具有生物活性的新化合物及其製備方法
2023-04-25 04:06:11
專利名稱：具有生物活性的新化合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及具有生物活性的新化合物，以下稱此化合物為FR901228物質。更具體地說，本發明涉及具有生物活性的新物質FR901228，該物質具有抗微生物和抗腫瘤活性;本發明還涉及該物質的製備方法和含有該物質的藥用組合物。
本發明的FR901228物質可通過能產生FR901228物質的菌株在營養培養基中發酵而製得，該菌株屬於色桿菌屬(Chromobacterium)，如紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)WB968。
發酵方法詳細說明如下(1)微生物用於生產FR901228物質的微生物的詳細情況說明如下WB968菌株的分類研究WB968菌株是從日本山形縣(Yamagata-ken)得到的土壤樣品中分離出來的。
本分類研究主要應用《Bergey′sManualofSystematicBacteriology》(第1卷)敘述的方法進行。
(ⅰ)形態特徵取在營養肉湯和瓊脂中於30℃培養20小時的細胞用光學顯微鏡和電子顯微鏡進行WB968菌株的形態觀察。
WB968菌株是一種革蘭氏陰性的遊動性細菌。細胞形狀為杆狀，大小約0.5-0.6×1.2-1.8μm。
結果示於表1。
表1WB968菌株的形態特徵革蘭氏染色陰性菌落顏色淡橙色細胞形狀杆狀細胞大小0.5-0.6×1.2-1.8μm芽孢陰性遊動性陽性鞭毛單極鞭毛(ⅱ)生理特徵WB968菌株的生理特徵總結於表2。生長溫度範圍從15℃到40℃。
WB968菌株是氧化酶陽性、過氧化氫酶陽性、O-F試驗發酵。酪蛋白水解、七葉苷水解為陰性。使葡萄糖、果糖和海藻糖發酵。吲哚試驗為陰性。伏-普二氏試驗為陰性。β-半乳糖苷酶試驗(ONPG試驗)為陰性。
表2WB968菌株的生理特徵條件特徵生長溫度15-40℃在空氣中生長陽性在無氯化鈉的腖水中生長陽性在6%氯化鈉中生長陰性在氰化鉀肉湯中生長陽性紫色素陰性表2(續)條件特徵過氧化氫酶陽性氧化酶陽性O-F試驗發酵由葡萄糖產氣陰性0/129敏感性(10，150μg)陰性硝酸鹽反應陽性吐溫80酯酶陽性H2S產生(TSI) 陰性吲哚陰性MR陰性VP陰性西蒙氏檸檬酸鹽陽性ONPG試驗陰性脲酶陽性DNA酶陽性澱粉水解陰性明膠液化陽性酪蛋白水解陽性七葉苷水解陰性細胞溶素脫羧酶陰性鳥氨酸脫羧酶陰性精氨酸二水解酶(dihydrolase)陽性表2(續)條件特徵DNA的G+C含量62.7摩爾%主要細胞脂肪酸 C16∶1醌型Q-8由糖產酸D-葡萄糖陽性L-阿拉伯糖陰性D-甘露糖醇陰性D-果糖陽性D-半乳糖陰性D-山梨醇陰性D-海藻糖陽性蔗糖陰性乳糖陰性水楊苷陰性麥芽糖陰性纖維二糖陰性(ⅲ)鑑定根據上述特徵，按照《Bergey′sManualofSystematicBacteriology》(第1卷)，WB968菌株被鑑定為紫色色桿菌。
紫色色桿菌WB968的菌種按照《布達佩斯條約》的規定於1988年7月20日保藏在FermentationResearchInst-ituteAgencyofIndustrialScienceandTechnology(日本305茨城筑波市東1丁目1-3號)，編號為FERMBP-1968。
在這方面，在上述機構保藏WB968菌株時，該菌株曾被鑑定為氣單胞菌(Aeromonas)，但現在該菌株被鑑定為紫色色桿菌。(2)FR901228物質的生產生產本發明的FR901228物質的菌株屬於色桿菌屬(例如紫色色桿菌WB968)。在含有可同化的碳源和氮源的營養培養基中，於有氧條件下(例如搖瓶培養和深層培養等)培養該菌株，則可生產本發明的FR901228物質。
營養培養基中優選的碳源是碳水化合物如葡萄糖、澱粉、果糖或甘油。
優選的氮源是肉湯、酵母提取物、腖、麩質粗粉、棉子粉、大豆粗粉、玉米漿、乾酵母和麥胚等，以及無機和有機含氮化合物如銨鹽(例如硝酸銨、硫酸銨、磷酸銨等)、尿素或胺基酸。
碳源和氮源合併應用是有益的，但不必用純品，因為含微量生長因子和相當量無機營養素的稍不純的物質也適用。
需要時，可向培養基中加無機鹽，例如碳酸鈉或碳酸鈣、磷酸鈉或磷酸鉀、氯化鈉或氯化鉀、碘化鈉或碘化鉀、鎂鹽、銅鹽或鈷鹽。
如必要，特別是培養基劇烈地產生泡沫時，可加入消泡劑如液體石蠟、脂肪油、植物油、礦物油或矽酮。
與大量生產其他生物活性物質所應用的優選方法一樣，大量生產FR901228物質時優選用深層有氧培養條件。
小量生產則採用搖瓶培養。
此外，在大罐中進行培養時，為了避免在生產FR901228物質過程中生長遲滯，最好用細菌營養細胞在生產罐中接種培養。因此，希望通過用細菌細胞接種較少量的培養基並培養接種後的培養基，首先生產細菌的營養細胞，然後將經過培養的營養細胞轉移到大罐中。生產營養細胞的培養基與用於生產FR901228物質的培養基實質上可以相同或不同。
培養混合物的攪拌和通氣可用各種方法完成。攪拌可利用螺旋槳式或類似的機械攪拌裝置進行，也可通過旋轉或振搖發酵罐、用各種泵裝置或將消毒的空氣通入培養基。通氣可通過將消毒的空氣通入發酵混合物來進行。
發酵通常在約10°～40℃，最好在25°～35℃進行，發酵時間約為15～50小時，但可隨發酵條件和規模而不同。
發酵完全後，用各種常用的回收和純化生物活性物質的方法從肉湯培養基中回收FR901228物質，例如用適當的溶劑或某些溶劑的混合物進行溶劑提取，用適當的溶劑或某些溶劑的混合物進行層析或重結晶。
一般來說，本發明的FR901228物質主要存在於細菌細胞中。但濾液中也含有FR901228物質。因此，最好用全部肉湯培養基直接分離FR901228物質，例如用適當的溶劑如熱水、丙酮或乙酸乙酯或這些溶劑的混合物進行提取。
提取液用常規方法處理，得到FR901228物質，例如通過蒸發或蒸餾使提取液濃縮到較小的量，得到含有活性物質(即FR901228物質)的殘餘物，用常規純化方法進行純化，例如用適當的溶劑或某些溶劑的混合物進行層析或重結晶。
FR901228物質的理化性質按照上述發酵方法得到的FR901228物質具有如下理化性質。
外觀無色稜柱狀性質中性物質熔點235-245℃(分解)旋光率〔α〕23D+39°(C＝1.0，CHCl3)分子式C24H36N4O6S2元素分析C24H36N4O6S2·CH3CN計算值C，53.68;H，6.76;N，12.04;S，11.02(%)實測值C，53.68;H，6.71;N，11.80;S，11.09(%)分子量540.72FAB-MS m/z 541(M+H)+溶解度能溶於氯仿、乙酸乙酯微溶於甲醇、乙醇不溶於水、己烷顏色反應陽性硫酸鈰反應、硫酸反應、碘蒸氣反應陰性茚三酮反應、氯化鐵反應、埃爾利希反應、莫利施反應薄層層析固定相展開溶劑 Rf值矽膠板＊二氯甲烷∶甲醇(10∶1) 0.65＊矽膠板 Kieselgel 60 F254(E.Merck生產)
紫外吸收光譜末端吸收(在甲醇中)紅外吸收光譜νKBrmax＝3360，3320，2950，2910，1740，1690，1660，1650，1630，1520，1460，1440，1400，1390，1370，1350，1300，1250，1220，1170，1100，1040，1020，1000，980，910cm-1，如附
圖1所示。
1H核磁共振譜[CDCl3-CD3OD(10∶1)，400MHz]δ8.41(1H，s，可交換的)，8.25(1H，d，J＝4Hz，可交換的)，7.80(1H，d，J＝6.5Hz，可交換的)，7.66(1H，d，J＝8Hz，可交換的)，6.31(1H，q，J＝7Hz)，5.76(1H，m)，5.70-5.63(2H，m)，4.69(1H，m)，4.51(1H，m)，3.97(1H，dd，J＝6and4Hz)，3.20-3.07(3H，m)，2.95(1H，m)，2.83(1H，dd，J＝14and1.5Hz)，2.66(1H，dd，J＝14and6Hz)，2.65-2.60(2H，m)，2.37(1H，m)，2.22(1H，m)，1.72(3H，d，J＝6.5Hz)，1.10(3H，d，J＝7Hz)，1.08(3H，d，J＝7Hz)，1.00(3H，d，J＝6.5Hz)，0.97(3H，d，J＝7Hz)ppm，如附圖2所示。
13C核磁共振譜(CDCl3-CD3OD(10∶1)，100MHz)δ172.34(s)，171.43(s)，169.17(s)，168.37(s)，165.59(s)，130.36(d)，129.64(d)，129.62(s)，129.04(d)，70.15(d)，62.42(d)，58.10(d)，56.57(d)，37.75(t)，37.56(t)，34.46(t)，31.65(d)，30.02(t)，28.88(d)，19.09(q)，18.96(q)，18.29(q)，18.03(q)，13.04(q)ppm，如附圖3所示。
胺基酸分析FR901228物質(4mg)用6N鹽酸(2ml)在密封管中於110℃水解20小時。混合物用自動胺基酸分析儀分析。對FR901228物質進行胺基酸分析的結果表明，存在纈氨酸和氨(纈氨酸和氨的比率為2∶1)。
由包括上述數據在內的理化性質的分析，和從FR901228物質衍生的某些衍生物的化學結構，證明FR901228物質具有如下化學式
從FR901228物質衍生的衍生物從FR901228物質製備一些衍生物。
製備方法1從FR901228物質衍生FR123392物質和FR125441物質。
向FR901228物質(54mg)的甲醇(2ml)溶液中加入1N氫氧化鈉水溶液(200ml)。在室溫下攪拌12小時後，加入氯化氫水溶液調節pH到1，用乙酸乙酯提取。經硫酸鎂乾燥後過濾，蒸發溶劑。將殘餘物溶解在甲醇中並加入三甲基甲矽烷基重氮甲烷(1ml)。5分鐘後，加1滴乙酸，蒸除溶劑。殘餘物通過製備薄層層析純化(0.5mm×2)，用10%甲醇的氯仿溶液展開，得到FR123392物質(15mg)和FR125441物質(10mg)。
FR123392物質
1H核磁共振譜[CDCl3-CD3OD(10∶1)，200MHz]δ0.98(12H，m)，1.75(3H，d，J＝7Hz)，2.0-2.9(10H，m)，3.05(1H，dd，J＝4and14Hz)，3.71(3H，s)，4.13(1H，d，J＝8Hz)，4.37(2H，m)，4.57(1H，dd，J＝5and10Hz)，5.6(2H，m)，6.64(1H，q，J＝7Hz)，7.48(1H，d，J＝10Hz)紅外吸收光譜νKBrmax＝3260，2920，2400，1720，1620，1510，1430，1260，1200，1010cm-1FAB-MS m/z 541(M+H)+FR125441物質1H核磁共振譜[CDCl3-CD3OD(10∶1)，400MHz]δ0.95(12H，m)，1.76(3H，d，J＝7Hz)，2.20(1H，m)，2.35(3H，m)，2.7(4H，m)，2.98(1H，dd，J＝13and8Hz)，3.08(1H，dd，J＝13and4.5Hz)，3.72(3H，s)，4.14(1H，d，J＝6Hz)，4.35(1H，d，J＝7Hz)，4.43(2H，m)，5.67(1H，dd，J＝6and15Hz)，5.78(1H，dt，J＝15and6Hz)，6.70(1H，q，J＝7Hz)FAB-MS m/z 573(M+H)+製備方法2從FR125441物質衍生FR123393物質。
向FR125441物質(10mg)的吡啶(0.8ml)溶液中加入乙酸酐(0.4ml)。在室溫下攪拌12小時後，蒸除溶劑。殘餘物進行製備薄層層析(0.5mm×1)，用5%甲醇的氯仿溶液展開，得到FR123393物質(10mg)。
FR123393物質1H核磁共振譜[CDCl3-CD3OD(10∶1)，200MHz]δ1.0(12H，m)，1.75(3H，d，J＝7Hz)，2.05(3H，s)，1.9-3.3(10H，m)，3.70(3H，s)，4.20(1H，d，J＝8Hz)，4.34(1H，d，J＝7Hz)，4.84(1H，m)，5.5(2H，m)，5.84(1H，dt，J＝15and7Hz)，6.65(1H，q，J＝7Hz)紅外吸收光譜νKBrmax＝3280，2950，2430，1720，1630，1500，1425，1360，1225，1010，960cm-1FAB-MS m/z 615(M+H)+製備方法3從FR901228物質衍生FR123395物質。
向FR901228物質(54mg)的二噁烷(2ml)溶液中加入三苯膦(55mg)。在室溫下攪拌72小時後真空除去溶劑。殘餘物進行製備薄層層析(0.5mm×2)，用2%甲醇的氯仿溶液展開，得到FR123395物質(10mg)。
FR123395物質1H核磁共振譜[CDCl3-CD3OD(10∶1)，200MHz]δ1.0(12H，m)，1.5(1H，m)，1.85(3H，d，J＝7Hz)，2.1
-3.1(9H，m)，3.90(1H，d，J＝8Hz)，4.45(1H，d，J＝7Hz)，5.65-6.0(4H，m)，6.24(1H，q，J＝7Hz)紅外吸收光譜νKBrmax＝3300，2920，2470，1730，1640，1500，1420cm-1FR901228物質的生物學性質以下給出一些生物實驗數據，以舉例證明FR901228物質的生物活性。
試驗1FR901228的抗微生物活性FR901228的抗微生物活性試驗以瓊脂稀釋法在薩布羅氏培養基中進行。
在25℃培養48小時後的最小抑制濃度(MIC)以μg/ml表示。結果示於表3。
表3FR901228物質的抗微生物活性微生物最小抑制濃度(μg/ml)粟酒裂殖酵母10出芽短梗黴IFO446610黑麴黴100試驗2在體外FR901228物質對人腫瘤細胞生長的抑制作用細胞毒性試驗在微量滴定板中進行，每孔含3×103個腫瘤細胞，培養基為100μl添加了10%胎牛血清、青黴素(50單位/ml)和鏈黴素(50μg/ml)的Dulbecco氏基本必需培養基。細胞在37℃下培養4天，按照Mosmann所述的方法(J.Immunol.Methods，6555-63，1983)進行MTT〔3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物，由Sigma生產〕比色試驗。MTT以5mg/ml溶解在磷酸鹽緩衝液(PBS)中，過濾滅菌，除去少量不溶的殘渣。人腫瘤細胞培養結束後，將此MTT溶液(每100μl培養基加10μl)加到每個試驗孔中，微量滴定板在37℃下再培養4小時。將酸-異丙醇(100μl0.04NHCl的異丙醇溶液)加到所有的孔中，充分混合使深藍色結晶溶解。待所有結晶都溶解後，用雙波長微量滴定板光度計(MTP-22型;CoronaElectricCo.，Ltd，Katsuta，Japan)在550nm處進行測量，參考波長為660nm。將本發明的目的化合物溶解在甲醇中，以Dulbecco氏基本必需培養液稀釋，並加到培養物中使終濃度為1μg/ml或更低。結果示於表4。
表4在體外FR901228物質對人腫瘤細胞生長的抑制作用人腫瘤細胞系 IC50(ng/ml)A549(肺癌)0.82MCF-7(乳房癌)0.99SW480(結腸癌)0.57試驗3FR901228物質對P388鼠白血病的抗腫瘤活性在鼠腫瘤系統中測定FR901228物質的抗腫瘤活性。將P388白血病細胞(1×106個)經腹膜內移入BDF1小鼠(雌性，8周齡)體內。接種腫瘤細胞24小時後，將FR901228物質經腹膜內給予小鼠。再經腹膜內給予FR901228物質3天，每天1次。FR901228物質是懸浮在0.9%鹽水中。對照組小鼠經腹膜內給予0.9%鹽水。
結果示於表5。抗腫瘤活性以各組的平均存活時間表示，也可以用T/C%( (治療組平均存活時間)/(對照組平均存活時間) ×100)表示。
表5FR901228物質對P388鼠白血病的抗腫瘤活性劑量n平均存活時間T/C(mg/kg/天)(天)(%)對照49.01001.0415.25169.40.32414.25158.3試驗4FR901228物質的急性毒性BDF1小鼠經腹膜內注射FR901228物質的急性毒性為5.6mg/kg。
以上試驗結果表明，FR901228物質具有生物活性。
本發明的藥用組合物可按藥物製劑的形式(例如固體、半固體或液體)應用，藥用組合物含有FR901228物質(作為有效成分)與適於外用、口服或腸胃外應用的有機或無機載體或賦形劑的混合物。例如，有效成分可以與通常無毒的、藥學上可接受的載體混合製成片劑、丸劑、膠囊劑、栓劑、溶液劑、乳劑、混懸劑以及任何其他適於應用的形式。另外，如果必要，可以應用輔料、穩定劑、增稠劑、著色劑及香精。FR901228物質可以按足夠的量加在藥用組合物中，以便對不同病程和病情產生所希望的抗腫瘤效果。
組合物應用於人時，最好是靜脈給藥、肌肉給藥或口服給藥。FR901228物質在治療上的有效劑量取決於各個需治療的患者的病情和年齡，但用於治療腫瘤時，靜脈給予FR901228物質的日劑量為0.1-100mg/kg體重;肌肉給予FR901228物質的日劑量為0.1-100mg/kg體重;口服給予FR901228物質的日劑量為0.1-100mg/kg體重。
從FR901228物質得到的上述衍生物也具有抗腫瘤活性。
列舉下面一些實例對本發明作更詳細的說明。
實例1發酵將含葡萄糖(1%)和肉湯(1%)的培養基(160ml)倒入各個500ml的錐形瓶中，120℃滅菌30分鐘。將一環紫色色桿菌WB968斜面培養物接種於每個培養基中，在旋轉搖床上於30℃培養24小時。將產生的培養物接種於預先在120℃滅菌30分鐘的12個30升發酵罐內的培養基(15升)中，該培養基中含有葡萄糖(1%)、肉湯(1%)和Adekanol(消泡劑，商標，AsahiDenkaKogyo公司生產)(0.05%)。在每分鐘通氣20升、以200rpm攪拌的條件下，於30℃下培養24小時。
分離和純化培養結束後，每個發酵罐於120℃滅菌30分鐘。這樣得到的肉湯培養基用硅藻土(10kg)助濾。濾液(150升)用乙酸乙酯(150升)提取二次。提取液減壓蒸發得到油狀殘餘物。將油狀殘餘物與500g矽膠(KieselGel60，70-230目，E.Merck生產)混合，將混合物在甲醇中製成漿狀物。蒸發除去溶劑後，將得到的乾粉進行柱層析，柱中裝有同樣的矽膠，用該矽膠(0.5升)與正己烷一起裝柱。層析柱用正己烷(2升)、正己烷和乙酸乙酯混合物(3∶1V/V，3升;1∶1V/V，3升;1∶2V/V，3升)以及乙酸乙酯(5升)展開。收集含有目的化合物的部分，減壓濃縮，得到微黃色粉狀物FR901228物質。將此粉狀物溶解在二氯甲烷和甲醇的混合物(10∶1V/V，10ml)中。向此溶液中加入乙腈(20ml)。室溫下放置，得到純化的FR901228物質(920mg)，為無色結晶。
權利要求
1.具有下式的FR901228物質。
2.一種生產FR901228物質的方法，該方法包括，在有氧條件下，在含水營養培養基中培養能夠產生FR901228物質的、屬於色桿菌屬的菌株，並回收FR901228物質。
3.一種按照權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述色桿菌菌株是紫色色桿菌WB968(FERMBP-1968)。
4.一種生物學上純淨的紫色色桿菌WB968(FERMBP-1968)菌種。
5.一種藥用組合物，該組合物含有作為有效成分的FR901228物質和一種無毒藥用載體。
全文摘要
本發明涉及具有生物活性的FR901228物質、其製備方法及含有該物質的藥用組合物。
文檔編號A61P31/04GK1040054SQ8910608
公開日1990年2月28日 申請日期1989年7月25日 優先權日1988年7月26日
發明者奧原正國, 俊藤俊男, 堀康宏, 藤田隆, 上田博嗣, 重松伸治 申請人:藤澤藥品工業株式會社