一種人工合成抗菌肽、製備方法及其應用的製作方法

2023-04-24 20:43:51

專利名稱：一種人工合成抗菌肽、製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物製藥領域，尤其是涉人工合成抗菌肽及其應用。
背景技術：
抗菌肽(antimicrobial peptides)作為先天免疫系統的重要部分對於保護生物 機體具有不可或缺的作用。至今，已經有超過800個抗菌肽被分離和鑑定。根據它們的氨基 酸組成和空間結構可分為(i) α-螺旋陽離子線性抗菌肽、(ii)含二硫鍵的抗菌肽、(iii) 富含某種胺基酸殘基的抗菌肽和(iv)陰離子抗菌肽。抗菌肽的抗菌活性具有選擇性高、殺 菌快速、作用廣譜和難以形成抗性的特點，使其成為研究和開發新型抗生素的理想候選。貽貝抗菌肽是海洋生物抗菌肽研究中的一個重要內容，其特殊的結構與廣譜的 抗菌功能使其具有重要的理論研究價值，同時也具有開發成為新型生物抗生素的潛力。 Mytilin是貽貝抗菌肽家族中的一類重要成員，目前已從不同種的貽貝中分離純化到5種 mytilin分子，分別為mytilinA，B, C，D和G1，是目前貽貝抗菌肽研究中發現成員最多的家 族。鑑於其在貽貝血清中的高豐度以及在體外抗菌實驗中表現出的廣譜抗菌功能，mytilin 被認為是貽貝防禦機制中最重要的一類抗菌肽分子。抗菌肽的抗菌功能與其空間結構具有密切關係，因此，針對抗菌肽的結構研究 一直受到人們的關注，也是深入了解抗菌肽結構與功能的關係及其抗菌機制的關鍵所 在。Roch等人最近對來自地中海貽貝(Mytilus galloprovincialis)的mytilin B進 行了核磁共振研究，結果表明，mytilin B的結構屬於典型的二硫鍵穩定的α/β結構 (Cysteine-stabilized-α/β)，分子中包含有一段α -螺旋和兩段β-摺疊片，由四對二 硫鍵穩定整個結構。該結構類型既不屬於抗菌肽常見的α-螺旋結構，也不屬於β-摺疊 型抗菌肽結構，是一類比較特殊的空間結構，且該結構類似於Yang等人早期對貽貝防禦素 MGD-I的空間結構研究結果。而之前通過對MGD-I的結構與功能的研究，Romestand等認為 由兩段β-摺疊片及連接這兩段β-摺疊片的環(loop)上的帶正電荷的胺基酸殘基是貽 貝抗菌肽發揮抗菌活性的關鍵部位。厚殼貽貝(Myti Ius coruscus)是我國具有重要經濟價值的養殖貽貝之 一，在前期的研究中，我們已從厚殼貽貝血清中分離純化到一種mytilin，命名為 mytilin-1 (Genebank :FJ973154)，該抗菌肽分子量為3885. 3Da，含34個胺基酸殘基，其中 包括8個半胱氨酸並形成4對二硫鍵。體外抗菌實驗中，mytilin-1對革蘭氏陽性菌及革 蘭氏陰性菌均具有顯著的抑制作用。厚殼貽貝mytilin-Ι與地中海貽貝的mytilin B具有 較高的序列相似性(64% )。目前，從生物體內提取天然抗菌肽是抗菌肽產品開發的主要思路，但天然抗菌肽 因其屬於蛋白質，具有結構不穩定，易失活等缺點。

發明內容
本發明目的在於針對現有抗菌肽結構不穩定、易失活、現有生物體內抗菌肽含量
3極低、通過基因重組表達的方法表達含有多對二硫鍵、採取人工合成的方法因天然抗菌肽 序列較長和二硫鍵較多使得合成成本太高的缺陷，根據厚殼貽貝mytilin的活性區域設計 出一種新型抗菌肽，具有分子量小、結構穩定、抗菌活性強、序列短、二硫鍵數目少、成本低 等優點。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案一種人工合成抗菌肽，其胺基酸序列為Cys-Val-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Cys-Ile-Cys ；或者為 Cys-IIe-Cys-Arg-Arg-Gly-Phe-Cys-Val-Cysο優選的方案是所述抗菌肽胺基酸序列中包含兩對二硫鍵，所述的抗菌肽具有 β-髮夾結構。更優的方案是所述抗菌肽為前兩種方案中所述的抗菌肽胺基酸序列中的一個或 幾個胺基酸的被取代，或者環化，或者L-型胺基酸變為D-型胺基酸，或者缺失，或加入而得 到的功能同等物多肽。更優的方案是所述的抗菌肽胺基酸序列中前端、中部或者末端含有前面幾種方 案任一種所述的抗菌肽胺基酸序列。本發明的目的之二在於還公開了一種人工抗菌肽的合成工藝，採用如下技術方 案一種人工合成抗菌肽的方法，包括如下步驟1)以地中海貽貝的mytilin B為模板，對厚殼貽貝mytilin-l進行空間結構模擬； 根據mytilin-l的空間結構，選擇20號丙氨酸(Ala20)到29號半胱氨酸(Cys29)之間的 十肽片段，並將Ala20及Ser22分別替換成Cys，獲得一條新的多肽，命名為MDP-I ；及其反 向序列，命名為MDP-2 ；2)採用固相合成法，利用Fmoc-Cys (trt)-OH和Fmoc-Cys (Acm)-OH分別作為一對 要形成二硫鍵的Cys合成出所需線性多肽；3)對獲得的粗製品分別以碘/甲醇/DMF中的一種或者幾種混合溶液及抗壞血酸 進行復性處理以形成正確的二硫鍵；4)對復性後的多肽樣品用反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化至少2次，獲得純品。優選的是所述步驟1)中MDP-I或者MDP-2多肽的N端設計為乙醯化，C端設計 為醯胺化以去除末端電荷。更為優選的是所述步驟2、中固相合成法工藝為21)Fm0C-Rink-AM-Resin樹脂以二氯甲烷(DCM)進行充分溶脹；取第一個9-芴甲 氧羰基(Fmoc)-胺基酸於DCM中溶解；再加入二異丙基乙胺(DIEA)混合後加入反應容器 中，吹N2反應2hr ；22)將反應液過濾除去並加入甲醇，封閉反應Ihr後分別用DCM、異丙醇及N，N-二 甲基甲醯胺(DMF)洗滌樹脂；之後用20%哌啶脫Fmoc，經DMF充分洗滌後，加第二個胺基酸 與1-羰基苯並四唑(HOBt)及DIEA混合後進行偶聯，反應一小時後，用茚三酮檢測，樹脂無 色透明為反應完全，然後以DMF充分洗滌；23)重複上述步驟直到最後一個胺基酸反應完全；24)利用K試劑(Κ-Reagent，含82. 5%的三氟乙酸，5%的苯酚，5%的苯甲硫醚，以 及2. 5%的巰基乙醇的水溶液)對合成後的多肽進行側鏈去保護以及從樹脂上切割。
本發明的目的之三在於公開了將人工合成抗菌肽在製備治療革蘭氏陽性菌、革蘭 氏陰性菌、真菌感染的藥物開發或飼料添加劑中的應用。Cys表示英文名稱為Cysteine，中文名稱為半胱氨酸的胺基酸相應殘基，簡稱為 C0Val表示英文名稱為Valine，中文名稱為纈氨酸的胺基酸相應殘基，簡稱為V。Phe表示英文名稱為!Phenylalanine，中文名稱為半胱氨酸的胺基酸相應殘基，簡 稱為F。Gly表示英文名稱為Glycine，中文名稱為甘氨酸的胺基酸相應殘基，簡稱為G。Arg表示英文名稱為Arginine，中文名稱為精氨酸的胺基酸相應殘基，簡稱為R。Ile表示英文名稱為Isoleucine，中文名稱為異亮氨酸的胺基酸相應殘基，簡稱 為I。本發明與現有技術相比，具有如下優點和效果本發明採用人工合成的方法，合成 抗菌肽跟天然抗菌肽相比具有分子量小、結構穩定、抗菌活性強、序列短、二硫鍵數目少、成 本低等優點。


附圖1 :M根據厚殼貽貝抗菌肽mytilin-Ι的活性區域設計的MDP-1以及MDP-2的 序列圖。附圖2 =MDP-I和MDP-2固相合成後的高效液相檢測圖譜。附圖3 =MDP-I和MDP-2固相合成後的質譜檢測圖譜。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步詳細說明實施例一抗菌肽的固相化學合成、分離純化及鑑定1.新型抗菌肽的人工設計利用結構模擬軟體ESyPred3D (Lambert C, Leonard N, De Bolle X，D印iereux Ε. ESyPred3D Prediction of proteins 3D structures. Bioinformatics. 2002 Sep ； 18(9) :1250-1256.)，以地中海貽貝(Mytilus galloprovincialis) ^ mytilin B(蛋白質 結構資料庫編號2EEM)為模板，對厚殼貽貝mytilin-1進行空間結構模擬。根據結構模 擬結果，我們發現，厚殼貽貝mytilin-Ι同樣具有由兩段β-摺疊片及連接這兩段β-折 疊片的環，且環上分布有鹼性胺基酸殘基，根據mytilin-Ι的空間結構，選擇20號丙氨酸 (Ala20)到四號半胱氨酸(Cys29)之間的十肽片段，並將Ala20及Ser22分別替換成Cys， 獲得一條新的多肽，命名為MDP-1，該多肽的N端設計為乙醯化，C端設計為醯胺化以去除末 端電荷，如圖 1 所示其序列為 Ac-Cys-Val-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Cys-Ile-Cys_NH2 ；同時， 我們另外設計了一條反向序列，命名為MDP-2，其序列為Ac-Cys-11 e-Cys-Arg-Arg-Gly-Ph e-Cys-Val-Cys_NH2。2.新型抗菌肽的固相合成本發明應用固相合成法(solid-phasepeptide synthesis, SPPS)，利用 Fmoc-Cys (trt)-OH(CysI 和 Cys III)和 Rnoc-Cys (Acm) _0H(Cys II 和 Cys IV)的不同性質，分別作為一對要形成二硫鍵的Cys合成出所需線性多肽，以便於二硫鍵的正確配對。固相多肽合成在Tetras多肽合成儀(美國ThuraMed公司)上進行，基本流程 為=Fm0c-Rink-AM-Resin樹脂以二氯甲烷(DCM)進行充分溶脹；取第一個9-芴甲氧羰基 (Fmoc)-胺基酸於DCM中溶解，再加入二異丙基乙胺(DIEA)混合後加入反應容器中，吹N2 反應》ir，將反應液過濾除去加入甲醇，封閉反應Ihr後分別用DCM、異丙醇及N，N- 二甲基 甲醯胺(DMF)洗滌樹脂；之後用20%哌啶脫Fmoc，經DMF充分洗滌後，加第二個胺基酸與 1-羰基苯並四唑(HOBt)及DIEA混合後進行偶聯，反應一小時後，用茚三酮檢測，樹脂無色 透明為反應完全，然後以DMF充分洗滌；重複上述步驟直到最後一個胺基酸反應完全。利用 K試劑(Κ-Reagent，含82. 5%的三氟乙酸，5%的苯酚，5%的苯甲硫醚，以及2. 5%的巰基乙 醇的水溶液)對合成後的多肽進行側鏈去保護以及從樹脂上切割。3.新型抗菌肽的復性、純化及鑑定獲得的合成粗品分別以碘/甲醇/DMF混合溶液及抗壞血酸進行復性處理以形成 正確的二硫鍵(Cys I-Cys III, Cys II-Cys IV)。復性後的多肽樣品用反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化2次。第一次純化=Waters Sunfire C18 柱(IOmmX 250mm)，洗脫梯度0 40min，5% 30% 乙腈(含 0. 1 % TFA)；第 二次純化Vydac C18 柱 6mmX 250mm)，洗脫梯度0 40min，5% 20% 乙腈(含 0. TFA)。MDP的高效液相檢測圖譜見附圖2，經兩步純化後MDP-I和MDP-2的純度均大於95 %。用Waters ZQ2000質譜儀分析目的峰的精確分子量，檢測結果見附圖3。質譜檢 測條件為毛細管電壓3. 50KV ；錐孔電壓35V ；乾燥氣流速500L/h ；離子源溫度120°C ； 輔助氣溫度380°C;離子檢測方式選擇性離子檢測(SIM)；離子極性正離子(positive)； 離子化方式氣動輔助電噴霧離子化(ESI)。經質譜分析，MDP-I和MDP-2的單同位素分子 量([M+H]+)分別為1197.34Da和1197. 46Da。與理論推導的分子量一致，表明合成及復性 的成功的。實施例二 抗菌肽的功能檢測1.新型抗菌肽的抗菌實驗及抗菌譜採用培養基倍比稀釋法測定MDP-I和MDP-2抗菌活性。細菌用LB液體培養基培 養至對數生長期(A63tlnm為0. 001)，在96孔板每個孔加入90 μ L菌液。多肽預先用PBS溶 解，最高濃度為ImM，然後倍比稀釋，最低濃度為6.25 μ Μ。並將各濃度多肽溶液加入96孔 板中，10 μ L/孔，PBS作為陰性對照。將96孔板在振蕩器上輕柔的振蕩使樣品和菌液充分混合，然後放入37°C培養 16-24h。採用酶標儀測定每個孔的OD值以衡量多肽對於細菌生長的抑制作用。多肽的最 低抑制濃度(Minimal inhibitory concentrations, MIC)用[a]-[b]表示，其中[a]代表 細菌繼續生長的最大濃度，而[b]代表細菌完全被殺滅的最低濃度。抗真菌試驗與上述基 本相同，只是真菌在Sabourand液體培養基中30°C培養4 後檢測。結果如表1所示。表1MDP-1和MDP-2對於各種細菌和真菌的最低抑菌濃度(MIC)
權利要求
1.一種人工合成抗菌肽，其特徵在於所述抗菌肽胺基酸序列為Cys-Val-Cys-Phe-Gl y-Arg-Arg-Cys-I Ie-Cys ；或者為 Cys-I Ie-Cys-Arg-Arg-Gly-Phe-Cys-Val-Cys0
2.如權利要求1所述的人工合成抗菌肽，其特徵在於所述抗菌肽胺基酸序列中包含 兩對二硫鍵，所述的抗菌肽具有髮夾結構。
3.—種人工合成抗菌肽，其特徵在於所述抗菌肽為權利要求1或者2所述的抗菌肽 胺基酸序列中的一個或幾個胺基酸的被取代，或者環化，或者L-型胺基酸變為D-型氨基 酸，或者缺失，或加入而得到的功能同等物多肽。
4.一種人工合成抗菌肽，其特徵在於所述的抗菌肽胺基酸序列中前端、中部或者末 端含有權利要求1-3任一項所述的抗菌肽胺基酸序列。
5.一種人工合成抗菌肽的方法，包括如下步驟1)以地中海貽貝的mytilinB為模板，對厚殼貽貝mytilin-Ι進行空間結構模擬；根 據mytilin-Ι的空間結構，選擇20號丙氨酸(Ala20)到四號半胱氨酸(Cys29)之間的十 肽片段，並將Ala20及Ser22分別替換成Cys，獲得一條新的多肽，命名為MDP-I ；及其反向 序列，命名為MDP-2 ；2)採用固相合成法，利用Fmoc-Cys(trt) -OH和Fmoc-Cys (Acm) -OH分別作為一對要形 成二硫鍵的Cys合成出所需線性多肽；3)對獲得的粗製品分別以碘/甲醇/DMF中的一種或者幾種混合溶液及抗壞血酸進行 復性處理以形成正確的二硫鍵；4)對復性後的多肽樣品用反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化至少2次，獲得純品。
6.如權利要求5所述的人工合成抗菌肽的方法，其特徵是所述步驟1)中MDP-I或者 MDP-2多肽的N端設計為乙醯化，C端設計為醯胺化。
7.如權利要求5或者6所述的人工合成抗菌肽的方法，其特徵是所述步驟幻中固相 合成法工藝為21)Fm0C-Rink-AM-Resin樹脂以二氯甲烷(DCM)進行充分溶脹；取第一個9-芴甲氧羰 基(Fmoc)-胺基酸於DCM中溶解；再加入二異丙基乙胺(DIEA)混合後加入反應容器中，吹 N2反應2hr ；22)將反應液過濾除去並加入甲醇，封閉反應Ihr後分別用DCM、異丙醇及N，N-二甲 基甲醯胺(DMF)洗滌樹脂；之後用20%哌啶脫Fmoc，經DMF充分洗滌後，加第二個胺基酸與 1-羰基苯並四唑(HOBt)及DIEA混合後進行偶聯，反應一小時後，用茚三酮檢測，樹脂無色 透明為反應完全，然後以DMF充分洗滌；23)重複上述步驟直到最後一個胺基酸反應完全；24)利用K試劑對合成後的多肽進行側鏈去保護以及從樹脂上切割。
8.權利要求1-4任一項所述的人工合成抗菌肽在製備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性 菌、真菌感染的藥物開發或飼料添加劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種人工合成抗菌肽，屬於生物製藥技術領域，其胺基酸序列為Cys-Val-Cys-Phe-Gly-Arg-Arg-Cys-Ile-Cys；或者為Cys-Ile-Cys-Arg-Arg-Gly-Phe-Cys-Val-Cys。本發明還公開了一種人工合成抗菌肽的方法及其人合成抗菌肽在製備治療革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌感染的藥物開發或飼料添加劑中的應用。本發明與現有技術相比，具有如下優點和效果本發明採用人工合成的方法，人工合成肽跟天然抗菌肽比具有分子量小、結構穩定、抗菌活性強、序列短、二硫鍵數目少、成本低等優點。
文檔編號C07K1/04GK102079777SQ20091022422
公開日2011年6月1日 申請日期2009年11月26日 優先權日2009年11月26日
發明者劉梅, 廖智, 王日昕, 石戈, 魯濤 申請人:浙江海洋學院