大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法
2023-04-24 13:47:26 2
專利名稱：大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法
技術領域：
本發明屬於精細化工和醫藥領域。涉及分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，具體為大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法。
背景技術：
目前從鴨膽汁中分離鵝去氧膽酸的方法，集中於溶劑萃取法，沉澱法、和離子交換樹脂法，分離エ藝繁雜，收率低，純度低。相關文獻有劉雁紅、胡祥正發表的「鴨膽膏中鵝去氧膽酸的提取エ藝」，天津科技大學學報2009 年 06 期; 2006年05月24日中國專利CN1775798公開的「ー種從禽畜膽汁中生產高純度鵝去氧膽酸的方法」。該方法包括如下步驟a.皂化反應將禽畜膽汁與氫氧化鈉溶液按一定比例及溫度下進行皂化反應，反應時間為20-30小時；b.中和反應皂化反應結束後加入稀鹽酸調節至酸性，然後過濾得到粗膽酸；c.柱層析將粗膽酸用稀氫氧化鈉溶液調至鹼性，打入層析柱中，用鹼性溶液洗脫，合併經薄層層析檢測為單純的鵝去氧膽酸斑點的洗脫液；d.超濾用截留分子量為3K-100K的超濾膜超濾；e.超濾液用稀酸調至酸性，過濾，烘乾，得純度為96%以上的鵝去氧膽酸。本發明生產エ藝簡單、產品純度高、成本低、綠色環保。2008年03月19日中國專利CN101143886公開的「禽類膽汁中鵝去氧膽酸的非有機溶劑提取法」。包括如下步驟a.皂化反應將禽膽汁與氫氧化鈉按一定比例煮沸進行皂化，皂化時間20-24小時；b.中和反應皂化液用鹽酸中和及調節PH2-4，沉澱得總膽汁酸；c.鈣鹽沉澱將總膽汁酸加氫氧鈉溶液溶解，加活性炭，回流，過濾，濾液加10% -14%的氯化鈣，得鈣鹽沉澱物；d.脫鈣鈣鹽按比例加入碳酸鈉10% -15%，加熱回流1-3小時，濾液用5% -10%的鹽酸液調節pH2. 0-3. 5得沉澱；e.收集沉澱物，真空乾燥，得鵝去氧膽酸粗品O2011年01月19日中國專利CN101948496A公開的「ー種從家禽膽汁中提取鵝去氧酸的方法」。從新鮮或冷凍家禽膽汁中，利用皂化反應，得到粗膽汁酸或粗膽汁酸鈣鹽，再將粗膽汁酸酷溶液與有機含氮化合物A水溶液共熱，利用有機含氮化合物A來除去粗膽汁酸中的大部份親水性雜質，得到的粗膽汁酸酷溶液與有機含氮化合物B反應，析出沉澱，過濾，並進行脫色、精製等步驟後，可得純度95%左右的鵝去氧膽酸。本發明具有操作簡便，生產設備通用性高，所用化學物質低毒的特點；適用於鵝去氧膽酸的エ業化生產。
發明內容
為了克服現有技術的不足，本發明提供了大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法。本發明解決其技術問題的基本思路是依據膽汁酸在動物體內屬於腸肝循環的原理，取動物迴腸內容物及大腸內容物來培養提取其中的微生物，進而用大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸。
本發明解決其技術問題所採用的技術方案是ー種大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，其特徵在於該エ藝分為兩步第一步為微生物溶液製作取動物迴腸及大腸，刮出迴腸和大腸中的內容物；在刮出的內容物中，添加內容物體積O. 5-10倍的水稀釋混勻，過濾除掉固體雜質，得到濾液；按濾液體積加入O. 1-0. 5倍的MRS培養基，保持溫度在35_42°C，培養24_72小吋，
得培養液；用離心機分離培養液，得到沉澱物； 加沉澱物重量1-100倍的無菌生理鹽水混懸，得到能水解結合型膽汁酸的微生物溶液；常溫保存微生物溶液，備用；第二步為大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸取鴨膽汁，按膽汁量體積添加微生物溶液O. 5ml-6ml/L混合均勻，得混合液；混合液在25°C _42°C溫度條件下，反應24-72小時，得游離型膽汁酸溶液中間體；從中間體中過濾出溼游離型膽汁酸；按游離型膽汁酸溼重添加5-20倍水稀釋成稀釋液，並用碳酸鈉或氫氧化鈉調稀釋液PH值至8-10 ；按稀釋液重量的O. 1-0. 2倍加入水飽和的硫酸鎂，並混合均勻充分反應，得到膽汁酸鎂鹽，再在膽汁酸鎂鹽中加鹽酸調PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鎂鹽；或按稀釋液重量的O. 1-0. 2倍加入水飽和的氯化鈣，並混合均勻充分反應，得到膽汁酸鈣鹽，再在膽汁酸鈣鹽中加鹽酸調PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鈣鹽；按游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽重量4-10倍的比例加入濃度為60-90%的甲醇或こ醇回流溶解游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽得溶解液；將溶解液置於裝有大孔樹脂的層析柱中，層析柱中的大孔樹脂裝入量為每升層析柱體積裝入O. 5-0. 8kg大孔樹脂；然後第一歩用層析柱體積2-10倍量的濃度為35-55%甲醇或こ醇洗脫掉溶解液中的未水性雜質；第二步再用層析柱體積5-10倍量的濃度為60-80%甲醇或こ醇洗脫層析柱得到鵝去氧膽酸溶液；鵝去氧膽酸溶液按每升加入l_4g碳酸鈉或氫氧化鈉，加熱回收鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇，至鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇濃度在10 %以下，冷卻至常溫後過濾，濾液按l-5g/L的量加入エ業用雙氧水脫色10-24小時後，用鹽酸調pH值至2. 5-4. 5，再過濾，濾餅用水洗至PH值至中性，低溫烘乾濾餅，就得到鵝去氧膽酸。進ー步的方案是在第二步洗脫層析柱後，按層析柱體積5-10倍量的濃度為90%以上甲醇或こ醇再次洗脫層析柱，洗脫後的層析柱下次備用。本發明的具體エ藝流程可以是鴨膽一去膽度一鴨膽汁一水解以鴨膽汁O. 5ml-6ml/L微生物溶液加入該鴨膽液中，升溫至25°C -42°C反應24h-72h —游離膽汁酸一NaoH, NaC03調pH8_10 —飽和硫酸鎂溶液按其溼重遊離膽汁酸的O. 1-0. 2倍加入水飽和的硫酸鎂溶液混合均勻一過濾一膽汁酸鎂鹽一上大孔樹脂一45% -90%甲醇洗脫一分段收集得到較純的鵝去氧膽酸(⑶CA)本發明結合微生物溶液的水解作用，得到游離膽汁酸後，調PH8-10，加水飽和硫酸鎂溶液生成膽汁酸鎂鹽，膽汁酸鎂鹽調PH4. 5-6. 5，用甲醇溶解後，上於大孔樹脂，此大孔樹脂是由苯こ烯或丙烯酸為原料的ー種，用45%-90%甲醇洗脫，分段收集用G型薄層矽膠板定性，(展開劑為異辛烷醋酸こ酷冰醋酸正丁醇；10 5 1.5 1.5),(顯色劑為10%磷鑰酸こ醇溶液)收集純的⑶CA洗脫段，得到較高收率的，純度大於95%的⑶CA。拋去了原有的溶劑汽油脫脂，反覆沉澱、結晶等エ藝，實現了簡便、安全易控、穩定性好的エ業化生產鴨膽中鵝去氧膽酸方法。本發明的有益效果是，創造了ー種新的從鴨膽汁中用大孔樹脂分離其中的鵝去氧、膽酸(CDCA)方法，使其方法簡單易控，收率和純度高，適合エ業化從鴨膽汁中分離鵝去氧膽酸，使得大量的鴨膽得到真正有效地利用。
具體實施例方式下面結合具體的實施例對本發明進ー步說明。本發明的應用範圍不限於該實例。ー種大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，其特徵在於該エ藝分為兩步第一步為微生物溶液製作取動物迴腸及大腸，刮出迴腸和大腸中的內容物；在刮出的內容物中，添加內容物體積5倍的水稀釋混勻，過濾除掉固體雜質，得到濾液；按濾液體積加入O. 2倍的MRS培養基，保持溫度在37°C，培養72小時，得培養液；用離心機分離培養液，得到沉澱物；加沉澱物重量10倍的無菌生理鹽水混懸，得到能水解結合型膽汁酸的微生物溶液；常溫保存微生物溶液，備用；第二步為大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸取鴨膽汁IOOOml，按膽汁量體積添加微生物溶液3ml/L混合均勻，得混合液；混合液在37°C溫度條件下，反應48小時，得游離型膽汁酸溶液中間體；從中間體中過濾出溼游離型膽汁酸；按游離型膽汁酸溼重添加10倍水稀釋成稀釋液，並用碳酸鈉或氫氧化鈉調稀釋液PH值至8-10 ；按稀釋液重量的O. 2倍加入水飽和的硫酸鎂，並混合均勻充分反應，得到膽汁酸鎂鹽，再在膽汁酸鎂鹽中加稀鹽酸調PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鎂鹽；或按稀釋液重量的O. I倍加入水飽和的氯化鈣，並混合均勻充分反應，得到膽汁酸鈣鹽，再在膽汁酸鈣鹽中加稀鹽酸調PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鈣鹽；按游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽重量4倍的比例加入濃度為80%的甲醇或こ醇回流溶解游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽得溶解液；將溶解液置於裝有1000克大孔樹脂的層析柱中，層析柱中的大孔樹脂裝入量為每升層析柱體積裝入O. 7kg大孔樹脂；層析柱的徑高比為(I 10)。然後第一歩用層析柱體積5倍量的濃度為45%甲醇或こ醇洗脫掉溶解液中的親水性雜質；第二步再用層析柱體積10倍量的濃度為70%甲醇或こ醇洗脫層析柱得到鵝去氧膽酸溶液；鵝去氧膽酸溶液按每升加入3g碳酸鈉或氫氧化鈉，加熱回收鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇，至鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇濃度在10%以下，冷卻至常溫後過濾，濾液按3g/L的量加入エ業用雙氧水脫色12小時後，用稀鹽酸調pH值至2. 5-4. 5，再過濾，濾餅用水洗至PH值至中性，低溫烘乾濾餅，就得到24克含量為95%以上的鵝去氧膽酸。
在第二步洗脫層析柱後，按層析柱體積10倍量的濃度為90%以上甲醇或こ醇再次洗脫層析柱，洗脫後的層析柱下次備用。
權利要求
1.ー種大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，其特徵在於該エ藝分為兩步 第一步為微生物溶液製作 取動物迴腸及大腸，刮出迴腸和大腸中的內容物； 在刮出的內容物中，添加內容物體積O. 5-10倍的水稀釋混勻，過濾除掉固體雜質，得到濾液； 按濾液體積加入O. 1-0. 5倍的MRS培養基，保持溫度在35-42°C，培養24-72小時，得培養液； 用離心機分離培養液，得到沉澱物； 加沉澱物重量1-100倍的無菌生理鹽水混懸，得到能水解結合型膽汁酸的微生物溶液； 常溫保存微生物溶液，備用； 第二步為大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸 取鴨膽汁，按膽汁量體積添加微生物溶液O. 5ml-6ml/L混合均勻，得混合液； 混合液在25°C _42°C溫度條件下，反應24-72小時，得游離型膽汁酸溶液中間體； 從中間體中過濾出溼游離型膽汁酸； 按游離型膽汁酸溼重添加5-20倍水稀釋成稀釋液，並用碳酸鈉或氫氧化鈉調稀釋液pH 值至 8-10 ； 按稀釋液重量的O. 1-0. 2倍加入水飽和的硫酸鎂，並混合均勻充分反應，得到膽汁酸鎂鹽，再在膽汁酸鎂鹽中加鹽酸調PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鎂鹽； 或按稀釋液重量的O. 1-0. 2倍加入水飽和的氯化鈣，並混合均勻充分反應，得到膽汁酸鈣鹽，再在膽汁酸鈣鹽中加鹽酸調PH值至4. 5-6. 5，過濾得到游離型膽汁酸鈣鹽； 按游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽重量4-10倍的比例加入濃度為60-90%的甲醇或こ醇回流溶解游離型膽汁酸鎂鹽或游離型膽汁酸鈣鹽得溶解液； 將溶解液置於裝有大孔樹脂的層析柱中，層析柱中的大孔樹脂裝入量為每升層析柱體積裝入O. 5-0. 8kg大孔樹脂； 然後 第一歩用層析柱體積2-10倍量的濃度為35-55%甲醇或こ醇洗脫掉溶解液中的親水性雜質； 第二步再用層析柱體積5-10倍量的濃度為60-80%甲醇或こ醇洗脫層析柱得到鵝去氧膽酸溶液； 鵝去氧膽酸溶液按每升加入l_4g碳酸鈉或氫氧化鈉，加熱回收鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇，至鵝去氧膽酸溶液中的甲醇或こ醇濃度在10%以下，冷卻至常溫後過濾，濾液按l_5g/L的量加入エ業用雙氧水脫色10-24小時後，用鹽酸調pH值至2. 5-4. 5，再過濾，濾餅用水洗至PH值至中性，低溫烘乾濾餅，就得到鵝去氧膽酸。
2.根據權利要求I所述的大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，其特徵在於在第ニ步洗脫層析柱後，按層析柱體積5-10倍量的濃度為90%以上甲醇或こ醇再次洗脫層析柱，洗脫後的層析柱下次備用。
全文摘要
一種大孔樹脂分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸的方法，其特徵在於第一步為微生物溶液製作取動物迴腸及大腸，刮出內容物；添加水稀釋過濾得到濾液；濾液加入MRS培養基得培養液；分離培養液得沉澱物；加生理鹽水混懸得微生物溶液；第二步為分離鴨膽汁中鵝去氧膽酸取鴨膽汁，添加微生物溶液得混合液；混合液反應過濾出溼游離型膽汁酸；添加水稀釋成稀釋液，加入水飽和的硫酸鎂或氯化鈣反應過濾得到游離型膽汁酸鹽；加入甲醇或乙醇回流溶解游離型膽汁酸鹽得溶解液；將溶解液置於裝有大孔樹脂的層析柱中，洗脫層析柱得鵝去氧膽酸溶液；鵝去氧膽酸溶液加入碳酸鈉或氫氧化鈉加熱過濾，濾餅用水洗至pH值中性，低溫烘乾就得到鵝去氧膽酸。
文檔編號C12P33/00GK102703556SQ20121017530
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月30日 優先權日2012年5月30日
發明者吳憲君, 吳昱隆, 寧玉蓉, 幹文冬 申請人:綿陽勁柏生物科技有限責任公司