擴大了轉移基因核酸的選擇範圍是本發明的方法和以前方法相比的重大優越性的一個方面。轉移基因核酸，可以包括單鏈或雙鏈RNA或DNA，雜合異源雙源(例如RNA-DNA雜合體，見下面)和相對大的分子的物種，如染色體。在該項發明的一個實施例中，核酸可和大的DNA分子相對應(例如5萬個鹼基對至＞1百萬個鹼基對)。大DNA分子的例子包括象哺乳動物、酵母和細菌的人工染色體(分別為MACs,YACs和BACs)，但也不僅限於此。這樣大的分子對於損傷是敏感的(相對於小分子而言)，尤其是在顯微操作期間。因此，在該發明的一個實施例中，通過溫和地混合所給的細胞膜容易破壞的精子頭的步驟使大的DNA分子穩定，這主要基於以下幾點(ⅰ)允許這些大DNA分子和精子頭部的相對大的保護結構結合(ⅱ)在注射期間不讓它們受到化學或物理作用(如剪切力)的損傷，因此增加了成功的機率。
本發明的方法對於以往的方法的顯著優點的一個進一步的方面在於本發明提供了使得未受精卵母細胞細胞質(細胞分裂中期Ⅱ)的新的特性被利用的方法。尤其是，細胞核注入細胞分裂中期Ⅱ的卵母細胞後的細胞核的解凝提供了使基因組DNA相對裸露的情況；因此更具有活性(在Perry,A.C.F,Wakayama,T. Yanagimachi,RBiology of Repoduction 60,747(1999)中介紹)。而且，由於注射到細胞分裂中期Ⅱ卵母細胞中的精子被損壞或加熱到48℃引起重組產生雙中心的(即轉位的)、偏中心的或環形的染色體或染色體片段，便得細胞分裂中期Ⅱ的胚胎含有一些重組基因的因子，(Ward,W.S.,Perry,A.C.F., Balhom,R.Biology of Reproducton,已準備發表)。本發明的方法為通過同源重組和/或通過收集對DNA修復起作用的因子，就像在嵌合體的例子(見下面)提供了基因靶。在一實施例中，該項發明也考慮到通過在細胞核-核酸混合物中包含進具有位點特異性或非位點特異性可以提高重組效率的試劑來提供重組。這些試劑包括大腸桿菌的ReCA蛋白、相應的人類的ReCA蛋白、HsDmc-1、結合有如噬菌體T4基因32產物、位點特異性的重組酶(象Cre和Flp重組酶)的單鏈DNA結合蛋白等等，但不僅限於這些試劑。在進一步的實施例中，被用於基因靶DNA結構的核酸含有一個廣泛的序列，這個序列和基因組天然基因座一部分序列配對(常常是1)。基因靶載體設計的標準對於在熟悉此領域的人來說是能夠很好的設計及熟知的。
本發明在這裡介紹的方法還允許核酸(NA)和嵌合體是相匹配的。在一個實施例中，這些分子均是短的RNA-DNA異源雙源(＜100個核苷酸)，(例如，Yoon,k.,cole-strauss,A. Kmiec,E.B.Proceedings of the National Academy of SciencesUSA 93,2071)，除了1-3鹼基在中心附近錯配以外，這個異源雙鏈含有與基因組序列極其互補的序列。這樣的分子可以指導細胞DNA修復機器去將錯配(鹼基)引入基因組序列。在本發明的此實施例中，DNA修復機器在卵母細胞中，這樣在細胞核-嵌合體共注射進入細胞分裂中期Ⅱ的卵母細胞或在細胞核不存在的情況下，嵌合體被注射進卵母細胞的期間或隨後，位點特異性的突變就可以被引入。
該發明允許在混合期間包含進一些附加的物質。這可能包括核酸酶活性的調節劑(例如，[EDTA]乙二胺四乙酸、金紅三羧酸，限制性內切酶等等)，細胞程序死亡(例如金紅三羧酸等等)、蛋白水解(例如亮抑蛋白酶肽，E,64等等)、還有DNA結合蛋白諸如魚精蛋白和拓撲異構酶等，但不僅限於這些附加物質。在本發明的一個實施例中，輔加的試劑是在細胞核不存在情況下和轉移基因核酸混合在一起的，在這種情況下，通過把轉移基因核酸(tgNA)顯微注射進卵母細胞，而卵母細胞中細胞核的殘餘物提供了基因組，這就如一個去核的細胞分裂中期Ⅱ卵母細胞通過細胞核移植接受了一個體細胞的細胞核或一個非去核的細胞分裂中期Ⅱ的卵母細胞中的情況。這些細胞通過用孤雌生殖的試劑，人工激活進行發育，這些激活方法對於這個領域熟悉的人是熟知的(促植物細胞分裂素、封閉試劑，如細胞松馳素B、D等等)。
細胞核-核酸的混合物應被保持一段時間以便讓細胞核-核酸結合。在一個實施例中，這種結合至少30秒才會出現，然後混合物被轉移到顯微鏡平臺下進行顯微注射。在進一步的實施例中，顯微注射在細胞核暴露於核酸1個小時內被完成。Ⅱ．顯微注射轉移基因核酸(tg NA)-細胞核混和物或轉移基因核酸進入一個未受精的卵中。
那些和轉移基因核酸充分接觸的細胞核通過顯微注射法被插入一個未受精的卵母細胞中。細胞核-核酸混合物被轉移到顯微注射儀的顯微鏡平臺上成為一個小滴，這樣就可以被收集到用於顯微注射的針中進行注射。在一個實施例中，細胞核-核酸混合物被聚乙烯吡咯烷酮溶液補充去幫助操作。被注射的轉移基因-細胞核樣品的收集是用吸器吸進一個注射的吸管中。在本發明的一個最佳實施例中，顯微注射針頭是壓力激活式的。合適的壓電驅動器元件在Prime技術有限公司(Tsukuba,Ibaraki-ke，日本)和Eppendorf Scientific(紐約，美國)有售，可以根據賣方的指令進行使用。該元件能夠以一個高度可控和快速的方式傳遞壓電脈衝以推動顯微注射吸管管尖被吸附在一個很短的距離內(0.5μm)。強度和每兩次壓電及間隙(根據控制元件不同而變化，具有普遍性的強度數值為1-5，速度為1-16)被應用於推動管尖穿過卵母細胞的透明區(卵母細胞被來源於一個支持吸管的微抽吸裝置所固定)。吸管的管尖和卵母細胞原生質體細胞膜是上下相對放置的而且向前推動(朝著卵母細胞相對的面)直到卵母細胞原生質體細胞膜被深深陷入。一旦應用小量的(常用的是1個)壓電脈衝(通常強度1-4，速度1)，原生質體細胞膜就會被穿透，這樣就允許轉移基因核酸-細胞核或轉移基困核酸進入卵母細胞的細胞質。在一個實施例中，這個注射是用一個平齊末端硼矽化的玻璃針(典型的內在直徑為4.5-10um)，這個針在末端附近含有水銀。水銀增加了壓電激活針尖的動量及控制。另外的可選的顯微注射的修改方法可以被用於插入(tg NA)轉移基因核酸和/或細胞核，這包括在Yanagida(K.,Yanagimachi,R.,Perreault,S.D.and Kleinfeld,R.G.Biology ofProduction 44,44(1991)的描述中做為例證說明的那些傳統的吸管。
細胞核可以被注射進那些來源同一物種的卵母細胞中，或來源於不同物種的一個卵母細胞，而且，該說明的方法允許核酸注射或核酸-細胞核共注射進卵母細胞、去核卵母細胞或不成熟(如胚泡階段)卵母細胞，也包括在體外成熟的排卵前的卵母細胞。在體外的卵母細胞成熟(ⅣM)是所需要的，但成熟的卵母細胞源是受限的或不存在的，而且必須在某些試劑存在的情況下它們才更適合顯微注射。牛的卵母細胞ⅣM(卵母細胞的成熟)在WO98/07841中已被介紹過；老鼠卵母細胞的ⅣM(卵母細胞的成熟)在Eppig Telfer(Methods in Erzymology 225,77,Academicpress)中被介紹過。成熟的卵母細胞可以通過連續配給促性腺或其它類激素誘導超數排卵而得到。(例如，連續配給人的絨毛膜促性腺激素和孕馬血清促性腺激素)。接下來是象外科手術一樣收集卵。(例如貓在發情期開始後80-84小時，牛是72-96小時，而老鼠是13-15小時)。
該發明另外的一個實施例中，暴露於細胞核的核酸來源於二倍體體細胞，而且它被插入卵細胞的細胞質中，而這個卵母細胞的染色體己被除去(去核卵母細胞)；去核的卵母細胞方法對於熟悉這個領域的人是熟知的而且被利用，例如在Wakayama,T.,perry,A.C.F.,Johnson,k.,Zuccotti,M. Yanagimachi,R.Nature394,369(1998)中。細胞核是從通過如胰蛋白酶(0.025％)和乙二胺甲乙酸(EDTA；0.75mM)混合物處理過的被分散的細胞中得到收集的。細胞是在重組後0-6小時被人工刺激開始發育的，根據已知的方法，使用如Sr2+，乙醇或電子脈衝進行刺激，但又不僅限於此。本發明的方法適用於得自於兩棲動物、魚、鳥類(象家雞、火雞、鵝等等)和哺乳動物諸如靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、山羊、獵、犬、馬、鼠等等提取的或在體內或在體外生長的細胞核。
在本發明的進一步的實施例中，細胞核被包含如在膜易受到破壞的這樣的精子的頭部中，精子頭部的注射有效地激活了被注射的卵母細胞進行充分發育，直到發育完成。正在發育的胚胎通過對這個領域熟悉的人們熟知的程序，可以轉移到一個代理母親受體中進行發育。精子的頭部可以用加熱或能增強它激活卵母細胞的一種試劑進行處理，在這種情況下，顯微注射後卵母細胞對激活劑是敏感的而且易於誘導發育。精子可以來源於兩棲動物、魚、鳥類(像家雞、火雞、鵝等等)或哺乳動物諸如靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、山羊、豬、犬、馬、鼠等等。
本發明的方法也允許注射移管的管尖直徑在一個大的範圍內。以往的轉基因方法不允許一個大片段的DNA導入(例如，當用病毒載體時)或也可以允許這樣一個大片段的DNA導入，但都有著相當大的技術上的困難。例如前細胞核顯微注射法對於高粘度的人工染色體製備是不適用的。用製作精良的吸管(管尖直徑1-2μm)進行注射是困難的，而且DNA分子常常被剪切，導致失敗。而且這麼窄的管尖在用過幾次後會變得更粘稠，處理就會變得困難。相比之下，該發明的方法描述的所用移管的管尖通常的直徑＞5μm，相對大的管尖直徑(ⅰ)使得粘性DNA溶液的處理容易得多，部分原因在於那些針的粘性小了，(ⅱ)同時產生了較小量級的剪切力，大DNA分子對剪切力引起的損傷是敏感的。
該發明方法的進一步優點在於，它不要求那些物質注射進卵細胞中一個精確的位置，這點不同於前核顯微注射。這個優點尤其對於那些卵母細胞細胞質含有豐富的脂類而在光學顯微鏡下觀察起來不清楚的物種來源特別適用，如許多有商業價值的物種或品種的卵母細胞就屬於此種類型，因此該發明的方法不要求在顯微注射的管尖和在顯微注射期間所要精確地了解的卵母細胞的細胞質有空間上的關係。
該發明的方法也允許在沒有共注射細胞核的情況下進行轉基基因核酸的注射。在一個實施例中，轉移基因核酸首先和那些可以穩定核酸的成分混合，這些成分包括像來源於精子的鹼性蛋白這樣的成分(例如魚精蛋白，細胞核周圍的成分等等)。在這種情況下，注射是進入一個有細胞核的細胞。這樣的細胞已被細胞分裂中期Ⅱ卵母細胞(在這種情況下可用的胚胎是一個孤雌生殖的)或通過細胞核移植把體細胞的或其他的細胞的細胞核移進一個去核的細胞分裂中期Ⅱ的卵母細胞所例證解釋了。細胞核移植在Wakayama,T.,Perry,A.C.F.,Johnson,K.,Zuccotti,M.Yanagimachi,R.Nature 394,369(1998)中進行了介紹。在報告中，胚胎是通過無性繁殖而獲得。卵母細胞是根據已知的方法，用一些如Sr2+、乙醇或電脈衝這樣的刺激物進行人工刺激，而開始發育，但不僅限於這些方法。Ⅲ．允許得到的細胞進行發育經過顯微注射的細胞在體外重組移到一個適合的培養條件下或移到一個合適的代理母親體內，都能進行發育。在某些情況下，我們希望培養細胞去發育成一個胚胎。在該發明的進一步的實施例中，它可以檢查那些被培養在體外的胚胎，這樣這些胎胚的發育就可以被描述而且轉移基因的表達就可以被確定。因此，如果轉基因的胚胎中含有一個轉移基因，而這個轉移基因的表達在不殺死胚胎的情況下可以被檢測到，那麼，該發明的方法允許對轉基因胚胎進行選擇性轉移。這裡有一個GFP綠色螢光蛋白的例子，它的表達在早期的胚胎中被驅動的，也就是和CME-IE增強子/雞的肌動蛋白啟動子聯在一起。它的表達主要通過在長波(480nm)紫外燈下觀察胚胎就能很容易檢測到。最大程度的減小暴露於長波紫外線對胚胎的潛在損傷，因為這些損害可以損傷隨後的胚胎的發育。
胚胎培養及轉移的方法對於熟悉這一領域的人是熟知的。在隨後的選擇或非選擇的胚胎(也就是不一定是基於轉移基因的表達)轉移到代理母親體內後，開始受孕、一直到最後活的轉基因後代出生。轉移基因整合在後代的鑑定，主要是對基因組DNA進行物理分析來完成的，所用的方法是包括Southem雜交和聚合酶鏈式反應這樣的對於熟悉這一領域人來說的熟知方法。轉基因在後代中的表達可以做為一個特徵屬性(表型地)被辨別出來，或通過組織免疫分析或用相Northem雜交這樣的利用mRNA的分析方法。GFP綠色螢光蛋白在轉基因幼犬中的表達通過在長波紫外線下檢查新出生後代的皮毛很容易被看出來。例子下面的例子意在沒有限制該項發明的範圍的情況下例證說明該項發明的方法。試劑所用的化合物若無另外說明均購自Sigma化學有限公司(StLouis,MO)。動物卵母細胞捐贈者(B6D2F1)，精子捐贈者(B6D2F1)，代理母親(養母)飼養(ICR)是在夏威夷大學試驗動物服務部的指導下進行的。這些代理母親(養母)是由實驗資源國家研究委員會實驗動物愛護和應用學院的委員們準備的(DHEWpublication no.[NIH]80-23,1985年修訂，動物的處理程序得到了夏威夷大學動物愛護和應用委員會的審查和同意。卵母細胞的製備在腹膜內配給5IU人的絨毛膜促性腺激素(hCG)後14.5-16小時，就可以從孕馬血清引導的(5IU)、超數排卵的、4-10周齡的雌性B6D2F1老鼠的輸卵管中收集成熟的卵母細胞。累積的大量細胞可通過在CZB-H中(CZB緩衝液含有20mM HEPES,PH7.4；Chatot,C.L.,Lewis,J.L；Torres I. Ziomek,C.A.Biology ofReprochuction 42,432)進行立即處理，在室溫下放5-10分鐘分散，在CZB-H中含有0.1％(w/v)牛睪丸透明質酸酶(300U/mg,ICN Biochemicals,Costa Mesa,CA)。不積累的卵母細胞在(CZB-H)中洗四次而且被轉移到一滴在37℃,5％(v/v在空氣中)CO2中平衡的礦物油下的CZB中，(Squibb Sons,Princeton,NJ)。老鼠的卵和胚胎的操作精子頭的壓電激活顯微注射進入老鼠的卵曾在(Kimura Y. Yanagimachi,R.Biology of Reproduction 52,709(1995)中敘述過。注射通常在絨毛膜促性腺激素(hCG)配給後18-19小時被完成的。注射針針尖直徑通常是5μm。實驗用的溶液(通常含有單一精子頭)在少量水銀被排除進入實驗溶液液滴後被吸進吸管。這樣保證了在水銀邊界的前頭實驗溶液充滿了吸管，而且因此不需要進一步稀釋。每次顯微注射大約有1pl的相對應物被移進受精的卵質。被注射的卵母細胞在移到37℃,5％(v/v空氣中)CO2中平衡的礦物油下面的CZB之前，要在操作培養基(CZB-H)中保留大約2-10分鐘。在操作培養中保留適宜時候時，卵母細胞在注射後立即通過溫育進行人工激活，溫育在37℃,5％(v/v在空氣中)CO2平衡的礦物油下面的不含有Ca2+而含有6.7mM SrCl2的CZB中約45-60分鐘。此後，卵粗略地在新鮮CZB中衝洗一下，然後被移到新鮮的CZB中繼續溫育。胚胎在體外的培養是在CZB中，需要4天。雙細胞的胚胎(培養大約1天後)或桑椹胚/胚泡(培養2.5-3.5天後)被移植到假妊娠白化體的ICR/CD1老鼠輸卵管中，這隻老鼠在顯微注射的當晚和一隻輸精管切除的同一品系的雄性老鼠交配。這樣通過在體外操作而出生的老鼠就有黑色的眼睛和彩色的皮毛這樣的特徵了。
例1精子細胞核的製備和顯微注射如前所述，用於進行顯微注射的B6D2F1老鼠細胞分裂中期Ⅱ卵細胞的分離和培養是必要。精子是從成熟的B6D2F1雄性老鼠中被收集到400μl CZB培養基中。在0-1℃的細胞核分離培養中(成分為(NIM):125mM KCl,2.6mM NaCL,7.8mMNa2HPO4,1.4mM KH2PO4,3.0mM EDTA；PH7.45)利用triton X-100抽提進行精子的分離，要精確地切下兩條尾部的附睪。過濾那些處理過的精子懸浮液，定容到終體積為900μl。卵母細胞的壓電激活顯微注射和在37℃、5％(v/v空氣中)CO2中平衡的礦物油下面的CZB中胚胎的培養在別處已詳述過。對於顯微注射來說，精子頭部被吸進一個吸管，而那吸管和一個壓電驅動吸管的元件相連，而且每次注射一個精子進入卵母細胞。在注射後很快裂解的卵母細胞被丟掉。在適當的時候，通過一個單壓電脈衝作用到精子中段，精子產生了由尾部至頭部的移位。移位這個程序本身破壞了細胞膜，因此表示了在這裡所用的「新鮮的」精子和以往報導中通過體外授精獲得的能提高轉基因效率的活的精子的不同之處。我們估計每次注射大約有1pl的精子從吸管裡被轉移。
例2通過混合使精子的細胞核暴露於綠色螢光蛋白或β-半乳糖苷酶轉移核酸中轉基因胚胎的產生這裡用的是pCX-EGFP質粒的大的SalGⅠ-BamHⅠ片斷，它保留了GFP綠色螢光蛋白的基因，由一個強的CMV-IE/雞的肌動蛋白增強子-啟動子聯合驅動表達的。(Niwa,H.,Yamamura,K. Miyazaki,J.Gene 108,193)，但缺乏真核生物的複製區(Zhang,G.Vamessa,G. Kain,S.R.Biochemical and Biophysical ResearchCommunication 227,707；Takada,T.Iida,K.Awaji,T.Itoh,K.Takahashi,R.Shibui,A.Sugano,S. Tsujimoto,G.Nature Biotechnology 15,458)。精子的細胞核或者是沒有進行進一步製備(「新鮮的」)而和pCX-EGFP片斷混合，或者是它們進行了三個破壞細胞膜程序中的一個之後，才和pCX-EGFP混合的，這三個程序分別為反覆凍融(Wakayama,T.,Whittingham,D.G. Yanagimachi,R.Journal of Fertility andReproduction 112,11)、冷凍乾燥(Wakayama,T. Yanagimachi,R.NatureBiotechnology l6,639)或TritonX-100抽提。對於利用TritonX-100抽提來說，在冰上，100μl 0.5％(v/v在NIM,核酸分離培養基)Triton X-100被加到900μl在NIM(核酸分離培養基)中的精子懸浮液中(見例1)，通過研磨混合30秒。20,000g，離心1分鐘，細胞被沉澱成了小顆粒，2℃，在2μl冰預冷的NIM(核酸分離培養基)中充分重懸浮沉澱顆粒，2℃,20,000g下再重新沉澱2分鐘。這最終的沉澱顆粒在400μl,CZB或NIM中被重懸浮。在顯微注射前，用吸管把1μl的DNA片斷和9μl精子懸浮液(含有2-5×105個精子)在CZB或NIM中混合，使DNA片段的最終濃度為7ng/μl。 DNA/精子的混合物在室溫(大約25℃)或在冰上培育1分鐘。然後聚乙烯吡咯烷酮(PVP，平均分子量MR 360,000)溶液混合至PVP的最終濃度10％(v/v)左右，把它放在顯微鏡臺上進行顯微注射。所有的注射均是在精子-DNA混合1小時內或精子-Triton X-100的混合1小時內在室溫在CZB-H中被完成的。
顯微注射3-3.5天後，用帶FITC濾鏡(480nm)的紫外光源的落射螢光顯微鏡檢查胚胎中GFP綠色螢光蛋的表達情況。這樣就可以對非螢光的(非-GFP-表達的)，弱螢光的和強螢光胚胎及鑲嵌胚胎(含有螢光及非螢光的細胞)進行清晰的鑑定，相應地做出判斷記載。用於去例證解釋該發明方法的相似的實驗用了一個不同的轉移基因核酸。純化pxCANLacZ中含有LacZ的片段，通過SalGⅠ或XhoⅠ和SalGⅠ消化進行線性化，然後和精子分別以4.5和9ng/ul的濃度混合，像前文所述的那樣進行顯微注射。兩個LacZ(β-半乳酶苷酶基因)片段都得到相似的結果。pxCANLacZ xhoⅠ-SalGⅠ片段缺少一個真核生物的複製區。被pxCANLacZ所編碼的β-半乳糖苷酶含有一個細胞核定位信號。胚胎預處理3天後，在室溫下，在PBS(磷酸鹽緩衝液，PH7.6)中固定5分鐘，就可以進行pxCANLacZβ-半乳糖苷酶表達的鑑定了，其中PBS配方為1％(v/v)甲醛，0.2％(v/v)戊二醛，5mg/ml牛血清蛋白(BSA)。固定的胚胎在含有BSA(5mg/ml)的PBS緩衝液中被徹底清洗，接著在37℃，在含有5mg/mlBSA、4mM鐵氰化鉀、4mM亞鐵氰化鉀、2mM MgCl2和1mg/ml 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖(x-gal)的PBS中進行染色。胚胎可以通過光學顯微鏡進行檢查和判斷記載。
在下面表1中的結果表明了該發明的方法以高的效率產生了轉基因的胚胎，當pXC-EGTP DNA片段濃度是500pg/μl，但不是50pg/μl時，這個方法就可以產生可以觀察到的轉移基因表達的胚胎。這表明該方法對於相當於大約每次注射15-150這樣少的分子的平均DNA濃度是敏感的。
表一細胞分裂中期Ⅱ的卵母細胞和外源的編碼報告基因DNA及精子頭共顯微注射產生胚胎的體外培養及轉移基因的表達產生情況在三天時桑椹胚-胚泡和螢光(GFP)或染色的LacZ的總數片段+精子處理++卵母細胞數量 m-b(％)*-§ +/-§+*§pCX-EGFP 無(新鮮的) 162134(83)a10013 21apCX-EGFP Triton X-100270212(79)a7537 100bpCX-EGFP 凍融313155(50)b2831 96bpCX-EGFP 冷凍乾燥278154(55)b2023 111bpx-CANLacZ 凍融151110(73)a745 58bpx-CANLacZ 冷凍乾燥136106(78)a832 66bpCX-EGFP 衝洗過的153114(75)° 43 4 67°pCX-EGFP 未衝洗的11783(71)° 17 3 63°pCX-EGFP 凍融71 56(79) 56 00pCX-EGFP 凍融51 35(69) 35 00pCX-EGFP 單獨- 49 48(98) 48 00*表示在同一列中標有a、b的數值被比較時，它們有明顯差異(P＜0.05)，標有c的數值在同一列中無明顯差別。
+表示外源DNA片段pCX-EGFP-BamHI-SalGI或pxCANLacZ-SalGI,SalGI-XhoI,或XhoⅠ片段在DNA濃度為5-10ng/l時和精子頭部混合，除了最後的三行(見例X)，外源DNA都是在和精子樣品混合後注射的，如例2所述。
++精子如例1所述進行處理。清洗與沒清洗樣品的製備如例4所述完成，作為陰性對照，所有的實驗都包括一等分新鮮的適宜的精子的製備物和NIM或CZB單獨混合的混合物進行同一天的注射，沒有觀察到「錯誤的陽性」表達。連續的注射每對的間隔為30-90分鐘，精子頭製備採用如例X所述的凍融法(凍融精子事先和DNA混合好，進行同一天陽性對照共注射，在75％的胚胎中產生螢光的(卵)裂球。)。單獨轉移基因DNA的注射是在孤雌生殖激活後進行的，如例X所述。§轉移基因表達-陰性無表達；+陽性有表達；+/-,m-b含有+和-細胞(嵌合體)。
例3在一個操作中進行雙元基因GFP綠色螢光蛋白和β-半乳糖苷酶胚胎的製備(「single-shot double transgenesis」轉基因方法)如例1所示，單打二轉基因方法(single-shot double transgenesis)用於在單個顯微注射後產生共表達兩個轉移基因的胚胎及其隨後的改變。精子頭部用含有2.5ng/μl pCX-EGFP SalGI-BamHI片段和2.5ng/μl pCX-LacZ SalGI-PstI片段的DNA溶液共注射。pCX-LacZ是pCX-EGFP中EGFP基因被編碼β-半乳糖苷酶基因取代後的衍生物。在接下來的體外培養中，胚胎首先被記錄觀察GFP表達，然後是編碼β-半乳糖苷酶基因的表達，如例1、例2分別所述。對於攝影來說，在固定和染色去觀察LacZ表達之前，胚胎應該被固定在顯微鏡的承物玻璃片和蓋玻片之間，這樣所看到的圖象就表明了發育和GFP螢光蛋白的表達情況。
例4衝洗轉移基因核酸-細胞核混合物後，GFP綠色螢光蛋白轉移基因胚胎的產生在每次衝洗實驗中，精子懸浮液在和pCX-EGFP DNA混合和溫育1分鐘後立即被分成兩個5μl的等份。其中的一等份(衝洗過的精子)被充分混合好的用50μl冰預冷的新鮮的CZB或NIM進行稀釋和衝洗。然後，兩等份在2℃,20,000g的條件下離心形成沉澱顆粒2分鐘。被洗過的那份精子的等分試樣的上清液被小心除去，用5μl新鮮的CZB或NTM代替；第二等份的上清液被用於重新懸浮它自己的沉澱顆粒(這樣這個樣品沒有被衝洗)。表1中的結果明顯地表明在顯微注射之前細胞核和核酸在體外結合的能力。
例5GFP綠色螢光蛋白轉移基因幼犬的產生與證實，及它們轉基因特性的證實確定是否轉移基因DNA結構的基因整合，可以在活的後代中被證實。遭受到三種破壞細胞膜程序中的一種破壞了的精子的頭與pCX-EGFP DNA一起被共注射，得到的胚胎在體外被培養達到大約3.5天(達到桑椹胚-胚泡時期)，胚胎接著被移植到非選擇性的代理母親上(即不基於螢光表達)。對於轉移基因整合的表型分析是通過在長波紫外線下對後代觀察而進行的。有很大部分(17-21％)的後代是轉基因的，因為在它們的皮膚上有可觀察的GFP綠色螢光蛋白的表達(下面表2)；這個效率並不取決於用於製備精子時細胞膜破壞的方法。合子發育完成的百分率和其它三組細胞膜破壞的精子的頭的每一個(12-14％)是可比較的。
表二表型上轉基因的(綠色)幼犬及它們同胞的發育精子處理*卵母細胞數量 轉化的幼犬的總數+(綠色)幼犬§冷凍乾燥116 67(4) 14 3a凍融97 53(3) 12 2a冷凍乾燥218 150(9) 31 6a*每排記錄了從去膜的精子的頭和一個pCX-EGFP質粒片段共注射的卵母細胞中產生的胚胎及幼犬的發育。
a表示數值無顯著差異。
桑椹胚-胚泡。在括號裡的數值表示在胚胎轉移中作為一個受體的代理母親的數量。
§Tg表達，+，在它們的皮上異位地表達GFP基因的陽性幼犬。
在進一步的實驗中，一個去膜的精子頭，根據例2的方法被暴露於pCX-LacZ(見例3)進行顯微注射，之後出生了一個單β-半乳糖甘酶(LacZ)表達的幼犬。根據例2的方法，β-半乳糖甘酶(LacZ)的表達可以通過固定和X-gal染色一個尾尖的活組織進行證實(出生後3天獲得)。這就證明了該發明的方法並不限定於一個轉移基因的類型，而且表明了該方法對各種轉移基因的應用能力。
從3-6周齡的隨機挑選的綠色的幼犬和它們的非綠色的同一窩的幼犬的尾尖的活體組織中進行基因組總DNA的提取。尾部的照相是在一個配有480/40nm濾光鏡的螢光立體顯微鏡下進行的。在Southem分析中，每一個樣品中10μg基因組DNA用EcoRⅠ消化後和用EcoRⅠ消化的733bp的pCX-EGFP片段探針雜交。寡聚核甘酸引物用於在每個反應裡和1μg基因組DNA進行PCR反應，以檢測GFP基因，正反應的引物為TTGAATTCGCCACCATGGTGAGC，反向引物為TTGAATTCTACTTGTACAGCTCGTCC。反應參數為95℃、9分鐘(一個循環)；94℃、45秒、60℃、30秒、72℃、45秒(40個循環)。電泳分離的產物通過EB(溴乙錠)染色可以觀察到。
通過Southem雜交及PCR(聚合酶鏈式反應)對尾尖基因組的物理分析表明，所有的顯示綠色螢光的建立者品系(也就是第一代轉基因動物)，都擁有轉移基因，包括一個最初表型鑑定為陰性的，但它的活組織尾尖檢查表明有GFP表達。在三種情況下，轉移基因應通過PCR進行鑑定，因為建立者中沒有可檢測到的綠色螢光，即由於在轉移基因整合的基因座上存在著局部地順式活性的元件，導致沒有見到推測中的表達。Southem分析表明轉移基因在建立者中的拷貝數範圍從≤1-＞50；這個結果同前細胞核顯微注射後轉移基因整合的模式是相類似的。基因組的pCX-EGFP DNA物理特徵的記述和GFP表達的效率均表明了轉移基因DNA並沒有在整合時進行大範圍的重排。
隨機挑選12隻表達GFP的建立者(8隻雌性，4隻雄性；來源於表2且相似的系列)和非轉基因的動物進行雜交。除了一隻雌的外，其餘的均產生了後代。在這11隻產生後代的建立者中，有8隻產生的幼犬在它們的皮膚上有GFP綠色螢光蛋白的異位表達，比率是27-50％(平均為40％)。。在大多數情況下，轉移基因的遺傳模式符合單位點GFP基因的孟德爾種系遺傳傳遞。
例6用Cre-lox系統檢測轉基因由於沒有必要對轉基因個體一生中連續的轉移基因進行表達，我們希望評價通過該發明的方法產生的用於轉移基因整合的胚胎。這可以用一個含有內部核糖體進入位點的(IRES)轉移基因的載體來實現。通過顯微注射產生胚胎的方法，如例1所述。DNA的結構包含有GFP基因，它位於lox位點側面，被一個強的CMV-IE/雞的肌動蛋白增強子-啟動子聯合驅動表達，如例2所述。這個增強子-啟動子和足以驅動任何一給定轉移基因的程序化表達的第二個元件相鄰。GFP開放讀取框架和一個特定的轉移基因的開放讀取框架相鄰，中間被一個IRES(內部核糖體進入位點)所分開。轉移基因DNA構造和一個去膜的精子混合併共注射進入細胞分裂中期Ⅱ的卵母細胞中，這個卵母細胞來源於如goosrcoid基因啟動子控制下的表達重組酶Cre的株系，這個啟動子在發育的原腸(胚)形成階段起作用，因此就會在此階段期間切除CMV-IE/雞的肌動蛋白增強子-啟動子元件。胚胎在體外培養達到3.5天(到桑椹胚-胚泡期)被選擇地移植到代理母親體內(也就是有螢光的)充分發育。
例7在沒有精子細胞核的情況下轉移基因DNA的顯微注射表明精子的細胞核成分以重組基因的形式維持轉移基因DNA為了檢測是否核酸整合會出現在卵母細胞內(也就是顯微注射後)，我們連續注射了精子的頭和pCX-EGFP DNA，但沒有在注射前混合(表1)。我們始終不能觀察到外源轉移基因DNA(GFP)的表達，即使在75％陽性對照的胚胎是有螢光的(凍融精子的頭和pCX-EGFP同表1一樣共注射)。
質粒pCX-EGFP的SalGⅠ-BamHⅠ片段的新鮮稀釋物和等量的20％PVP(w/v)混合，而且每個注射的卵母細胞大約為1pl。在室溫下恢復5-10分鐘後，卵母細胞被轉到不含有Ca2+的CZB中，在CZB中含有10mM SrCl2和胞質分裂封閉劑，細胞鬆弛素B(5μg/ml),37℃溫育6小時。(Bos-Mikich,A.,Whittingham,D.GJones,K.T.Developmental Biology 182,172)。它們接著被移到CZB中，在標準的胚胎的培養的條件下繼續培育。如例2所述，3.5天以後，胚胎就可以判定有無GFP的表達。與用精子的頭共注射的比較，單單是等量的GFP轉移基因注射不妨礙孤雌生殖的良好發育(在注射後存活的卵母細胞有98％發育到桑椹胚一胚泡階段)。而且，這些有結果的胚胎中沒有一個顯示出可觀察到的轉移基因的表達(表1)。因此，在沒有精子的頭的情況下，幾乎沒有轉移基因的表達或轉錄活性轉移基因DNA的表位染色體的持續存在。
在精子的頭-pCX-EGFP共注射後，而不是pCX-EGFP DNA單獨注射後，我們觀察到了含有陽性GFP和陰性GFP的裂殖細胞(+/-桑椹胚一胚泡)的嵌合的胚胎。這樣的+/-嵌合體的頻率表明DNA的整合有時被延遲直到注射後第一次S-期轉移基因才進行整合。這種現象的一個解釋是，來源於精子的物質在早期的胚胎中穩定了外源DNA，因此有利於延遲整合。在缺乏這樣物質的情況下(例如，在孤雌生殖中)，外源基因DNA在整合之前就被降解掉了。
權利要求
1．一種生產轉基因細胞的方法，包含以下步驟(a)暴露細胞的細胞核於核酸(NA)；(b)收集被暴露過的細胞核；(c)暴露的細胞核至少有一部分被插入一個卵母細胞，這一部分包括被暴露的細胞核的染色體，還至少包括核酸的一部分；(d)允許卵母細胞的發育。
2．一種生產轉基因細胞的方法，包含以下步驟(a)暴露一個細胞核於核酸(NA)；(b)收集步驟(a)中被暴露的細胞核；(c)被暴露的細胞核至少有一部分插入去核的卵母細胞，這一部分包括被暴露的細胞核的染色體，還包括至少核酸的一部分；(d)允許卵母細胞的發育。
3．在權利要求1或2的方法中，細胞核是從一個完整生物體細胞中提取出來的
4．在權利要求1或2的方法中，細胞核是從一個胚胎中提取出來的。
5．在權利要求1或2的方法中，細胞核是從一個胎兒細胞中提取出來的。
6．在前述的權利要求的任何一個的方法中，細胞核是從哺乳動物細胞中提取出來的。
7．在前述的權利要求的任何一個的方法中，細胞核是採用顯微注射的吸管收集的。
8．在前述的權利要求的任何一個的方法中，細胞核通過和核酸及含有細胞核的全部或部分細胞混合而暴露於核酸。
9．在前述的權利要求的任何一個的方法中，細胞核通過引導核酸進入一個完整的細胞而暴露於核酸的。
10．在前述的權利要求的任何一個的方法中，細胞核是從一個體細胞中提取的。
11．在前述權利要求1至9的任何一個的方法中，細胞核是配子前體中的。
12．在前述權利要求1至9的任何一個的方法中，細胞核是配子中的。
13．在權利要求12的方法中，配子包含一個卵母細胞。
14．在權利要求12的方法中，配子包含一個精子。
15．一種生產轉基因細胞的方法包含以下步驟(a)暴露一個精子於核酸(NA)；(b)收集被暴露的精子，(c)把至少精子的一部分，包括精子的染色體和進一步包括至少核酸的一部分插入到一個卵母細胞中；(d)允許卵母細胞發育。
16．在權利要求14或15的方法中，精子的細胞膜已被破壞。
17．在權利要求16的方法中，破壞的方法包括冷凍。
18．在權利要求16的方法中，破壞的方法包括機械破壞。
19．在權利要求16或17的方法中，破壞的方法包括暴露於清潔劑中。
20．在權利要求19的方法中，清潔劑是非離子型的。
21．在權利要求19的方法中，清潔劑是離子型的。
22．在權利要求19的方法中，清潔劑是TritonX-100。
23．在權利要求14至22的任何一個的方法中，精子通過引導核酸進入含有細胞核的精子的部分或全部而暴露於核酸(NA)。
24．在權利要求14至23的任何一個的方法中，精子通過核酸和含有細胞核的精子的部分或全部混合而暴露於核酸(NA)。
25．在權利要求14至24的任何一個方法中，精子是哺乳動物的精子。
26．在權利要求6或25的方法中，哺乳動物是由包括靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、山羊、貓、犬、馬和鼠的集合中的一個。
27．在權利要求9或23的方法中，引導的步驟可以是通過諸如脂質轉染、顯微注射、電穿孔及轉染這樣的方法而實現。
28．在權利要求9或23的方法中，引導的步驟可以是通過混合而實現。
29．在權利要求28的方法中，混合用的是一個吸管的管尖。
30．一種生產轉基因細胞的方法，包含以下步驟(a)插入核酸進入一個卵母細胞；(b)激活胚胎的發育；(c)允許重組的胚胎發育。
31．在前述的權利要求的任何一個的方法中，核酸(NA)是脫氧核糖核酸(DNA)。
32．在權利要求31的方法中，DNA含有雙鏈成分。
33．在權利要求31至32的任何一個的方法中，DNA是環形的。
34．在權利要求31至33的任何一個的方法中，DNA是線形的。
35．在權利要求31至34的任何一個的方法中，DNA含有一個報告基因。
36．在權利要求35的方法中，報告基因編碼一個綠色螢光蛋白(GFP)。
37．在權利要求35至36的任何一個的方法中，編碼報告基因DNA的表達是被在胚胎早期起作用的一個啟動子元件驅動的。
38．在權利要求35至37的任何一個的方法中，報告基因被定位在含有一個內部核糖體結合位點的載體上(IRES)。
39．在權利要求38方法中，內部核糖體進入位點(IRES)載體包含一個亞克隆編碼序列。
40．在權利要求35至39的任何一個的方法中，報告基因包括已經提過的在lox位點側翼的哪個啟動子元件。
41．在權利要求40的任一個方法中，lox位點側翼的那個啟動子元件和一個組織特異性的啟動子相連。
42．在權利要求32至41的任何一個的方法中，DNA是具有和天然互補基因組序列同源重組能力的靶結構。
43．在權利要求42的方法中，靶結構含有相對天然基因組序列的一個或更多的改變。
44．在權利要求32至43的任何一個的方法中，DNA是一個染色體。
45．在權利要求44的方法中，染色體是一個人工染色體。
46．在權利要求45的方法中，人工染色體是一個細菌的人工染色體(BAC)。
47．在權利要求45的方法中，人工染色體是一個酵母的人工染色體(YAC)。
48．在權利要求45的方法中，人工染色體是一個哺乳動物的人工染色體(MAC)。
49．在權利要求32至48的任何一個的方法中，DNA含有一個單鏈的成分。
50．在權利要求32至49的任何一個的方法中，DNA已被共價修飾過。
51．在權利要求50的方法中，DNA被共價修飾而包含一個肽部分。
52．在權利要求1至31的任何一個的方法中，核酸是核糖核酸(RNA)。
53．在權利要求52的方法中，核糖核酸RNA含有一個雙鏈成分。
54．在權利要求52的方法中，核糖核酸RNA含有一個單鏈成分。
55．在權利要求52至54的任何一個的方法中，核糖核酸RNA是環形的。
56．在權利要求52至54的任何一個的方法中，核糖核酸RNA是線形的。
57．在權利要求52至56的任何一個的方法中，核糖核酸RNA是被共價修飾過的。
58．在權利要求57的方法中，核糖核酸RNA是被共價修飾過含有一個肽部分。
59．在權利要求1至31的任何一個的方法中，核酸(NA)是嵌合的。
60．在權利要求59的方法中，嵌合體含有DNA-RNA異源雙鏈。
61．在權利要求60的方法中，嵌合的DNA-RNA異源雙鏈是包含至少一個錯配鹼基的嵌合體。
62．在前述權利要求的任何一個的方法中，核酸(NA)包括事先沒有共價連接過的多個分子的物種。
63．在前述權利要求的任何一個的方法中，對於核酸(NA)暴露至少30秒鐘。
64．在前述權利要求的任何一個的方法中，核酸(NA)在0-100℃條件下暴露的。
65．在前述權利要求的任何一個的方法中，核酸(NA)在冰上暴露的。
66．在前述權利要求的任何一個的方法中，核酸(NA)在核酸結合蛋白存在的條件下暴露的。
67．在權利要求66的方法中，核酸(NA)結合蛋白提高重組。
68．在權利要求67的方法中，可以提高重組的蛋白質是從下列的組成位點特異性的重組酶、單鏈DNA結合蛋白、RNA結合蛋白、反轉錄酶、拓撲異構酶、核酸內切酶及提高同源重組的重組酶的組成成分中提取出來的。
69．在前述權利要求的任何一個的方法中，插入步驟是進入卵母細胞的細胞質中。
70．在前述權利要求的任何一個的方法中，插入步驟是通過顯微注射完成的。
71．在權利要求70的方法中，顯微注射是壓電激活顯微注射。
72．在前述權利要求的任何一個的方法中，卵母細胞是在減數分裂中期Ⅱ(metⅡ)被抑制的。
73．在權利要求72的方法中，細胞分裂中期Ⅱ的卵母細胞在排卵後被收集的。
74．在權利要求73的方法中，排卵是通過人工進行誘導的。
75．在前述權利要求的任何一個的方法中，卵母細胞是成熟的。
76．在權利要求75的方法中，未成熟的卵母細胞是在體外培養的。
77．在權利要求75或76的方法中，在體外培養的未成熟的卵母細胞產生了細胞分裂中期Ⅱ的卵母細胞。
78．在前述權利要求的任何一個的方法中，還包括在插入步驟期間或之後引起卵母細胞活化的步驟。
79．在權利要求76的方法中，卵母細胞通過應用一個或多個電脈衝或暴露於一個激活劑中而活化的。
80．在前述權利要求的任何一個的方法中，進一步包括以下步驟(e)、允許卵母細胞發育形成幹細胞。
81．在前述權利要求的任何一個的方法中，進一步包括以下步驟(f)、允許卵母細胞發育形成分化細胞。
82．在權利要求81的方法中，進一步包括以下步驟(g)、允許卵母細胞發育形成胚胎。
83．在權利要求82的方法中，進一步包括以下步驟(h)、允許胚胎發育直至最後發育完成。
84．在權利要求83的方法中，允許胚胎發育直至最後發育完成的步驟包括轉移那個胚胎到一個雌性的代理受體上，在那裡，胚胎發育成一個能存活的胎兒。
85．通過前述權利要求的方法生產的許多轉基因細胞。
86．通過前述權利要求的方法生產一種轉基因動物。
87．在權利要求86中，動物指的是一個哺乳動物。
88．在權利要求87中，動物是從由包括靈長類動物、綿羊、牛、豬、熊、山羊、貓、犬、馬和老鼠等等組成的哺乳動物的集合中選擇出來的。
89．在權利要求87中，哺乳動物是老鼠。
90．通過權利要求1至84的任何一個的方法生產轉基因動物，在此，轉基因動物含有一個位點特異性的基因組的改變。
全文摘要
本發明通過把核酸和一個細胞核共注射進一個未受精的卵母細胞而提供了一種產生轉基因動物和細胞的方法。尤其是一種通過顯微注射進行共注射的方法，最好是一種通過壓電激活顯微注射進行共整合的轉基因方法。隨著一個未受精的老鼠的卵母細胞與一個精子的頭及一個編碼外源DNA的綠色螢光蛋白(GFP)或β－半乳糖甘酶的報告基因的共注射，轉移基因表達的胚胎就產生了。經過顯微注射處理的卵母細胞可以發育成分化細胞或幹細胞；或在移植到一個代理母親的受體之前，在生物體外發育成一個胚胎；或它直接被移植到一個代理母親受體中。胚胎的發育可以發生至完成，這樣它們的後代就擁有可以改變它們特性(表型)的轉基因改變，接下來，這樣的基因改變就可以傳遞給它們的後代。
文檔編號A01K67/027GK1316878SQ99810645
公開日2001年10月10日 申請日期1999年8月11日 優先權日1998年8月11日
發明者安東尼C·F·佩裡, 若山輝彥 申請人:安東尼C·F·佩裡, 若山輝彥