雙重螢光pcr－改良分子信標檢測食源性致病菌的方法

2023-04-25 00:34:16 1

專利名稱:雙重螢光pcr－改良分子信標檢測食源性致病菌的方法
技術領域：
本發明涉及螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法。
背景技術：
食源性疾病發病率較高，例如霍亂弧菌引起霍亂，傷寒沙門氏菌和志賀氏菌分別引起傷寒和痢疾。霍亂、傷寒、痢疾屬我國的重點傳染病。副溶血弧菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、變形桿菌等引起的食物中毒，其發病率在我國食源性疾病發病率中佔較高的比例。目前這些食源性致病菌仍以傳統細菌分離培養和鑑定的方法進行檢測。這種傳統檢測方法操作繁瑣，耗時耗力，一般需5天時間，最長的還需要一個月的時間，而且生化試驗和血清學試驗不穩定；檢測靈敏度較低。
隨著分子生物學技術的發展，人們採用PCR技術應用於細菌的診斷。例如中國專利公開號為CN1526825的專利申請，披露了一種利用副溶血弧菌pR72H序列的特異性，通過DNA提取、PCR擴增、電泳觀察等現代分子生物學手段檢測副溶血弧菌的方法。然而該PCR技術易汙染，造成檢測失敗，還需電泳。自1995年美國PE公司提出實時PCR檢測原理後，實時PCR以其快速、定量、無需後電泳、無交叉汙染等突出優點而被廣泛採用。
分子信標是1996年Tyagi等提出來的一種具有頸環構型的分子探針，是基於核酸鹼基配對原則和螢光共振能量現象設計的，在PCR擴增的退火階段，分子信標與生成的靶序列結合發出螢光，在延伸階段，則脫離靶序列而不幹擾擴增，隨著循環次數的增加，與模板結合的分子信標的量亦增加，最終的螢光強度與模板量成正比。
但目前所採用的實時PCR方法為單一螢光PCR方法，只能檢測一種致病菌，且檢測速度和靈敏度仍不能滿足要求。隨著生態環境的變化和抗生素的濫用，許多致病菌引起的臨床症狀越來越不典型，常常需要同時檢測多種細菌才能確定病原。這就對快速診斷技術提出了更高的要求又快又能同時檢測多種病原微生物。因此急需開發同時快速診斷多種細菌的方法。

發明內容
為了克服現有技術操作繁瑣、耗時長等缺點，以及不能同時快速地檢測多種食源性致病菌的缺陷而提供一種雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法。
為解決上述技術問題，本發明的技術方案是，一種雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，根據待測兩種致病菌的特異基因序列設計一對引物1和改良分子信標探針1，以及一對引物2和改良分子信標探針2，採用螢光PCR-改良分子信標擴增待測兩種致病菌特異基因的序列，利用分子信標與擴增產物的雜交，檢測反應體系的螢光強度，以達到設定的閾值時所需的循環次數Ct值作為結果判斷的標準，Ct值為0或40陰性；Ct小於38陽性。
螢光PCR-改良分子信標擴增基因序列的反應體系為1×PCR緩衝液MgCl20.5～5mmoldNTP各 0.05～1.5mmol引物1 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol引物2 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol探針1 0.1～1.0μmol探針2 0.1～1.0μmolTaq酶 0.2～10U模板 1～20μl總體積 20～100μl所述螢光PCR-改良分子信標擴增特異基因序列的反應條件是90～100℃預變性3～10分鐘，40～50個循環中92～95℃變性15～60秒，50～60℃退火15～60秒，70～72℃延伸15～120秒。
所述檢測的食源性致病菌為選自霍亂弧菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌，以及O157H7大腸桿菌中的一種或兩種的組合。
所述致病菌的特異基因序列分別為霍亂弧菌腸毒素基因ctxA序列、副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因TDH序列、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因NUC、單增李斯特氏菌的溶血素基因hly的序列、沙門氏菌的侵襲基因ivnA序列、志賀氏菌的編碼侵襲性質粒抗原H基因ipaH序列，以及O157H7大腸桿菌的溶血素基因rfbE序列。
所述改良分子信標的引物和探針分別為ctxA基因的一對引物ctxA-F5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，ctxA-R5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′ctxA基因的探針HEX-5′-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，TDH基因的一對引物TDH-F5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，TDH-R5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，TDH基因的探針FAM 5′-CCGGGGTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，NUC基因的一對引物NUC-F5』-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3』NUC-L5』-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3』NUC基因的探針ROX-5』-CGATGCAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3』-DABCYLhly基因的一對引物hly-F5』-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3』hly-L5』-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3』hly基因的探針
FAM-5』-CGCGCTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3』-DABCYLinvA基因的一對引物invA-F5』-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3』invA-L5』-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3』invA基因的探針5』-FAM-CCGCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3』ipaH基因的一對引物ipaH-F5』-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3』ipaH-L5』-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3』ipaH基因的探針CY55』-CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3』-DABCYLrfbE基因的一對引物rfbE-L5』-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3』rfbE-R5』-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3』rfbE基因的探針5』-FAMCGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3』，其中劃線部分為改良分子信標探針的靶序列。
所述的雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，還進一步包括對待測樣品處理和模板提取步驟。
所述樣品包括食品樣品、糞便、嘔吐物標本，其中處理糞便、嘔吐物標本及提取模板是根據糞便和嘔吐物量的多少，用100-200μL生理鹽水懸浮，煮沸，10000rpm離心2分鐘，取5μL上清液即可用於實時PCR反應；食品樣品的處理和模板的提取是將食品樣品在針對待測細菌的增菌液中增菌後，共取1.2mL增菌液10000rpm離心5分鐘，棄其上清液後，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用於實時PCR反應；或棄其上清液後加入裂解液裂解，經酚-氯仿抽提，且乙醇沉澱後，加入20μL水溶解，取5μL溶液用於實時PCR反應。
本發明的有益效果是本發明在改良分子信標技術的基礎上，建立了雙重實時PCR同時檢測兩種細菌的方法，此方法(1)根據不同需要，可隨機組合兩種細菌同時進行檢測；(2)靈敏度高，樣品含32-100cfu/ml細菌即可檢出；(3)特異性強，與對照組十幾種細菌無交叉反應；(4)操作簡單，結果觀察直觀明了，可一次檢測96份標本(含陰陽性對照)；(5)檢測速度快，檢測大便和嘔吐物標本僅需2小時檢測時間，檢測食品樣品僅需1-2天時間(包括樣品的前期處理)。



圖1至圖3為本發明螢光PCR-改良分子信標檢測曲線圖。
具體實施方式
本發明以7種食源性致病菌的檢測為例，可隨機兩兩組合，來分析雙重螢光PCR-改良分子信標的檢測方法，從而實現快速準確地同時檢測兩種致病菌。
改良分子信標探針是為了提高雜交效率，在原來分子信標原理基礎上提出的。改良分子信標的突出特點是將分子信標的臂部分也作為靶識別序列，而不僅僅是用於形成髮夾結構的無關添加序列。對於同樣長度的檢測靶序列，改良分子信標比分子信標更短，而且由於臂序列不再懸空，因而與靶序列的結合更趨緊密。改良分子信標比分子信標更易設計且成功率更高，同時對擴增條件要求不嚴格，因此對於多個靶序列的同時檢測，改良分子信標的優勢更加明顯。
根據GenBank公布的7種食源性致病菌的毒素基因或侵襲基因的保守序列，即霍亂弧菌的ctxA、副溶血弧菌的TDH、沙門氏菌的invA、志賀氏菌的ipaH、金黃色葡萄球菌的NUC和單增李斯特氏菌的hly基因，O157H7大腸桿菌的溶血素基因rfbE，分別設計引物和改良分子信標探針，用不同的螢光劑標記7條探針，同時以十幾種細菌作對照，建立螢光PCR-改良分子信標檢測7種食源性致病菌的反應體系。並將此檢測體系應用於常見細菌性食物中毒的快速診斷。用雙重螢光PCR檢測食源性致病菌的方法主要包括以下步驟(1)根據GenBank公布的食源性致病菌的毒素基因或侵襲基因的保守序列，分別設計引物和改良分子信標探針；(2)待測樣品處理和模板提取；(3)螢光PCR擴增；(4)檢測螢光信號，以達到設定的閾值時所需的循環次數Ct值作為結果判斷的標準。
其中步驟(2)樣品處理和模板提取，樣品適用範圍包括食品樣品、糞便、嘔吐物等標本。對於糞便、嘔吐物標本，根據糞便和嘔吐物量的多少，用100-200μL生理鹽水懸浮，煮沸，10000rpm離心2分鐘，取5μL上清液即可用於實時PCR反應。食品樣品的處理和模板的提取是將食品樣品在針對待測細菌的增菌液中增菌後，取1mL增菌液於10000rpm離心5分鐘，棄其上清液後，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用於實時PCR反應；或棄其上清液後加入裂解液裂解，經酚-氯仿抽提，且乙醇沉澱後，加入20μL水溶解，取5μL溶液用於實時PCR反應。
步驟(3)的螢光PCR擴增的反應體系為1×PCR緩衝液MgCl20.5～5mmoldNTP各 0.05～1.5mmol引物1 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol引物2 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol探針1 0.1～1.0μmol探針2 0.1～1.0μmolTaq酶 0.2～10U模板 1～20μl總體積 20～100μl
以上試劑組分10×PCR緩衝液，MgCl2，Taq酶，dNTP均購自中國大連寶生物公司。反應條件是94～95℃預變性3～10分鐘，40個循環中94～95℃變性15～30秒，50～55℃退火15～30秒，72℃延伸15～30秒。
步驟(4)檢測螢光信號的Ct值，是採用iCycler實時PCR擴增儀(Bio-Rad公司)或MX4000螢光PCR擴增儀退火階段檢測螢光，一次可檢測96份樣品(包括陰陽對照)。根據螢光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結果Ct值為0或40表示呈陰性；Ct小於38表示呈陽性；Ct在38-40之間時，樣品需重新檢測。檢測大便和嘔吐物標本僅需2小時檢測時間，檢測食品標本僅需1-2天時間(包括樣品的前期處理)。
例一本例中以雙重螢光PCR-改良分子信標檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌為例。根據GenBank公布的霍亂弧菌腸毒素基因(ctxA)的序列和副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因(TDH)序列並比較分析，分別設計一對引物和探針。
ctxA基因的引物1和探針1ctxA-F5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，ctxA-R5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′ctxA-ProbeHEX-5′-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，TDH基因的引物2和探針2TDH-F5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，TDH-L5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，TDH-ProbeFAM 5′-CCGGGGTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，試驗用菌株12種細菌共104株菌株。包括1株沙門氏菌(Salmonella)、1株志賀氏菌(Shigella)、5株產毒性大腸桿菌(EnterotoxinEscherichia coli)(1株菌株血清學試驗為陽性，4株菌株血清學試驗和腸毒素試驗陽性)、1株金黃色葡萄球菌(S.aureus)、1株蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、1株李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、1株溶藻弧菌(V.algionolyticus)、1株河弧菌(V.fluvialis)、1株創傷弧菌(V.vulnificus)、1株變形桿菌(Proteus)、40株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和50株霍亂弧菌(V.cholera)。溶藻弧菌和創傷弧菌由廣東省疾病預防控制中心微生物檢驗所提供，其餘菌株均購自中國藥品生物製品檢定所。霍亂弧菌的分離鑑定和腸毒素實驗按照《霍亂防治手冊》(1999年版)操作。其他11種細菌的分離和鑑定以及產毒性大腸桿菌的腸毒素試驗均按照中華人民共和國頒布的《食品微生物學》國家檢驗標準操作。
利用上述PCR體系同時檢測霍亂弧菌和副溶血弧菌的方法還包括以下步驟(1)樣品處理和模板提取樣品適用範圍包括食品樣品、糞便、嘔吐物等標本，糞便、嘔吐物標本的處理及提取方法與前述方法相同；食品樣品25g食品放在225mL鹼性蛋白腖水中增菌6-8小時後，取1mL增菌液，10000rpm離心5分鐘，棄取上清液，加入30μL水溶解，煮沸，取5μL上清液用於實時PCR反應。
(2)螢光PCR擴增，其反應體系為1×PCR緩衝液MgCl22.5μLdNTP各 1.5mmol引物1 0.05mmol引物2 0.2μmol+0.2μmol探針1 0.2μmol探針2 0.2μmolTaq酶 1U模板 10μl總體積 25μl
實時PCR反應條件為95℃預變性5分鐘，45個循環中94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)檢測採用iCycler實時PCR擴增儀(Bio-Rad公司)退火階段檢測螢光，將含反應液的PCR管逐一放到螢光PCR擴增儀進行檢測。根據螢光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結果Ct值為0或40陰性；Ct小於38陽性；Ct在38-40之間樣品需重新檢測，儀器檢測時間2小時。
用本例的雙重螢光PCR-改良分子信標檢測含霍亂弧菌和/或副溶血弧菌的體系。圖1(a)為不含霍亂弧菌或副溶血弧菌的空白體系的螢光PCR擴增儀測定的螢光強度曲線，圖1(b)為雙重螢光PCR檢測同時含有霍亂弧菌和副溶血弧菌的螢光強度曲線，圖1(c)為螢光PCR檢測含有霍亂弧菌的螢光強度曲線，圖1(d)為雙重螢光PCR檢測含有副溶血弧菌的螢光強度曲線。由圖1比較分析，雙重螢光PCR檢測兩種細菌，無交叉反應，相互之間沒有幹擾和抑制作用，螢光信號沒有減弱，且特異性強。
共採集148份樣品，48份食物中毒樣品和100份海產品。148份樣品用前述雙重螢光PCR進行檢測，同時採用傳統細菌培養方法進行驗證。螢光PCR方法和傳統檢測方法結果的符合率為100％，螢光PCR靈敏度高於傳統檢測方法。見表1。
表1 傳統檢測方法和螢光PCR檢測方法的比較


(4)特異性分析特異性檢測以沙門氏菌、志賀氏菌、產毒性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、變形桿菌、蠟樣芽孢桿菌、李斯特氏菌、溶藻弧菌、河弧菌、創傷弧菌和副溶血弧菌的DNA作對照，對霍亂弧菌和副溶血弧菌進行ctxA和TDH改良分子信標實時PCR擴增。特異性分析結果表明，只有含ctxA基因的霍亂弧菌和含TDH基因的副溶血弧菌有螢光信號，其他細菌無螢光信號，進一步證明了螢光PCR的特異性。見表2。
表2 霍亂弧菌和副溶血弧菌雙重實時PCR特異性分析


由表2可見，本發明的螢光PCR-改良分子信標探針特異性強，與對照組10種細菌無交叉反應，尤其與霍亂弧菌毒力因子相似的產毒性大腸桿菌也無交叉反應，即本例中所採用的4株腸毒素實驗為陽性的菌株也無螢光信號產生。
(5)靈敏度分析分別選1株小川型霍亂弧菌和1株副溶血弧菌作為靈敏度分析的代表株。菌液靈敏度分析菌株經鹼性蛋白腖水(APW)增菌過夜後，進行10倍稀釋，共做10個稀釋度，然後依次取10個稀釋度的1mL菌液進行實時PCR反應。同時相對應的按中華人民共和國頒布的《食品微生物檢驗標準》做細菌總數計數。本發明的螢光PCR方法靈敏度高，32-69cfu/mL細菌，即可檢出。
(6)重複性試驗分別對1株小川型霍亂弧菌和1株副溶血弧菌重複10次進行螢光PCR擴增，10次Ct值相差不到0.1個循環。
例二根據GenBank公布的沙門氏菌的侵襲基因(ivnA)和志賀氏菌的編碼侵襲性質粒抗原H基因(ipaH)的序列並比較分析，分別設計一對引物和探針。
invA基因的引物1invA-F5』-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3』invA-L5』-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3』invA基因的探針15』-FAM-CCGCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3』ipaH基因的引物2ipaH-F5』-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3』ipaH-L5』-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3』ipaH基因的探針2ROX5』-CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3』-DABCYL試劑組分10×PCR緩衝液，MgCl2，Taq酶，dNTP均購自中國大連寶生物公司。
試驗用菌株14種細菌共132株菌株。包括1株產毒性大腸桿菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)、1株侵襲性大腸桿菌(enteroinvasive E.coli，EIEC)、1株O157H7大腸桿菌(O157H7)、1株致病性大腸桿菌(enteropathogenic E.coli，EPEC)、1株枸櫞酸桿菌(Citrobacter)、1株大腸埃希氏菌E.coli、1株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、1株霍亂(V.cholera)弧菌、1株金黃色葡萄球菌(S.aureus)、1株單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、1株蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、1株變形桿菌(Proteus)、70株沙門氏菌(Salmonella)(各種血清型)、50株志賀氏菌(Shigella)(各種血清型)。所有菌株均按照中華人民共和國頒布的《食品微生物學》國家檢驗標準進行分離和鑑定。
利用上述螢光PCR方法同時檢測沙門氏菌和志賀氏菌的方法還包括以下步驟
(1)樣品處理和模板提取樣品適用範圍包括食品樣品、糞便、嘔吐物等標本；對糞便、嘔吐物標本，根據糞便和嘔吐物量的多少，用100-200μL生理鹽水懸浮，煮沸，10000rpm離心2分鐘，取5μL 上清液即可用於實時PCR反應；對於食品樣品，其中檢測沙門氏菌時，將25g食品放在225mLSC中增菌10個小時；對於志賀氏菌，將25g食品放在225mLGN中增菌10個小時，增菌後，取1mL增菌液，10000rpm離心5分鐘，棄其上清液，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用於實時PCR反應。
(2)螢光PCR擴增配製雙重螢光PCR反應體系1×PCR緩衝液MgCl22.5μLdNTP各 1.5mmol引物1 0.05mmol引物2 0.2μmol+0.2μmol探針1 0.2μmol探針2 0.2μmolTaq酶 1U模板 10μl總體積 25μl實時PCR反應條件為95℃預變性5分鐘，45個循環中94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)檢測採用iCycler實時PCR擴增儀(Bio-Rad公司)退火階段檢測螢光，一次可檢測96份樣品(包括陰陽對照)。結果判斷根據螢光PCR擴增儀顯示的Ct值判斷結果Ct值為0或40陰性；Ct小於38陽性；Ct在38-40之間樣品需重新檢測。
用前述14種細菌共132株菌株進行實驗，用本發明的單一或雙重螢光PCR方法分別檢測按前述方法配製的不含沙門氏菌或志賀氏菌空白體系、含有沙門氏菌和志賀氏菌的體系、含有沙門氏菌的體系、以及含有志賀氏菌的體系。採用iCycler實時PCR擴增儀檢測退火階段螢光，螢光強度曲線如圖2。其中，圖2(a)為空白體系的螢光PCR擴增儀測定的螢光強度曲線，圖2(b)為雙重螢光PCR檢測含有沙門氏菌和志賀氏菌的螢光強度曲線，圖2(c)為螢光PCR檢測含有沙門氏菌的螢光強度曲線，圖2(d)為螢光PCR檢測含有志賀氏菌的螢光強度曲線。由圖2比較分析，雙重螢光PCR檢測兩種細菌，無交叉反應，相互之間沒有幹擾和抑制作用，螢光信號沒有減弱，特異性強。
共採集350份樣品，包括食品樣品和食物中毒樣品。350份樣品用螢光PCR進行檢測的同時採用傳統細菌培養方法進行驗證。按上述方法對樣品進行處理及模板的提取後進行檢測，傳統檢測方法和螢光PCR檢測方法的比較見表3。
表3 傳統檢測方法和螢光PCR檢測方法的比較


雙重螢光PCR方法檢測大便和嘔吐物標本僅需2小時檢測時間，檢測食品標本僅需1天時間(包括樣品的前期處理)，可同時檢測兩種細菌。因此雙重螢光PCR方法省時省力，準確性高，可滿足疾病的快速診斷。而且，螢光PCR方法和傳統檢測方法結果的符合率為100％，螢光PCR靈敏度高於傳統檢測方法。
例三根據GenBank公布的金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因(NUC)和單增李斯特氏菌的溶血素基因(hly)的序列並比較分析，分別設計一對引物和探針。
NUC基因的一對引物1NUC-F5』-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3』NUC-L5』-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3』NUC基因的探針1ROX-5』-CGATGCAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3』-DABCYLhly基因的一對引物2hly-F5』-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3』hly-L5』-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3』hly基因的探針2FAM-5』-CGCGCTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3』-DABCYL試劑組分10×PCR緩衝液，MgCl2，Taq酶，dNTP均購自大連寶生物公司。
試驗用菌株13種細菌共85株菌株。包括1株沙門氏菌(Salmonella)(Salmonella)、1株志賀氏菌(Shigella)、1株副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、1株霍亂弧菌(V.cholera)、1株O157H7大腸桿菌(O157H7)、1株蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)、1株變形桿菌(Proteus)、1株表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、1株葡萄球菌(Staphylococcus)、1株乙型溶血性鏈球菌(Streptococcus)、20株金黃色葡萄球菌(S.aureus)、22株單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、33株非單增李斯特氏菌(Non L.monocytogenes)。所有菌株均按照中華人民共和國頒布的《食品微生物學》國家檢驗標準進行分離和鑑定。
利用雙重螢光PCR體系同時檢測金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的方法還包括以下步驟(1)樣品處理和模板提取其中樣品適用範圍包括食品樣品、糞便、嘔吐物等標本，(a)糞便、嘔吐物標本根據糞便和嘔吐物量的多少，用100-200μL生理鹽水懸浮，煮沸，10000rpm離心2分鐘，取5μL上清液即可用於實時PCR反應；(b)食品樣品金黃色葡萄球菌25g食品放在225mL 7.5％Nacl增菌液過夜；單增李斯特氏菌25g食品放在225mLLB1中增菌24小時，增菌後，取1mL增菌液，10000rpm離心5分鐘，棄其上清液，加入裂解液裂解，經酚-氯仿抽提，且乙醇沉澱後，加入20μL水溶解，取5μL溶液用於實時PCR反應。
(2)螢光PCR擴增配製雙重螢光PCR反應體系1×PCR緩衝液MgCl22.5μLdNTP各 1.5mmol引物1 0.05mmol引物2 0.2μmol+0.2μmol探針1 0.2μmol探針2 0.2μmolTaq酶 1U模板 10μl總體積 25μl實時PCR反應條件為95℃預變性5分鐘，45個循環中94℃變性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸60秒。
(3)檢測採用iCycler實時PCR擴增儀(Bio-Rad公司)退火階段檢測螢光，將含反應液的PCR管逐一放到螢光PCR擴增儀進行檢測，可一次檢測96份樣品。Ct值為0或40陰性；Ct小於38陽性；Ct在38-40之間樣品需重新檢測。
用前述13種細菌共85株菌株進行實驗，用本發明的單一或雙重螢光PCR方法分別檢測按前述方法配製的不含金黃色葡萄球菌或單增李斯特氏菌的空白體系、同時含有金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的體系、含有金黃色葡萄球菌弧菌的體系、以及含有單增李斯特氏菌的體系。採用iCycler實時PCR擴增儀檢測退火階段螢光，螢光強度曲線如圖3。其中，圖3(a)為空白體系的螢光PCR擴增儀測定的螢光強度曲線，圖3(b)為雙重螢光PCR檢測含有金黃色葡萄球菌和單增李斯特氏菌的螢光強度曲線，圖3(c)為螢光PCR檢測含有金黃色葡萄球菌弧菌的螢光強度曲線，圖3(d)為雙重螢光PCR檢測含有單增李斯特氏菌的螢光強度曲線。由圖3比較分析，雙重螢光PCR檢測兩種細菌，無交叉反應，相互之間沒有幹擾和抑制作用，螢光信號沒有減弱，特異性強。
共採集248份樣品，包括食品樣品和食物中毒樣品。248份樣品用螢光PCR進行檢測的同時採用傳統檢測方法進行驗證。樣品處理和模板提取方法與前述方法相同。傳統檢測方法和螢光PCR檢測方法的比較見表4。
表4 傳統檢測方法和螢光PCR檢測方法的比較


雙重螢光PCR方法檢測大便和嘔吐物標本僅需2小時檢測時間，檢測食品標本僅需1.5天時間(包括樣品的前期處理)，可同時檢測兩種細菌。因此雙重螢光PCR方法省時省力，準確性高，可滿足疾病的快速診斷。而且，螢光PCR方法和傳統檢測方法結果的符合率為100％，螢光PCR靈敏度高於傳統檢測方法。
例四根據GenBank公布的O157H7大腸桿菌的溶血素基因rfbE序列並比較分析，分別設計一對引物和探針rfbE基因的引物rfbE-L5』-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3』rfbE-R5』-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3』rfbE基因的探針5』-FAMCGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3』
rfbE的擴增片段為169bp。
與其它實例中的雙重螢光PCR-改良分子信標擴增體系、反應條件及結果的檢測方法相同，可同時準確地檢測O157H7與前述十幾種其它致病菌(如沙門氏菌、志賀氏菌、產毒性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽胞桿菌、單增李斯特氏菌、變形桿菌、溶血性鏈球菌、副溶血弧菌和霍亂弧菌等)的兩兩隨機組合體系，且特異性強、靈敏度高，其螢光強度曲線與圖1至3相同。
雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的檢測體系可開發成一序列快速檢測試劑盒，滿足疾病預防控制機構、檢驗檢疫部門和技術監督部門的日常檢驗和公共衛生突發事件的快速應對，具有重大的社會效益和經濟效益。
權利要求
1.一種雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，根據待測兩種致病菌的特異基因序列設計一對引物1和改良分子信標探針1，以及一對引物2和改良分子信標探針2，採用螢光PCR-改良分子信標擴增待測兩種致病菌特異基因的序列，利用分子信標與擴增產物的雜交，檢測反應體系的螢光強度，以達到設定的閾值時所需的循環次數Ct值作為結果判斷的標準，Ct值為0或40陰性；Ct小於38陽性。
2.如權利要求
1所述的雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，其特徵在於所述螢光PCR-改良分子信標擴增基因序列的反應體系為1×PCR緩衝液MgCl20.5～5mmoldNTP各 0.05～1.5mmol引物1 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol引物2 0.1～1.0μmol+0.1～1.0μmol探針1 0.1～1.0μmol探針2 0.1～1.0μmolTaq酶 0.2～10U模板 1～20μl總體積 20～100μl
3.如權利要求
1所述的雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，其特徵在於所述螢光PCR-改良分子信標擴增特異基因序列的反應條件是90～100℃預變性3～10分鐘，40～50個循環中92～95℃變性15～60秒，50～60℃退火15～60秒，70～72℃伸15～120秒。
4.如權利要求
1至3中任一項所述的雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，其特徵在於所述檢測的食源性致病菌為選自霍亂弧菌、副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌，以及O157H7大腸桿菌中的一種或兩種的組合。
5.如權利要求
4所述的雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，其特徵在於所述致病菌的特異基因序列分別為霍亂弧菌腸毒素基因ctxA序列、副溶血弧菌耐熱直接溶血素基因TDH序列、金黃色葡萄球菌的耐熱核酸酶基因NUC、單增李斯特氏菌的溶血素基因hly的序列、沙門氏菌的侵襲基因ivnA序列、志賀氏菌的編碼侵襲性質粒抗原H基因ipaH序列，以及O157H7大腸桿菌的溶血素基因rfbE序列。
6.如權利要求
5所述的雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，其特徵在於所述改良分子信標的引物和探針分別為ctxA基因的一對引物ctxA-F5′-TCCGGAGCATAGAGCTTGGA-3′，ctxA-R5′-TCGATGATCTTGGAGCATTCC-3′ctxA基因的探針HEX-5′-CCGTGGATTCATCATGCACCGCCACGG-3′Dabcyl，TDH基因的一對引物TDH-F5′-AAACATCTGCTTTTGAGCTTCCA-3′，TDH-R5′-CTCGAACAACAAACAATATCTCATCAG-3′，TDH基因的探針FAM5′-CCGGGGTGTCCCTTTTCCTGCCCCCGG-Dabcyl，NUC基因的一對引物NUC-F5』-GGCAATACGCAAAGAGGTT-3』NUC-L5』-CTTCTTCTATTTACGCCGTTATC-3』NUC基因的探針ROX-5』-CGATGCAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCG-3』-DABCYLhly基因的一對引物hly-F5』-TGCAAGTCCTAAGACGCCA-3』hly-L5』-CACTGCATCTCCGTGGTATACTAA-3』hly基因的探針FAM-5』-CGCGCTTGTATATACTTATCGATTTCATCCGCGCG-3』-DABCYLinvA基因的一對引物invA-F5』-GCGGAATATC(I)ATGACGCAGCT-3』invA-L5』-CGCTACGTTTTGCTTCACGG-3』invA基因的探針5』-FAM-CCGCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCGG-DABCYL-3』ipaH基因的一對引物ipaH-F5』-TGAAGGAAATGCGTTTCTATG-3』ipaH-L5』-AGGGAGAACCAGTCCGTAAA-3』ipaH基因的探針CY55』-CACGGCCGAAGCTATGGTCAGAAGCCGTG-3』-DABCYLrfbE基因的一對引物rfbE-L5』-AGGTGAAGGTGGAATGGTTGTC-3』rfbE-R5』-GCTTGTTCTAACTGGGCTAATC-3』rfbE基因的探針5』-FAMCGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCCG-DABCYL-3』，其中劃線部分為改良分子信標探針的靶序列。
7.如權利要求
1所述的雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，其特徵在於還進一步包括對待測樣品處理和模板提取步驟。
8.如權利要求
7所述的雙重螢光PCR-改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，其特徵在於所述樣品包括食品樣品、糞便、嘔吐物標本，其中處理糞便、嘔吐物標本及提取模板是根據糞便和嘔吐物量的多少，用100-200μL生理鹽水懸浮，煮沸，10000rpm離心2分鐘，取5μL上清液即可用於實時PCR反應；食品樣品的處理和模板的提取是將食品樣品在針對待測細菌的增菌液中增菌後，共取1.2mL增菌液10000rpm離心5分鐘，棄其上清液後，加30uL三蒸水煮沸，再取5μL上清液即可用於實時PCR反應；或棄其上清液後加入裂解液裂解，經酚-氯仿抽提，且乙醇沉澱後，加入20μL水溶解，取5μL溶液用於實時PCR反應。
專利摘要
本發明涉及一種雙重螢光PCR－改良分子信標檢測食源性致病菌的方法，根據待測兩種致病菌的特異基因序列設計對應的一對引物1和改良分子信標探針1，以及一對引物2和改良分子信標探針2，採用螢光PCR－改良分子信標擴增待測兩種致病菌特異基因的序列，利用分子信標與擴增產物的雜交，檢測反應體系的螢光強度，以達到設定的閾值時所需的循環次數Ct值作為結果判斷的標準，Ct值為0或40陰性；Ct小於38陽性。本發明的方法，靈敏度高，特異性強，操作簡單，結果觀察直觀明了，適用於任意兩種細菌隨機組合和兩種食源性致病菌的快速同時檢測以及大量樣品的檢驗。
文檔編號C12Q1/68GKCN1796569SQ200410091918
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月29日
發明者扈慶華, 李慶閣, 鄭薇薇, 石曉路, 鄭琳琳, 王冰, 莊志雄, 劉小立, 張順祥 申請人:深圳市疾病預防控制中心導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan