使用木糖利用基因表達增強的細菌進行發酵以生產l—胺基酸的方法

2023-04-24 12:48:21 2

專利名稱：使用木糖利用基因表達增強的細菌進行發酵以生產l—胺基酸的方法
技術領域：
本發明涉及通過戊糖發酵生產L-胺基酸的方法，更具體地涉及使用木糖利用基因表達增強的細菌，以阿拉伯糖和/或木糖與葡萄糖一起的混合物作為碳源進行發酵從而生產L胺基酸的方法。在商業上生產L-胺基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸和L-色氨酸時，可以使用廉價的碳源，其包括來自纖維素生物質(cellulosic biomass)的半纖維素片段的己糖和戊糖混合物。
背景技術：
一般的，L-胺基酸利用不同微生物菌株通過發酵方法進行工業化生產。該方法中所使用的發酵培養基通常包括充足量的各種碳源和氮源。
常規地，各種碳水化合物如己糖、戊糖、丙糖；各種有機酸和醇被用作碳源。己糖包括葡萄糖、果糖、甘露糖、山梨糖、半乳糖等等。戊糖包括阿拉伯糖、木糖、核糖等等。然而，上述碳水化合物以及其它現在用於工業的常規碳源，如糖漿、穀物、糖蔗、澱粉、其水解產物等均相當昂貴。因此，需要找出更加廉價的替代碳源用於L-胺基酸的生產。
纖維素生物質是一種合適的用於L-胺基酸生產的原料，因為其易於得到並且比碳水化合物、穀物、糖蔗或其它碳源便宜。在纖維素生物質中纖維素、半纖維素和木質素的常規量為約40-60％的纖維素、20-40％的半纖維素、10-25％的木質素和10％的其它成分。纖維素成分由己糖，通常是葡萄糖的聚合物組成。半纖維素成分主要由戊糖，包括木糖和阿拉伯糖組成。各種纖維素生物質原料的組成如表1所示(http//www.ott.doe.gov/biofuels/understanding_biomass.html)。
表1

有關超過150種生物質(biomass)樣品成分更加詳細的信息匯總於「生物質原材料的組成與性質資料庫」(http//www.ott.doe.gov/biofuels/progs/searchl.cgi)中。
近來希望開發一種能夠有效的將纖維素生物質轉化為可發酵原材料，通常為碳水化合物的混合物的工業方法。因此，近期希望增加利用可再生的能量來源如纖維素和半纖維素生產有用的化合物(AristidouA.，Pentila.M.，Curr.Opin，Biotech nol，2000，Apr.，11:2，187-198)。然而，絕大部分已發表的文章和專利，或專利申請，記載的是藉助生物催化劑(細菌和酵母)利用纖維素生物質生產乙醇，其被期望成為有效的代用燃料。該方法包括使用不同的運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)改良菌株(Deanda K.等，Appl.Environ.Microbiol.，1996 Dec.，62:12，4465-70；Mohagheghi A.等，Appl.Biochem.Biotechnol.，2002，98-100:885-98；Lawford H.G.，RousseauJD.，Appl.Biochem.Biotechnol，2002，98-100:429-48；PCT申請WO95/28476，WO98/50524)、大腸桿菌(Escherichia coli)改良菌株(Dien B.S.等，Appl.Biochem.Biotechnol，2000，84-86:181-96；Nichols N.N.等，Appl.Microbiol.Biotechnol.，2001 Jul，56:1-2，120-5；美國專利5,000,000)進行纖維素生物質的發酵。利用熱帶假絲酵母菌(Candida tropicalis)對來自半纖維素糖的木糖進行發酵可生產木糖醇(Walthers T.等，Appl.Biochem.Biotechnol.，2001，91-93:423-35)。使用重組的大腸桿菌(Escherichia coli)菌株對阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、木糖和其組合物進行發酵可生產1，2-丙二醇(美國專利6,303,352)。還有報導通過使用大腸桿菌菌株對葡萄糖/木糖/阿拉伯糖混合物進行發酵可獲得3-脫氫莽草酸。與單獨採用木糖或葡萄糖作為碳源相比，當使用葡萄糖/木糖/阿拉伯糖混合物作為碳源時所獲得的3-脫氫莽草酸的濃度和產量最高(KaiLi and J.W.Frost，Biotechnol.Prog.，1999，15，876-883)。
有報導稱大腸桿菌可以利用戊糖如L-阿拉伯糖和D-木糖(Escherichiacoli and Salmonella，Second Edition，Editor in ChiefF.C.Neidhardt，ASMPress，Washingong D.C.，1996)。L-阿拉伯糖轉運進細胞是通過兩種誘導型系統(1)araE基因編碼的低親合力通透酶(Km約0.1mM)，和(2)araFG操縱子編碼的高親合力(Km為1到3μM)系統。araF基因編碼具有趨化受體功能的周圍胞質結合蛋白(306個胺基酸)，araG基因座編碼內膜蛋白。糖的代謝是通過araBAD操縱子編碼的-組酶異構酶(araA基因編碼)，其可逆的將醛醣轉化為L-核酮糖；激酶(araB基因編碼)，其將酮糖磷酸化為L-核酮糖5-磷酸鹽；和L-核酮糖-5-磷酸-4-差向異構酶(araD基因編碼)，其催化D-木糖-5-磷酸鹽的形成(Escherichia coli and Salmonella，SecondEdition，Editor in ChiefF.C.Neidhardt，ASM Press，Washingtong D.C.，1996)。
大部分大腸桿菌菌株可在D-木糖中生長，但K-12菌株需要變異後才可在該化合物中生長。該戊糖的利用是通過誘導型且分解代謝物抑制的途徑，其中包括利用兩種誘導型通透酶(對D-核糖或D-阿拉伯糖無活性)轉運通過胞質膜，異構化為D-木酮糖，以及ATP依賴型磷酸化戊酮糖產生D-木酮糖5-磷酸鹽。高親合力(Km為0.3到3μM)轉運系統依賴於周圍胞質結合蛋白(37,000Da)並且可能由高能化合物驅動。低親合力(Km約170μM)系統由質子間原動力激活。該D-木糖-質子-同向轉移系統由xylE基因編碼。對應於D-木糖利用的主要基因群為xylAB(RT)。xylA基因編碼異構酶(54,000Da)，xylB基因編碼激酶(52,000Da)。操縱子包括兩個轉錄起始位點，其中一個插入到xylB開放讀碼框上遊。由於低親合力通透酶對應於不連接的xylE，xylT基因座，也稱為xylF(xylFGHR)，可能編碼高親合力轉運系統並且因此含有至少兩個基因(一個編碼周圍胞質蛋白，一個編碼完整的膜蛋白)(Escherichia coli and Salmonella，Second Edition，Editor inChiefF.C.Neidhardt，ASM Press，Washingtong D.C.，1996)。該xylFGHR基因編碼木糖ABC轉運蛋白，其中xylF基因編碼推定的木糖結合蛋白，xylG基因編碼推定的ATP結合蛋白，xylH基因編碼推定的膜成分，xylR基因編碼木糖轉錄激活蛋白。
導入上述編碼L-阿拉伯糖異構酶、L-核酮糖激酶、L-核酮糖5-磷酸4-差向異構酶、木糖異構酶和木酮糖激酶，加上轉醛醇酶和轉酮醇酶的E.coli基因，可使微生物，如運動發酵單胞菌，將阿拉伯糖和木糖代謝為乙醇(WO/9528476，WO98/50524)。相反，編碼乙醇脫氫酶(ADH)和丙酮酸脫羧酶(PDH)的發酵單胞菌基因也可用於大腸桿菌菌株的乙醇生產(Dien B.S.等，Appl.Biochem.Biotechnol，2000，84-86:181-96；美國專利5,000,000)。
本發明的作者以前公開了一種通過發酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產L-胺基酸，如L-異亮氨酸、L-組氨酸、L-蘇氨酸和L-色氨酸的方法(Russian patent application 2003105269)。
然而，至今沒有關於木糖利用基因，如xylABFGHR基因座的基因表達增強的細菌，或使用這些基因從己糖和戊糖混合物中生產L-胺基酸的報導。
發明概述本發明的目的在於增強L-胺基酸生產菌株的產量，提供木糖利用基因表達增強的L-胺基酸生產菌，並且提供使用該細菌從已糖，如葡萄糖，和戊糖，如木糖或阿拉伯糖的混合物中生產L-胺基酸的方法。從纖維素生物質中獲得的發酵原材料可用作培養基的碳源。該目的的實現是基於發現克隆到低拷貝載體上的xylABFGHR基因座可增強L-胺基酸，例如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸和L-色氨酸的產量。所使用的微生物能夠在發酵原材料中生長並且有效生產L-胺基酸。該用作碳源的發酵原材料由木糖和阿拉伯糖以及葡萄糖組成。L-胺基酸生產菌株的示例為大腸桿菌菌株。由此完成本發明。
本發明的目的是提供生產L-胺基酸的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)家族的細菌，其具有活性增強的任意木糖利用酶。
本發明進一步的目的是提供上述細菌，其中該細菌屬於埃希氏菌屬(Escherichia)。
本發明進一步的目的是提供上述細菌，其中該細菌屬於泛菌屬(Pantoea)。
本發明進一步的目的是提供上述細菌，其中所述木糖利用酶活性通過增加xylABFGHR基因座的表達量而增強。
本發明進一步的目的是提供上述細菌，其中所述木糖利用酶活性通過增加xylABFGHR基因座的拷貝數或修飾基因的表達調控序列以增強基因的表達而提高。
本發明進一步的目的是提供上述細菌，其中拷貝數通過用含有xylABFGHR基因座的低拷貝載體轉化細菌而增加。
本發明進一步的目的是提供上述細菌，其中xylABFGHR基因座源自屬於埃希氏菌屬(Escherichia)的細菌。
本發明進一步的目的是提供一種生產L-胺基酸的方法，其包括在含有葡萄糖和戊糖混合物的培養基中培養上述細菌，以及從培養基中收集L-胺基酸。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中戊糖是阿拉伯糖和木糖。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中糖的混合物是從纖維素生物質中獲得的糖的原材料混合物。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中生產的L-胺基酸是L-組氨酸。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中所述細菌增強表達L-組氨酸生物合成相關基因。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中生產的L-胺基酸是L-蘇氨酸。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中所述細菌增強表達L-蘇氨酸生物合成相關基因。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中生產的L-胺基酸是L-賴氨酸。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中所述細菌增強表達L-賴氨酸生物合成相關基因。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中生產的L-胺基酸是L-穀氨酸。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中所述細菌增強表達L-穀氨酸生物合成相關基因。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中生產的L-胺基酸是L-色氨酸。
本發明進一步的目的是提供上述方法，其中所述細菌增強表達L-色氨酸生物合成相關基因。
該生產L-胺基酸的方法包括通過發酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產L-組氨酸。而且，該生產L-胺基酸的方法包括通過發酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產L-蘇氨酸。而且，該生產L-胺基酸的方法包括通過發酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產L-賴氨酸。而且，該生產L-胺基酸的方法包括通過發酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產L-穀氨酸。而且，該生產L-胺基酸的方法包括通過發酵葡萄糖和戊糖，如阿拉伯糖和木糖的混合物生產L-色氨酸。用作發酵原材料的上述葡萄糖和戊糖混合物可以從未充分利用的植物生物質資源，如纖維素生物質，優選纖維素的水解產物中獲得。
附圖簡述

圖1顯示大腸桿菌菌株MG1655的染色體上xylABFGHR基因座的結構。圖中箭頭指示PCR引物的位置。
優選實施方案的說明本發明中，「L-胺基酸生產菌」表示一種細菌，其在本發明所述細菌培養於培養基中時，能夠引起培養基中L-胺基酸的累積。通過繁育可以賦予或增強L-胺基酸的生產能力。在此術語「L-胺基酸生產菌」也表示與野生型或親代菌株相比能夠產生並且在培養基中累積更多L-胺基酸的細菌，優選表示該微生物能夠產生並且在培養基中累積不少於0.5g/L，更優選不少於1.0g/L的目的L-胺基酸。「L-胺基酸」包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬醯胺酸、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-穀氨酸、L-穀氨酸鹽、L-氨基乙酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯基丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-纈氨酸。
腸桿菌科(enterobacteriaceae)家族包括屬於埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐氏桿菌屬(Erwinia)、克雷伯桿菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、Photorhabdus、普魯維登斯桿菌(Providencia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷菌屬(Serratia)、志賀菌屬(Shigella)、摩根菌屬(Morganella)、耶爾森菌屬(Yersinia)等屬的細菌。具體地，可以使用根據NCBI(National Center for Biotechnology Information)資料庫中的分類法(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/Taxonomy/wgetorg？mode＝Treeid＝12361v1＝3keep＝1srchmode＝1unlock)分類於腸桿菌科中的細菌。優選埃希氏菌屬或泛菌屬的細菌。
術語「埃希氏菌屬細菌」表示該細菌根據微生物技術領域常規技術人員公知的分類法分類於埃希氏菌屬。用於本發明的埃希氏菌屬細菌的例子包括，但不限於大腸桿菌(E.coli)。
能夠用於本發明的埃希氏菌屬細菌未作特別限制，但是例如，Neidhardt，F.C.等所記述的細菌(Escherichia coli and Salmonella，Second Edition，Editor inChiefF.C.Neidhardt，ASM Press，Washingtong D.C.，1208，表1)包含於本發明中。術語「泛菌屬細菌」表示該細菌根據微生物技術領域常規技術人員公知的分類法分類於泛菌屬。根據對16S rRNA等的核苷酸序列分析，一些成團腸桿菌(Enterobacter agglomerans)的種現在重新分類到成團泛菌(Pantoeaagglomerans)、Pantoea ananatis、Pantoea Stewartii等中。
術語「木糖利用酶增強的活性」表示每個細胞中酶的活性高於未修飾的菌株，如野生型菌株。例子包括其中每個細胞中酶分子數量增加和每個酶分子的特異性活性增加等等。基因編碼蛋白數量的測量可以採用已知方法，包括SDS-PAGE後進行免疫印跡分析(Western blotting analysis)等。此外，用作對照的野生型菌株包括，例如大腸桿菌K-12。作為增強木糖利用酶細胞內活性的結果，可以觀察到L-胺基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸和或L-色氨酸在培養基中累積。
「木糖利用酶」包括木糖轉運、木糖異構和木糖磷酸化的酶以及調控蛋白。該酶包括木糖異構酶、木酮糖激酶、木糖轉運蛋白和木糖轉錄激活蛋白。木糖異構酶催化D-木糖到D-木酮糖的異構反應。木酮糖激酶催化D-木酮糖使用ATP生成D-木酮糖-5-磷酸鹽和ADP的磷酸化反應。木糖利用酶，如木糖異構酶、木酮糖激酶活性的存在分別取決於相應木糖異構酶陰性或木酮糖激酶陰性大腸桿菌突變體的互補作用。
術語「埃希氏菌屬細菌」表示該細菌根據微生物學領域常規技術人員公知的分類法分類於埃希氏菌屬。用於本發明的埃希氏菌屬微生物的一個實例是大腸桿菌(E.coli)。
術語「增加基因表達量」表示基因的表達量高於未修飾的菌株，如野生型菌株。這種修飾的例子包括增加每個細胞中表達基因的數量，增加基因的表達水平等。表達基因拷貝數的定量可以通過，例如限制性酶切染色體DNA後用基於基因序列的探針進行DNA印跡分析(Sourthn blotting)，螢光原位雜交(FISH)等進行測量。基因表達水平可以採用多種不同方法，包括RNA印跡分析(Northern blotting)，定量RT-PCT等測定。此外，可用作對照的野生型菌株包括，例如大腸桿菌K-12。作為增強木糖利用酶細胞內活性的結果，可以觀察到L-胺基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸和或L-色氨酸在含有戊糖，如木糖的培養基中累積。
細菌細胞內木糖利用酶活性的增強能夠通過增加所述酶編碼基因的表達實現。木糖利用有關的基因包括任何得自腸桿菌科家族細菌的基因，以及得自其它細菌如嗜熱桿菌(thermophilic Bacillus sp)的基因(Biochem，Mol.Bio.Int.，1996，39(5)，1049-1062)。優選得自埃希氏菌屬細菌的基因。
大腸桿菌木糖異構酶(EC編號5.3.1.5)的編碼基因是已知的並且標明為xylA(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號3727072到3728394，gi16131436)。木酮糖激酶(EC編號2.7.1.17)的編碼基因是已知的並且標明為xylB(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號3725546到3727000，gi16131435)。木糖結合蛋白轉運系統的編碼基因是已知的並且標明為xylF(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號3728760到3729752，gi16131437)。推定的木糖轉運系統ATP結合蛋白的編碼基因是已知的並且標明為xylG(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號3729830到3731371，gi16131438)。ABC類木糖轉運系統通透酶組分的編碼基因是已知的並且標明為xylH(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號3731349到3732530，gi16131439)。xyl操縱子轉錄調控蛋白的編碼基因是已知的並且標明為xylR(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號3732608到3733786，gi16131440)。因此，上述基因可以通過使用基於基因核苷酸序列的引物進行PCR(聚合酶鏈反應；參考White，T.J.等.，TrendsGenet.，5,185(1989))而獲得。
其它微生物的木糖利用酶編碼基因可以類似的獲得。
編碼下述蛋白(A)或(B)的DNA是大腸桿菌xylA基因的範例(A)具有SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的蛋白；或(B)具有在SEQ ID NO2所示的胺基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個或幾個胺基酸後所得的胺基酸序列，且具有木糖異構酶活性的蛋白。
編碼下述蛋白(C)或(D)的DNA是大腸桿菌xylB基因的範例(C)具有SEQ ID NO4所示的胺基酸序列的蛋白；或(D)具有在SEQ ID NO4所示的胺基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個或幾個胺基酸後所得的胺基酸序列，且具有木酮糖激酶活性的蛋白。
編碼下述蛋白(E)或(F)的DNA是大腸桿菌xylF基因的範例
(E)具有SEQ ID NO6所示的胺基酸序列的蛋白；或(F)具有在SEQ ID NO6所示的胺基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個或幾個胺基酸後所得的胺基酸序列的蛋白，其具有當L-胺基酸生產菌中蛋白量與xylAB和xylGHR基因編碼的蛋白量增加時，增加培養基中L-胺基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸和或L-色氨酸含量的活性。
編碼下述蛋白(G)或(H)的DNA是大腸桿菌xylG基因的範例(G)具有SEQ ID NO8所示的胺基酸序列的蛋白；或(H)具有在SEQ ID NO8所示的胺基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個或幾個胺基酸後所得的胺基酸序列的蛋白，其具有當L-胺基酸生產菌中蛋白量與xylAB和xylFHR基因編碼的蛋白量增加時，增加培養基中L-胺基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸和或L-色氨酸含量的活性。
編碼下述蛋白(I)或(J)的DNA是大腸桿菌xylH基因的範例(I)具有SEQ ID NO10所示的胺基酸序列的蛋白；或(J)具有在SEQ ID NO10所示的胺基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個或幾個胺基酸後所得的胺基酸序列的蛋白，其具有當L-胺基酸生產菌中蛋白量與xylAB和xylFGR基因編碼的蛋白量增加時，增加培養基中L-胺基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸和或L-色氨酸含量的活性。
編碼下述蛋白(K)或(L)的DNA是大腸桿菌xylR基因的範例；(K)具有SEQ ID NO12所示的胺基酸序列的蛋白；或(L)具有在SEQ ID NO12所示的胺基酸序列中缺失、替換、插入或增加一個或幾個胺基酸後所得的胺基酸序列的蛋白，其具有在當L-胺基酸生產菌中蛋白量與xylAB和xylFGH基因編碼的蛋白量增加時，增加培養基中L-胺基酸，如L-組氨酸、L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-穀氨酸和或L-色氨酸含量的活性。
編碼木糖異構酶的DNA包括編碼在蛋白(A)中一個或多個位置缺失、替換、插入或增加一個或幾個胺基酸，但不失去蛋白活性的蛋白的DNA。雖然「幾個」胺基酸差異的數量依賴於在蛋白三維結構中胺基酸殘基的位置和類型，對於蛋白(A)其可以為2到50，優選2到20，更優選2到10。這是因為一些胺基酸相互間具有高同源性這些胺基酸的取代不會對蛋白的三維結構和活性造成大的影響。因此，蛋白(B)相對於木糖異構酶的整個胺基酸序列具有不少於30到50％，優選50到70％，更優選70-90％，還更優選超過90％和最優選超過95％同源性，並且具有木糖異構酶活性。同樣的方法和同源性判斷可以應用於其它蛋白(C)、(E)、(G)、(I)和(K)。
為計算蛋白或DNA的同源性水平，可以使用幾種計算方法，如BLAST搜索、FASTA搜索和ClustalW。
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是程序blastp、blastn、blastx、megablast、tblastn和tblastx所使用的啟發式搜索算法；這些程序採用Karlin、Samuel和Stephen F.Altschul的統計學方法衡量其搜索結果的顯著性(「Methodsfor assessing the statistical significance of molecular sequence features by usinggeneral scoring schemes」.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，872264-68；「Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecularsequences」.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，905873-7)。FASTA搜索方法由W.R.Pearson描述(「Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA」，Methods in Enzymology，1990 18363-98)。ClustalW方法由ThompsonJ.D.，Higgins D.G.和Gibson T.J.描述(「CLUSTAL Wimproving the sensitivity ofprogressive multiple sequence alignment through sequence weighting，position-specific gap penalties and weight martrix choice」Nucleic Acids Res.1994，224673-4680)。
對(A)中定義的蛋白的變化，例如上述那些，通常是可以保持蛋白活性的保守變化。替換變化包括變化中其胺基酸序列內至少一個殘基被移除並且由不同的殘基插入到它的位置。可以替換上述蛋白中原始胺基酸，並且被認為是保守替換的胺基酸例子包括Ala替換為ser或thr；arg替換為gln、his或lys；asn替換為glu、gln、lys、his、asp；asp替換為asn、glu或gln；cys替換為ser或ala；gln替換為asn、glu、lys、his、asp或arg；glu替換為ash、gln、lys或asp；gly替換為pro；his替換為asn、lys、gln、arg、tyr；ile替換為leu、met、val、phe；leu替換為ile、met、val、phe；lys替換為ash、glu、gln、his、arg；met替換為ile、leu、val、phe；phe替換為trp、tyr、met、ile或leu；ser替換為thr、ala；thr替換為ser或ala；trp替換為phe、tyr；tyr替換為his、phe或trp；以及val替換為met、ile、leu。
獲得與(A)中定義的蛋白基本上相同的蛋白的編碼DNA可以採用，例如，通過點突變對編碼(A)中定義的蛋白的核苷酸序列進行修飾，導致一個或多個胺基酸殘基缺失、替換、插入或增加。該修飾的DNA可以通過使用產生突變的試劑或條件處理的常規方法獲得。該處理包括用羥胺處理本發明中蛋白編碼DNA，或者用UV輻射或試劑，如N-甲基-N』-氮-N-亞硝基胍或亞硝酸處理含有DNA的細菌。
編碼木糖異構酶的DNA包括由於天然的多樣性所導致的在埃希氏菌屬細菌不同菌株中發現的變異體。通過分離在嚴格條件下與xylA基因或該基因一部分雜交，且編碼具有木糖異構酶活性蛋白的DNA可獲得編碼該變異體的DNA。在此術語「嚴格條件」包括條件，在該條件下可形成所謂特異性雜交，同時不形成非特異性雜交。例如，嚴格條件包括條件，在該條件下，具有高同源性的DNA，例如相互間同源性不少於70％，優選不少於80％，更優選不少於90％，最優選不少於95％的DNA發生雜交。或者，作為嚴格條件例子的條件包括Southern雜交洗脫的常規條件，例如60℃，1×SSC，0.1％SDS，優選0.1×SSC，0.1％SDS。洗脫過程的持續時間取決於用於印跡的膜的類型以及製造商推薦的標準時間。例如，在嚴格條件下HybondTMN+尼龍膜(Amersham)的推薦洗脫持續時間為15分鐘。優選地，洗脫可以進行2到3次。核苷酸序列SEQ ID NO1的部分序列也可用作變異體編碼DNA的探針並且與xylA基因雜交。該探針可以通過PCR製備，其中以根據SEQ ID NO1核苷酸序列生產的寡核苷酸作為引物，以含有SEQ ID NO1核苷酸序列的DNA片段為模板。當以長度約為300bp的DNA片段作為探針時，雜交的洗脫條件可以為，例如，50℃，2×SSC和0.1％SDS。
獲得編碼與其它木糖利用酶基本上相同蛋白的DNA可以採用類似於上述獲得木糖異構酶的方法。
用編碼蛋白的DNA轉化細菌表示通過，例如常規方法將DNA導入細菌細胞中以增加編碼本發明所述蛋白的基因的表達並且增強細菌細胞中蛋白的活性。
本發明細菌還包括一種細菌，該菌中本發明蛋白的活性通過用編碼(A)或(B)、(C)或(D)、(E)或(F)、(G)或(H)、(I)或(J)、(K)或(L)中定義的蛋白的DNA轉化所述細菌，或通過改變細菌染色體中所述DNA的表達調控序列而得到增強。
增強基因表達的方法包括增加基因拷貝數。將基因導入能夠在埃希氏菌屬細菌中發揮功能的載體可增加基因的拷貝數。為該目的，優選使用多拷貝載體。優選地，使用低拷貝載體。低拷貝載體的例子為pSC101、pMW118、pMW119等。術語「低拷貝載體」用於表示在每個細胞中拷貝數最多為5個的載體。轉化的方法包括任何本領域技術人員已知的的方法。例如，用氯化鈣處理受體細胞以增加細胞對DNA的滲透性方法被報導可用於大腸桿菌K-12中(Mandel，M.And Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))並且可在此使用。
通過，例如，同源重組、Mu整合等方法將基因的多重拷貝導入細菌染色體中也可實現基因表達的增強。例如，一輪Mu整合可以將最多3個拷貝的基因導入細菌染色體中。
另一方面，將控制本發明DNA的天然啟動子更換為更有效的啟動子也可以實現基因表達的增強。啟動子的強度用RNA合成起始作用的頻率衡量。Deuschle，U.，Kammerer，W.，Gentz，R.，Bujard，H描述了測量啟動子強度的方法和有效啟動子的例子(Promoters in Escherichia colia hierarchy of in vivo strengthindicates alternate structures.EMBO J.1986，5，2987-2994)。例如，PR啟動子是公知的有效的組成型啟動子。其它公知的強啟動子是λ噬菌體的PL啟動子、lac啟動子、trp啟動子、trc啟動子等。
通過將更有效的Shine-Dalgarno序列(SD序列)導入本發明的DNA以替代天然SD序列可以實現翻譯的增強。SD序列是mRNA起始密碼子的上遊區域，其與核糖體的16S RNA相互作用(Shine J.and DalgamoL.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1974，71，4，1342-6)。
採用更有效的啟動子可以與增加基因拷貝數的方法結合使用。
或者，通過，例如，向啟動子中導入突變可以增強啟動子，從而提高位於啟動子下遊的基因的表達水平。此外，已知替換位於核糖體結合位點(RBS)與起始密碼子間的幾個胺基酸，尤其是，起始密碼子上遊緊鄰的序列極大地影響mRNA的可譯性。例如，發現20倍範圍的表達水平依賴於起始密碼子前面三個核苷酸的性質(Gold等.，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-403，1981；Hui等.，EMBO J.，3，623-629，1984)。
製備染色體DNA、雜交、PCR、製備質粒DNA、消化和連接DNA，轉化、選擇寡核苷酸作為引物等的方法可以為本領域技術人員公知的常規方法。這些方法記載於Sambrook，J.，and Russell D.，「Molecular Cloning A LaboratoryManual，Third Edition」，Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)等。
通過將前述DNA導入本身具有生產L-胺基酸能力的細菌可獲得本發明的細菌。或者，通過將生產L-胺基酸的能力給予已經含有該DNA的細菌可獲得本發明的細菌。
埃希氏菌屬的L-胺基酸生產菌的例子如下所述。
L-組氨酸生產菌埃希氏菌屬的具有L-組氨酸生產能力的細菌的例子包括埃希氏菌屬的L-組氨酸生產菌，如E.coli菌株24(VKPM B-5945，RU2003677)；E.coli菌株80(VKPM B-7270，RU2119536)；Ecoli菌株NRRL B-12116-B12121(US4388405)；E.coli菌株H-9342(FERM BP-6675)和H-9343(FERM BP-6676)(US6344347)；E.coli菌株H-9341(FERM BP-6674)(EP1085087)；E.coli菌株AI80/pFM201(US6258554)等。
優選地，本發明細菌被進一步修飾以增強L-組氨酸生產菌中組氨酸操縱子基因的表達，其優選包括編碼ATP磷酸核糖基轉移酶的hisG基因，使對L-組氨酸的反饋抑制靈敏度降低(俄羅斯專利2003677和2119536)。
L-蘇氨酸生產菌衍生本發明的L-蘇氨酸生產茵的親代菌株的例子包括，但是不限於，埃希氏菌屬的L-蘇氨酸生產菌，如E.coli菌株TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)(美國專利5,175,107，美國專利5,705,371)，E.coli菌株NRRL-21593(美國專利5,939,307)，E.coli菌株FERM BP-3756(美國專利5,474,918)，E.coli菌株FERM BP-3519和FERM BP-3520(美國專利5,376,538)，E.coli菌株MG442(Gusyatiner等，Genetika(in Russian)，14，947-956(1978))，E.coli菌株VL643和VL2055(EP 1148811A)等。
菌株TDH-6缺少thrC基因，以及蔗糖同化能力，並且ilvA基因具有滲漏突變。該菌株在rhtA基因也存在變異，其導致對高濃度蘇氨酸或高絲氨酸具有抗性。菌株B-3996含有質粒pVIC40，其是通過將含有變異的thrA基因的thrA*BC操縱子插入到RSF1010衍生載體中而獲得。變異的thrA基因編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I，其基本對蘇氨酸的反饋抑制不敏感。菌株B-3996於1987年11月19日保藏在全聯盟抗菌素類科學中心(Nagatinskaya Street 3-A，117105Moscow，Russian Federation)，編號為RIA1867。該菌株還於1987年4月7日保藏在俄羅斯國立工業微生物保藏中心(VKPM)(Dorozhny proezd.l，Moscow117545，Russian Federation)，編號為B-3996，分類命名為Escherichia coli Tur 6\p VIC40。
優選地，本發明的細菌進一步修飾以增強下述一個或多個基因的表達-變異的thrA基因，其編碼對蘇氨酸的反饋抑制具有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I；-thrB基因，其編碼高絲氨酸激酶；-thrC基因，其編碼蘇氨酸合酶；-rhtA基因，其編碼推定的跨膜蛋白；-asd基因，其編碼天冬氨酸-β-半醛脫氫酶；以及-aspC基因，其編碼天冬氨酸轉氨酶；編碼大腸桿菌天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因已經公開(GenBank accession NC_000913.2的序列中核苷酸編號337到2799，gi49175990)。該thrA基因位於E.coli K-12染色體上thrL和thrB基因之間。編碼大腸桿菌高絲氨酸激酶的thrB基因已經公開(GenBank accession NC_000913.2的序列中核苷酸編號2801到3733，gi49175990)。該thrB基因位於Ecoli K-12染色體上thrA和thrC.基因之間。編碼大腸桿菌蘇氨酸合酶的thtC基因已經公開(GenBank accession NC_000913.2的序列中核苷酸編號3734到5020，gi49175990)。該thrB基因位於E.coli K-12染色體上thrB基因和yaaX開放讀碼框之間。所有這三種基因共同作用成為一個獨立的蘇氨酸操縱子。
編碼對蘇氨酸的反饋抑制具有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的變異的thrA基因，以及thrB和thrC基因可以作為一個操縱子從公知質粒pVIC40中獲得，該質粒存在於大腸桿菌蘇氨酸生產菌株VKPM B-3996中。質粒pVIC40詳細記載於美國專利5,705,371中。
rhtA基因位於大腸桿菌染色體上18min靠近glnHPQ操縱子，其編碼穀氨酸轉運系統的組分，該rhtA基因與ORF1(ybiF基因，GenBank accession numberAAA218541的序列中編號764到1651，gi440181)一致，位於pexB與ompX基因之間。表達ORF1編碼蛋白的單元表示為rhtA(rht高絲氨酸和蘇氨酸抗性)基因。而且，有發現表明rhtA23基因的變異相對ATG起始密碼子為位置-1上的A換G的替換(ABSTRACTS of 17thInternational Congress of Biochemistryand Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the AmericanSociety for Biochemistry and Molecular Biology，San Francisco，California August 24-29，1997，abstruct No.457，EP1013765A)。
大腸桿菌的asd基因已經公開(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號3572511到3571408，gi16131307)，並且能夠通過使用根據基因核苷酸序列設計的引物進行PCR(聚合酶鏈反應；參考White，TJ.等，TrendsGenet.，5，185(1989))而獲得。其它微生物的asd基因可以用類似的方法獲得。
此外，大腸桿菌的aspC基因已經公開(GenBank accession NC_000913.1的序列中核苷酸編號983742到984932，gi16128895)，並且能夠通過PCR獲得。其它微生物的aspC基因可以用類似的方法獲得。
L-索賴氨酸生產菌埃希氏菌屬的L-賴氨酸生產菌的例子包括具有L-賴氨酸類似物抗性的突變體。L-賴氨酸類似物抑制埃希氏菌屬細菌的生長，但是當L-賴氨酸存在於培養基中時，這種抑制被完全或部分脫敏。L-賴氨酸類似物的例子包括，但不限於，溶菌素、賴氨酸氧肟酸鹽、S-(2-氨基乙醇)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基賴氨酸、a-氯己內醯胺等。對賴氨酸類似物具有抗性的突變體可以通過對埃希氏菌屬細菌進行常規的人工誘變處理而獲得。具體的可用於生產L-賴氨酸的菌株的例子包括大腸桿菌AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；見U.S.Patent 4,346,170)和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，L-賴氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制被脫敏。
菌株WC196可以用作大腸桿菌的L-賴氨酸生產菌。該菌株的育種是賦予衍生自大腸桿菌K-12的菌株W3110AEC抗性。獲得的菌株命名為大腸桿菌AJ13069菌株，並且於1994年12月6日保藏於生物科學和人類技術國家研究所，工業科學和技術機構(現在的高級工業科學和技術國家研究所，國際專利保藏單位，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，保藏號為FERM P-14690。而後，根據布達佩斯條約於1995年9月29日轉為國際保藏，保藏號為FERM BP-5252(美國專利5,827,698)。
L-穀氨酸生產菌衍生本發明的L-穀氨酸生產菌的親代菌株的例子包括，但不限於，埃希氏菌屬的L-穀氨酸生產菌，如E.coli菌株VL334thrC+(EP 1172433)。E.coli菌株VL334(VKPM B-1641)為thrC和ilvA基因發生突變的L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營養缺陷型菌株(美國專利4,278,765)。thrC基因的野生型等位基因通過常用的轉導方法進行轉移，該方法應用生長於野生型E.coli菌株K12(VKPM B-7)的細胞中的噬菌體P1進行接種。結果，獲得L-異亮氨酸營養缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)。該菌株能夠生產L-穀氨酸。
衍生本發明的L-穀氨酸生產菌的親代菌株的例子包括缺乏a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性或具有減弱的a+酮戊二酸鹽脫氫酶活性的突變體。缺乏a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性或具有減弱的a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性的埃希氏菌屬細菌以及獲得它們的方法記載於美國專利5,378,616和5,573,945。特別地，這些菌株包括下述E.coli W3110sucA∷KmrE.coli AJ12624(FERM BP-3853)E.coli AJ12628(FERM BP-3854)E.coli AJ12949(FERM BP-4881)通過破壞E.coli W3110的a-酮戊二酸鹽脫氫酶基因(以下表示為「sucA基因」)獲得E.coli W3110sucA∷Kmr。該菌株完全缺失a-酮戊二酸鹽脫氫酶。
其他L-穀氨酸生產菌的例子，包括缺乏a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性或具有減弱的a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性的泛菌屬突變菌株，其獲得方法如上所述。該菌株包括Pantoea ananatis AJ13356(美國專利6,331,419)。Pantoea ananatisAJ13356於1998年2月19日保藏於生物科學和人類技術國家研究所，工業科學和技術機構(現在的高級工業科學和技術國家研究所，國際專利保藏單位，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，保藏號為FERM P-16645。而後，根據布達佩斯條約於1999年1月11日轉為國際保藏，保藏號為FERM BP-6615。由於aKGDH-E1亞單位基因(sucA)被破壞，Pantoea ananatis AJ13356缺乏a-酮戊二酸鹽脫氫酶活性。當上述菌株被分離和保藏為成團腸桿菌AJ13356時，其被鑑定為成團腸桿菌(Enterobacteragglomerans)。然而，現在其根據16S rRNA等的核苷酸測序結果重新分類到Pantoea ananatis。雖然AJ13356在前述保藏單位中保藏為成團腸桿菌，本說明書中，它們記載為Pantoea ananatis。
L-色氨酸生產菌衍生本發明的L-穀氨酸生產菌的親代菌株的例子包括，但不限於，埃希氏菌屬的L-色氨酸生產菌，如缺乏trpS突變基因編碼的色氨酸-tRNA合酶的Ecoli JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(美國專利5,756,345)；具有serA等位基因不受絲氨酸反饋抑制的E.coli SV164(pGH5)(美國專利6,180,373)；缺乏色氨酸酶的E.coli AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(美國專利4,371,614)；磷酸烯醇丙酮酸鹽生產能力增強的E.coli AGX17/pGX50，pACKG4-pps(WO9708333，美國專利6,319,696)等。
過去鑑定出yddG基因編碼膜蛋白，其不參與任何L-胺基酸的生物合成途徑。此外，已知當yddG基因的野生型等位基因在微生物內的多拷貝載體中擴增時，其使得微生物具有對L-苯丙氨酸和幾種胺基酸類似物的抗性。此外，當額外的拷貝被導入相應生產菌株的細胞時，yddG基因可以增加L-苯丙氨酸或L-色氨酸的產量(WO03044192)。因此優選進一步修飾L-色氨酸生產菌從而增強yddG開放讀碼框的表達。
L-精氨酸生產菌衍生本發明的L-精氨酸生產菌的親代菌株的例子包括，但不限於，L-精氨酸生產菌，如E.coli菌株237(VKPM B-7925)(美國專利申請US2002058315)和其含有突變的N-乙醯基穀氨酸合酶的衍生菌株(俄羅斯專利申請No.2001112869)、E.coli菌株382(VKPM B-7926)(歐洲專利申請EP1170358)、導入編碼N-乙醯基穀氨酸合酶的argA基因的精氨酸生產菌株(JP 57-5693A)等。
L-苯丙氨酸生產菌衍生本發明的L-苯丙氨酸生產菌的親代菌株的例子包括，但不限於，埃希氏菌屬的L-苯丙氨酸生產菌，如E.coli AJ12739(tyrA∷Tn10，tyrR)(VKPMB-8197)；含有pheA34基因的Ecoli HW1089(ATCC 55371)(U.S.Patent5,354,672)；Ecoli MWEC101-b(KR8903681)；E.coli NRRL B-12141，NRRL B-12145，NRRL B-12146和NRRL B-12147(U.S.Patent 4,407,952)。此外，作為親代菌株，可以使用E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566)，E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)，E.coli K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)以及命名為AJ12604(FERM BP-3579)的E.coli K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB](EP 488424 B1)。此外，可以使用yedA基因或yddG基因編碼蛋白活性增強的埃希氏菌屬的L-苯丙氨酸生產菌(美國專利申請2003/0148473 A1和2003/0157667 A1)。
L-半胱氨酸生產菌衍生本發明的L-半胱氨酸生產菌的親代菌株的例子包括，但不限於，埃希氏菌屬的L-半胱氨酸生產菌，如用不同的編碼反饋抗性絲氨酸醯基轉移酶的cysE等位基因進行轉化的E.coli菌株JM15(美國專利6,218,168，俄羅斯專利申請2003121601)；過表達編碼細胞毒性分泌蛋白的基因的E.coli菌株W3110(美國專利5,972,663)；具有較低半胱氨酸去硫化酶活性的E.coli菌株(JP 11-155571A)；增強cysB基因編碼的半胱氨酸調節子陽性轉錄調節蛋白活性的E.coli菌株W3110(WO0127307A1)等。
L-亮氨酸生產菌衍生本發明的L-亮氨酸生產菌的親代菌株的例子包括，但不限於，埃希氏菌屬的L-亮氨酸生產菌，如對亮氨酸類似物具有抗性的E.coli菌株，所述類似物包括β-2-噻吩丙氨酸、3-羥基亮氨酸、4-azaleucine、5，5，5-三氟亮氨酸(JP 62-34397B和JP 08-70879A)；利用WO96/06926所述基因工程方法獲得的Ecoli菌株；E.coli菌株H-9068(JP 08-70879A)等。
通過增強一個或多個涉及L-亮氨酸生物合成的基因的表達可以改善本發明的細菌。例子包括leuABCD操縱子的基因，優選為突變的leuA基因，其編碼不被L-亮氨酸反饋抑制的異丙基蘋果酸合酶(美國專利6,403,342)。此外，通過增強表達一個或多個將L-胺基酸分泌出細菌細胞的蛋白的編碼基因可以改善本發明的細菌。該基因的例子包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(俄羅斯專利申請2001117632)。
L-脯氨酸生產菌衍生本發明的L-脯氨酸生產菌的親代菌株的例子包括，但不限於，埃希氏菌屬的L-脯氨酸生產菌，如E.coli菌株702ilvA(VKPM B-8012)，其缺少ilvA基因，並且能夠生產L-脯氨酸(EP 1172433)。通過增強一個或多個涉及L-脯氨酸生物合成的基因的表達可以改善本發明的細菌。L-脯氨酸生產菌中該基因的例子包括proB基因，其編碼對L-脯氨酸反饋抑制不敏感的穀氨酸激酶(DE專利3127361)。此外，通過增強表達一個或多個將L-胺基酸分泌出細菌細胞的蛋白的編碼基因可以改善本發明的細菌。該基因的例子包括b2682和b2683基因(ygaZH基因)(EP1239041 A2)。
具有生產L-脯氨酸活性的埃希氏菌屬細菌的例子包括下述E.coli菌株NRRL B-12403和NRRL B-12404(GB專利2075056)、VKPM B-8012(俄羅斯專利申請2000124295)、記載於DE專利3127361中的質粒突變體、Bloom F.R.等描述的質粒突變體(The 15thMiami winter symposium，1983，p.34)等。
上述L-胺基酸生產菌株可以進一步採用本領域技術人員公知的各種方法進行修飾，以增強戊糖同化率或增強L-胺基酸生物合成能力。
通過擴增戊糖同化基因，對應阿拉伯糖的araFG和araBAD基因，或者通過葡萄糖同化系統(PTS和非PTS)的突變，如ptsG的突變(Nichols N.N.等Appl.Microbiol.Biotechnol.，2001，Jul.561-2，120-5)可以進一步增加戊糖利用率。
本發明的方法包括生產L-胺基酸的方法，其包括在培養基中培養L-胺基酸生產菌，使L-胺基酸在培養基中累積，以及從培養基中收集L-胺基酸的步驟，其中培養基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。另外，本發明的方法包括生產L-組氨酸的方法，其包括在培養基中培養本發明的L-組氨酸生產菌，使L-組氨酸在培養基中累積，以及從培養基中收集L-組氨酸的步驟，其中培養基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。另外，本發明的方法包括生產L-蘇氨酸的方法，其包括在培養基中培養本發明的L-蘇氨酸生產菌，使L-蘇氨酸在培養基中累積，以及從培養基中收集L-蘇氨酸的步驟，其中培養基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。另外，本發明的方法包括生產L-賴氨酸的方法，其包括在培養基中培養本發明的L-賴氨酸生產菌，使L-賴氨酸在培養基中累積，以及從培養基中收集L-賴氨酸的步驟，其中培養基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。另外，本發明的方法包括生產L-穀氨酸的方法，其包括在培養基中培養本發明的L-穀氨酸生產菌，使L-穀氨酸在培養基中累積，以及從培養基中收集L-穀氨酸的步驟，其中培養基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。另外，本發明的方法包括生產L-色氨酸的方法，其包括在培養基中培養本發明的L-色氨酸生產菌，使L-色氨酸在培養基中累積，以及從培養基中收集L-色氨酸的步驟，其中培養基中含有葡萄糖和戊糖的混合物。
戊糖，如木糖和阿拉伯糖，與己糖，如葡萄糖的混合物可以從未充分利用的生物質資源中獲得。通過蒸汽和/或濃縮的酸解、弱酸解、酶水解，如使用纖維素酶或鹼處理，從植物生物質中釋放葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和其它碳水化合物。當底物是纖維素材料時，纖維素可同時或分別水解為糖並且也發酵為L-胺基酸。由於半纖維素比纖維素更容易水解為糖，優選預水解纖維素材料，分離戊糖而後利用蒸汽、酸、鹼、纖維素酶或其結合的處理方法水解纖維素以形成葡萄糖。
本研究使用不同比率的葡萄糖/木糖/阿拉伯糖組成的混合物，以模擬可能從植物水解物中獲得的葡萄糖和戊糖原材料混合物的組成(參見實施例部分)。
在本發明中，培養基中L-胺基酸的培養、收集和純化等採用的方法類似於常規的微生物發酵生產蛋白的方法。用於培養的培養基可以為合成培養基或天然培養基，只要該培養基中含有碳源、氮源和礦物，以及如果需要，含有合適量的微生物生長所需的營養物。
碳源可包括多種可被L-胺基酸生產菌用作碳源的碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖和其它戊糖和己糖。葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和其它碳水化合物可以是從纖維素生物質中獲得的糖的原材料混合物的一部分。
本發明中適合發酵的戊糖包括，但不限於木糖和阿拉伯糖。
用作氮源，可以使用多種銨鹽如氨水和硫酸銨、其它含氮組合物如胺、天然氮源如蛋白腖、大豆水解產物和同化的發酵微生物。礦物，可以使用一磷酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸鐵、硫酸錳、氯化鈣等。需要時可在培養基中加入額外的營養物。例如，如果微生物的生長需要脯氨酸(脯氨酸缺陷型)，在培養時可以向培養基中加入足量的脯氨酸。
優選地，培養在有氧的條件下進行例如搖瓶培養，和通風條件下攪拌培養，培養溫度為20到40℃，優選30到38℃。培養基的pH值通常在5到9之間，優選在6.5到7.2之間。培養基的pH值可以用氨水、碳酸鈣、多種酸、多種鹼和緩衝液進行調節。通常，培養1到5天可以在液體培養基中產生目的L-胺基酸的累積。
培養後，通過離心或膜過濾從液體培養基中除去固體物質如細胞，而後採用離子交換、濃縮和結晶方法收集和純化目的L-胺基酸。
實施例本發明將通過關於下面的非限制性實例進行更確切的解釋。
實施例1.從E.coli菌株MG1655的染色體克隆xvlABFGHR基因座根據E.coli菌株MG1655的基因組分析，基因xylABFGHR可以被克隆為全部556個HindIII染色體片段中的一個獨立的HindIII片段(13.1kb)(圖1)。為此目的，用載體pUC19建立了基因文庫，含有該尺寸插入物的該載體能夠在E.coli中存活。
為建立這樣的文庫，MG1655的染色體DNA用HindIII限制性酶切消化並且pUC19載體用XbaI限制性酶切消化。菌株MG1655(ATCC47076，ATCC700926)可以從美國典型培養物保藏中心(10801 University Boulevard，Manassas，VA.，20110-2209，U.S.A)得到。
為了防止自連，兩DNA產物的粘性末端隨後均被Klenow片段補齊(兩鹼基填補)。在連接步驟之後，得到重組的pUC19質粒庫。庫的大小大於200000克隆。基因庫使用與質粒序列互補的引物和與克隆染色體片段互補的引物通過PCR進行分析。在PCR產物中沒有發現具有適當分子量的DNA片段，其說明建立的庫中遺漏與xylABFGHR操縱子相應的片段。這個結果可能是由於malS基因、yiaA以及yiaB ORFs(未知其功能)的負面影響，其也存在於HindIII目的片段中。另外一個負面選擇可能的原因是Xyl-基因座太大。為了克服這個問題，基於修飾的pUC19質粒建立了新的基因庫。主要的方法是克隆Xyl-基因座作為不含有相鄰的malS基因和yiaA和yiaB ORFs的一組片段。
為此目的，通過插入合成的含有MluI限制位點的DNA片段來修飾質粒pUC19的多接頭。用修飾的pUC19克隆載體建立兩個基因庫。第-個庫的建立是通過用HindIII和MluI限制性酶消化菌株MG1655的染色體DNA和修飾的pUC19而後連接。庫的容量4,000餘個克隆。基因庫用與質粒序列互補的引物和與xyl基因座的xylABFG片段互補的引物1(SEQ ID NO13)和2(SEQID NO14)進行PCR分析。在PCR產物中發現了具有合適分子量的預期DNA片段。接下來的步驟是用目的片段飽和基因庫。在這之後，從源基因庫中得到的DNA用內切核酸酶消化，在其目的片段中不存在限制性位點。有Eco1471、KpnI、MlsI、Bst1107I。在富集後的庫中的目的質粒的頻率為1/800克隆。富集後的庫如上文所述通過PCR分析。在五個連續的庫細胞群的富集後，僅發現了10個含有xylABFG基因的克隆。所得到的含有基因xylABFG的HindIII-MluIDNA片段的質粒命名為pUC19/xylA-G。隨後含有yiaA和yiaB ORFs的HindIII-Mph1103I片段從質粒pUC19/xylA-G中除去；通過Klenow片段補齊粘性末端並且通過連接反應插入含有EcoRI限制位點的合成接頭。這樣，獲得了質粒pUC19/xylA-G-2。然後，所得的pUC19/xylA-G-2質粒用EheI限制性酶切斷；通過Klenow片段補齊粘性末端並且通過連接反應插入含有HindIII限制位點的合成接頭。這樣獲得了pUC19/xylA-G-3。HindIII限制性位點插入餘下的含有xylHR基因的DNA片段，得到完整的xyl基因座。
第二個庫的建立是通過用PstI和MluI限制性酶消化菌株MG1655的染色體DNA和修飾的pUC19而後連接。庫的容量6,000餘個克隆。基因庫用與質粒序列互補的引物和與染色體片段克隆互補的引物3(SEQ ID NO15)和4(SEQ ID NO16)進行PCR分析。在PCR產物中發現了具有合適分子量的預期DNA片段。接下來的步驟為通過PCR分析對已知大小的基因庫在細胞群上的連續細分。在庫的七個連續細分之後含有基因xylHR的細胞群包含僅十個克隆。在這個群中，通過限制性分析發現了目的DNA片段。所得到的含有xylHR基因的HindIII-MluI DNA片段的質粒被命名為pUC19/xylHR。隨後，從質粒pUC19/xylHR中得到的HindIII-MluI DNA片段連接到之前已經通過HindIII和MluI限制性酶處理過的pUC19/xylA-G-3質粒上。最後，獲得菌株MG1655完整的xyl基因座。得到的含有完整xylABFGHR基因座的多拷貝質粒命名為pUC19/xylA-R。
然後從pUC19/xylA-R質粒中得到的HindIII-EcoRI DNA片段重新克隆至已用HindIII和EcoRI限制性酶消化的低拷貝載體pMW119mod，得到含有完整的xylABFGHR基因座的低拷貝質粒pMW119mod-xylA-R。低拷貝載體pMW119mod從可商購的pMW119載體中通過除去PvuII-PvuII片段獲得。該片段含有多克隆位點並且為lacZ基因的主要部位。LacZ基因含有lacI抑制物的位點，其後為含有EcoRI和HindIII位點的合成接頭的插入，其對於從pUC19/xylA-R質粒中xylABFGHR基因座的插入是必須的。
實施例2使用L-組氨酸生產菌在葡萄糖和戊糖混合物中進行發酵生產L-組氨酸L-組氨酸生產E.coli菌株80是用於葡萄糖和戊糖的混合物的發酵生產L-組氨酸的菌株。E.coli菌株80(VKPM B-7270)在俄羅斯專利RU2119536中詳細描述並且已經於1999年10月15日在Russian National Collection of IndustrialMicroorganisms(Russia，113545 Moscow，1stDorozhny proezd，1)以序號VRPMB-7270保藏。隨後，其根據布達佩斯條約的規定於2004年1月12日轉為國際保藏。通過常規方法用pMW119mod-xylA-R質粒轉化菌株80，獲得菌株80/pMW119mod-xylA-R。
為獲得種子培養物，菌株80和80/pMW119mod-xylA-R均在含有2ml的含1g/l的鏈黴素的L-肉湯的40ml試管(18mm)中，27℃於旋轉振蕩器(250rpm)上生長6個小時。對菌株80/pMW119mod-xylA-R，加入100mg/l的氨苄西林。隨後，將2ml(5％)的種子物質接種至發酵培養基中。在含有2ml發酵培養基的40ml試管中在27℃於旋轉振蕩器(250rpm)上生長65個小時。
培養之後，累積在培養基中的L-組氨酸的量通過紙色譜法測定。流動相的組成如下丁醇∶醋酸酯∶水＝4∶1∶1(v/v)。用茚三酮的丙酮溶液(0.5％)作為顯示劑。結果顯示在表2中。
發酵培養基的組成(g/l)糖類(總量)100.0MamenoTN(全部氮)的0.2(大豆水解產物)L-脯氨酸 0.8(NH4)2SO425.0K2HPO42.0MgSO4·7H2O1.0FeSO4·7H2O0.01MnSO4·5H2O0.01鹽酸硫胺 0.001甜菜鹼2.0CaCO36.0鏈黴素1.0碳水化合物(葡萄糖、阿拉伯糖、木糖)、L-脯氨酸、甜菜鹼和硫酸鎂分別被滅菌。CaCO3乾熱在110℃滅菌30分鐘。滅菌前pH通過KOH調節至6.0。
從表2中可見，xylABFGHR基因座的增強表達促進了在含有木糖的培養基中培養的L-組氨酸生產E.coli菌株80的產率。
表2

實施例3.使用L-蘇氨酸生產菌在葡萄糖和戊糖混合物中進行發酵生產L-蘇氨酸L-蘇氨酸生產E.coli菌株B-3996用於評價葡萄糖和戊糖的混合物的發酵生產L-組氨酸。分別通過使用CaCl2的常規方法用pMW119mod-xylA-R質粒和載體pMW119轉化菌株B-3996，獲得菌株3996/pMW119mod-xylA-R和3996/pMW119。
Ecoli菌株B-3996和B-3996/pMW119mod-xylA-R均在含有鏈黴素(50mg/l)和氨苄西林(150mg/l)的L-瓊脂平皿中在37℃中生長12-15個小時。隨後，在含有木糖(4％)作為碳源的發酵培養基中接種一環菌株。在20×20mm試管中在2ml的含有鏈黴素(50mg/l)的發酵培養基中進行發酵。細胞在32℃在250rpm的振蕩下生長65個小時。
培養之後，累積在培養基中的L-蘇氨酸的量通過紙色譜法測定，其應用如下流動相∶丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)。用丙酮的茚三酮溶液(2％)作為顯示劑。切除掉含有L-蘇氨酸的點，L-蘇氨酸用CdCl2的0.5％的水溶液洗脫，L-蘇氨酸的量用分光光度法在540nm測定。結果在表3中顯示。
發酵培養基的組成(g/l)如下糖類(總量) 40.0(NH4)2SO424.0NaCl0.8KH2PO42.0
MgSO4·7H2O 0.8FeSO4·7H2O 0.02MnSO4·5H2O 0.02鹽酸硫胺 0.0002酵母提取物 1.0CaCO330.0葡萄糖和硫酸鎂分別被滅菌。CaCO3乾熱在180℃滅菌2小時。pH調節至7.0。滅菌後抗菌素被引入至培養基。
表3

如在表3中所示，xylABFGHR基因座的增強表達促進了培養於含有木糖的培養基中的L-蘇氨酸生產E.coli菌株B-3996/pMW119的產率。
實施例4.使用L-賴氨酸生產菌在葡萄糖和戊糖混合物中進行發酵生產L-賴氨酸L-賴氨酸生成E.coli菌株WC196ΔcadAΔldc用於評價葡萄糖和戊糖的混合物的發酵生產L-賴氨酸。菌株WC196ΔcadAΔldc從通過如美國專利5,827,698中描述的滅活通過ldcC基因和cadA基因編碼的賴氨酸脫羧酶的菌株WC196中獲得。分別通過使用CaCl2的常規方法用pMW119mod-xylA-R質粒和載體pMW119轉化菌株WC196ΔcadAΔldc，獲得菌株WC196ΔcadAΔldc/pMW119mod-xylA-R和WC196ΔcadAΔldc/pMW119。
E.coli菌株WC196ΔcadAΔldc/pMW119和WC196ΔcadAΔldc/pMW119mod-xylA-R均在含有氨苄西林(150mg/l)的L-瓊脂平皿中在37℃中生長12-15個小時。隨後，在含有木糖(4％)或木糖(2％)/葡萄糖(2％)混合物作為碳源的發酵培養基中接種一環菌株。在20×20mm試管中在2ml的發酵培養基中進行發酵。細胞在32℃在250rpm的振蕩下生長25個小時。
培養之後，累積在培養基中的L-賴氨酸的量通過紙色譜法測定，其應用如下流動相丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)。用丙酮的茚三酮溶液(2％)作為顯示劑。切除掉含有L-賴氨酸的點，L-賴氨酸用CdCl2的0.5％的水溶液洗脫，L-賴氨酸的量用分光光度法在540nm測定。結果在表4中顯示。
發酵培養基的組成(g/l)如下糖類(總量) 40.0(NH4)2SO424.0KH2PO41.0MgSO4·7H2O 1.0FeSO4·7H2O 0.01MnSO4·5H2O 0.01酵母提取物 2.0CaCO330.0葡萄糖和硫酸鎂分別被滅菌。CaCO3乾熱在180℃滅菌2小時。pH用KOH調節至7.0。滅菌後抗菌素被引入至培養基。

如在表4中所示，xylABFGHR基因座的增強表達促進了培養於含有木糖的培養基中L-賴氨酸生成E.coli菌株WC196ΔcadA Δldc/pMW119的產率。
實施例5.使用L-穀氨酸生產菌在葡萄糖和戊糖混合物中進行發酵生產L-穀氨酸。
L-穀氨酸生成E.coli菌株AJ12624用於評價葡萄糖和戊糖的混合物的發酵生產L-穀氨酸產物。分別通過使用CaCl2的常規方法用pMW119mod-xylA-R質粒和載體pMW119轉化菌株AJ12624，獲得菌株AJ12624/pMW119mod-xylA-R和AJ12624/pMW119。
E.coli菌株AJ12624/pMW119和AJ12624/pMW119mod-xylA-R均在含有氨苄西林(150mg/l)的L-瓊脂平皿中在37℃中生長12-15個小時。隨後，向含有木糖(4％)作為碳源的發酵培養基接種一環菌株。在20×20mm試管中在2ml的發酵培養基中進行發酵。細胞在32℃在250rpm的振蕩下生長48個小時。
培養之後，累積在培養基中的L-穀氨酸的量通過紙色譜法測定，其應用如下流動相丁醇∶醋酸∶水＝4∶1∶1(v/v)。用丙酮的茚三酮溶液(2％)作為顯示劑。切除掉含有L-穀氨酸的點，L-穀氨酸用CdCl2的0.5％的水溶液洗脫，L-穀氨酸的量用分光光度法在540nm測定。結果在表5中顯示。
發酵培養基的組成(g/l)糖類 40.0(NH4)2SO425.0KH2PO42.0MgSO4·7H2O 1.0鹽酸硫胺 0.0001L-異亮氨酸 0.07CaCO325.0葡萄糖和硫酸鎂分別被滅菌。CaCO3乾熱在180℃滅菌2小時。pH調節至7.2。
表5

如在表5中所示，xylABFGHR基因座的增強表達促進了在含有木糖的培養基中培養的L-穀氨酸生產E.coli菌株AJ12624/pMW119的產率。
實施例6.使用L-色氨酸生產菌在葡萄糖和戊糖混合物中進行發酵生產L-色氨酸。
L-色氨酸生成E.coli菌株SV164/pGH5用於評價葡萄糖和戊糖的混合物的發酵生產L-色氨酸。分別通過使用CaCl2的常規方法用pMW119mod-xylA-R質粒和載體pMW119轉化菌株SV164/pGH5，獲得菌株SV164/pGH5/pMW119mod-xylA-R和SV164/pGH5/pMW119。
E.coli菌株SV164/pGH5/pMW119和SV164/pGH5/pMW119mod-xylA-R均在含有四環素(30mg/l)和氨苄西林(150mg/l)的L-瓊脂平皿中在37℃中生長12-15個小時。隨後，向含有木糖(4％)或木糖(2％)/葡萄糖(2％)混合物作為碳源的發酵培養基接種一環菌株。在20×20mm試管中在2ml的發酵培養基中進行發酵。細胞在30℃在250rpm的振蕩下生長48個小時。
培養之後，累積在培養基中的L-色氨酸的量通過TLC測定。採用10×15cm的TLC平皿用不含螢光指示劑的0.11mm的Sorbfil矽膠(Stock CompanySorbpolymer Krasnodar，Russia)包被。Sorbfil平皿可以應用如下流動相顯像丙二醇∶乙烯醋酸酯∶25％液態氨∶水＝40∶40∶7∶16(v/v)。用丙酮的茚三酮溶液(2％)作為顯示劑。結果在表7中顯示。發酵培養基組合物列在表5中，但是應該組A、B、C、D、E、F和H之間分別滅活，如所顯示的，為了避免在滅活過程中相互之間的副作用。
表6.


溶液A通過NH4OH調節PH至7.1。
表7

如在表7中所示，xylABFGHR基因座的增強表達促進了在含有木糖的培養基中培養的L-色氨酸生產E.coli菌株SV164/pGH5/pMW119的產率。
雖然本發明用其優選的實施方式詳細描述，顯然對所屬領域的技術人員而言可以進行各種變換，以及在不背離本發明的範圍下的等同物的替換。每一個前述文件在此均全文引用作為參考。
序列表110Ajinomoto Co.，Inc.
120使用木糖利用基因表達增強的細菌進行發酵以生產L-胺基酸的方法130OP-C5007140
141
150RU20041075481512004-03-16150US60/6105451512004-09-1716016170PatentIn Ver.2.121012111323212DNA213大腸桿菌220
221CDS222(1)..(1323)4001atg caa gcc tat ttt gac cag ctc gat cgc gtt cgt tat gaa ggc tca48Met Gln Ala Tyr Phe Asp Gln Leu Asp Arg Val Arg Tyr Glu Gly Ser1 5 10 15aaa tcc tca aac ccg tta gca ttc cgt cac tac aat cec gac gaa ctg96Lys Ser Ser Asn Pro Leu Ala Phe Arg His Tyr Asn Pro Asp Glu Leu20 25 30gtg ttg ggt aag cgt atg gaa gag cac ttg cgt ttt gcc gcc tgc tac144Val Leu Gly Lys Arg Met Glu Glu His Leu Arg Phe Ala Ala Cys Tyr35 40 45
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221CDS222(1)..(1455)4003
atg tat atc ggg ata gat ctt ggc acc tcg ggc gta aaa gtt att ttg48Met Tyr Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Ser Gly Val Lys Val Ile Leu1 5 10 15ctc aac gag cag ggt gag gtg gtt gct gcg caa acg gaa aag ctg acc96Leu Asn Glu Gln Gly Glu Val Val Ala Ala Gln Thr Glu Lys Leu Thr20 25 30gtt tcg cgc ccg cat cca ctc tgg tcg gaa caa gac ccg gaa cag tgg144Val Ser Arg Pro His Pro Leu Trp Ser Glu Gln Asp Pro Glu Gln Trp35 40 45tgg Cag gca act gat cgc gca atg aaa gct ctg ggc gat cag cat tct192Trp Gln Ala Thr Asp Arg Ala Met Lys Ala Leu Gly Asp Gln His Ser50 55 60ctg cag gac gtt aaa gca ttg ggt att gcc ggc cag atg cac gga gca240Leu Gln Asp Val Lys Ala Leu Gly Ile Ala Gly Gln Met His Gly Ala65 70 75 80acc ttg ctg gat gct cag caa cgg gtg tta cgc cct gcc att ttg tgg288Thr Leu Leu Asp Ala Gln Gln Arg Val Leu Arg Pro Ala Ile Leu Trp85 90 95aac gac ggg cgc tgt gcg caa gag tgc act ttg ctg gaa gcg cga gtt336Asn Asp Gly Arg Cys Ala Gln Glu Cys Thr Leu Leu Glu Ala Arg Val100 105 110ccg caa tcg cgg gtg att acc ggc aac ctg atg atg ccc gga ttt act384Pro Gln Ser Arg Val Ile Thr Gly Asn Leu Met Met Pro Gly Phe Thr115 120 125gcg cct aaa ttg cta tgg gtt cag cgg cat gag ccg gag ata ttc cgt432Ala Pro Lys Leu Leu Trp Val Gln Arg His Glu Pro Glu Ile Phe Arg130 135 140caa atc gac aaa gta tta tta ccg aaa gat tac ttg cgt ctg cgt atg480Gln Ile Asp Lys Val Leu Leu Pro Lys Asp Tyr Leu Arg Leu Arg Met145 150 155 160acg ggg gag ttt gcc agc gat atg tct gac gca gct ggc acc atg tgg528Thr Gly Glu Phe Ala Ser Asp Met Ser Asp Ala Ala Gly Thr Met Trp165 170 175
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220
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223人造序列的說明引物40016tgtgcggtta tccatcgctg c2權利要求
1.腸桿菌科(Enterobacteriaceae)家族的L-胺基酸生產菌，該細菌具有任意的木糖利用酶的增強的活性。
2.根據權利要求1所述的細菌，其中該細菌屬於埃希氏菌屬(Escherichia)。
3.根據權利要求1所述的細菌，其中該細菌屬於泛菌屬(Pantoea)。
4.根據權利要求1所述的細菌，其中木糖利用酶活性通過增加xyLABFGHR基因座的表達量而增強。
5.根據權利要求4所述的細菌，其中木糖利用酶活性通過增加xyLABFGHR基因座的拷貝數或修飾表達調控序列以增強基因的表達而增強。
6.根據權利要求5所述的細菌，其中拷貝數通過用含有xyLABFGHR基因座的低拷貝載體轉化細菌而增加。
7.根據權利要求1至6任一項所述的細菌，其中xyLABFGHR基因座來自埃希氏菌屬細菌。
8.生產L-胺基酸的方法，該方法包括在含有葡萄糖和戊糖混合物的培養基中培養權利要求1至7中任一項所述細菌，並且從培養基中收集L-胺基酸。
9.根據權利要求8所述的方法，其中戊糖是阿拉伯糖和木糖。
10.根據權利要求8所述的方法，其中糖的混合物是從纖維素生物質中獲得的糖的原材料混合物。
11.根據權利要求8所述的方法，其中生產的L-胺基酸是L-組氨酸。
12.根據權利要求11所述的方法，其中該細菌增強表達L-組氨酸生物合成相關基因。
13.根據權利要求8所述的方法，其中生產的L-胺基酸是L-蘇氨酸。
14.根據權利要求13所述的方法，其中該細菌增強表達L-蘇氨酸生物合成相關基因。
15.根據權利要求8所述的方法，其中生產的L-胺基酸是L-蘇氨酸。
16.根據權利要求15所述的方法，其中該細菌增強表達L-賴氨酸生物合成相關基因。
17.根據權利要求8所述的方法，其中生產的L-胺基酸是L-色氨酸。
18.根據權利要求17所述的方法，其中該細菌增強表達L-穀氨酸生物合成相關基因。
19.根據權利要求8所述的方法，其中生產的L-胺基酸是L-色氨酸。
20.根據權利要求19所述的方法，其中該細菌增強表達L-色氨酸生物合成相關基因。
全文摘要
公開了一種生產L－胺基酸，如L－組氨酸、L－蘇氨酸、L－賴氨酸、L－穀氨酸和L－色氨酸的方法，其中使用埃希氏菌屬細菌，該細菌中編碼木糖利用酶的基因，如xylABFGHR基因座的表達量增加。該方法包括在含有木糖的培養基中培養L－胺基酸生產菌，並且從培養基中收集L－胺基酸。
文檔編號C12N15/69GK1749390SQ20051007624
公開日2006年3月22日 申請日期2005年5月13日 優先權日2004年9月17日
發明者A·N·馬辰科, S·V·伯內沃倫斯基, E·V·克亞奇科, Y·I·科滋洛夫, E·B·沃羅斯洛瓦, M·M·古斯亞蒂納 申請人:味之素株式會社