從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法與用途
2023-04-24 18:08:21
從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法與用途
【專利摘要】本發明是一種從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法：向孔石蓴乾粉末加入無水甲醇製得蒸乾物，再加入蒸餾水製得上清液；將上清液調pH後加入乙酸乙酯多次萃取製得組分ABCD；將其甲醇溶液點樣於矽膠GF254上，合併收集相同Rf處條帶溶解於丙酮，經離心和減壓濃縮，製備到11種組分，其中的4種組分再次以劃線法點樣於矽膠GF254上進行純化製備，製備到6種組分。13種組分為生物鹼和酚酸。可用於抑制米氏凱倫藻或者中肋骨條藻的生長。本發明方法可操作性強，製得的酚酸和生物鹼純度高，實現了從孔石蓴中提取製得酚酸和生物鹼的突破。該方法製得的多種酚酸和生物鹼具有海藻抑藻活性，具有實際應用價值。
【專利說明】從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法與用途
【技術領域】[0001]本發明屬於海洋生化工程領域，具體涉及一種從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法。本發明還涉及該方法製得的酚酸和生物鹼的用途。
【背景技術】
[0002]目前，世界各地海岸普遍存在赤潮現象，對近海水域生態環境、人類生活和沿海水產業的可持續發展造成了極大的威脅。在赤潮的發生頻率、規模和危害程度愈演愈烈的同時，海洋沿岸帶(河口和海灣等)水體較淺的透光層內，以石蓴(Ulva sp.)和滸苔(Enteromorpha sp.)等綠藻為主要代表的海藻亦開始泛濫,形成海藻水華,給沿海漁業、養殖業和旅遊業造成重大的損失。如何科學、有效地利用這些綠潮海藻資源，以減少綠潮帶來的經濟損失成為亟待解決的問題之一。以這些綠潮海藻為實驗材料，將之應用於赤潮生物治理中的研究逐漸引起研究者們的重視。
孔石蓴(Ulva pertusa)分類上歸屬於綠藻門，石蓴屬，石蓴科，廣泛分布於西太平洋沿海，是我國野生經濟藻類中資源極為豐富的一種，在黃渤海產量最大。自古以來，孔石蓴在食用和藥用方面就有廣泛的應用。目前，孔石蓴主要應用在水產養殖飼料和生態肥料等方面，其應用價值還未得到充分發掘。近來研究表明，孔石蓴及其提取物具有多種生物活性，降血脂作用、抗病毒和抗菌作用、清除自由基和抗氧化作用、抑藻活性等，在食品領域、海洋天然藥物和生態環境保護等方面都顯示出廣闊的應用前景。
【發明內容】
[0004]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種新的從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法，該方法可操作性強，製得的酚酸和生物鹼純度高。
本發明所要解決的另一個技術問題是提供了上述方法所製得的酚酸和生物鹼的用途。本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法，其特點是，其步驟如下:
(1)向孔石蓴乾粉末加入無水甲醇，常溫超聲波下提取2h，過濾和減壓蒸乾，製備到蒸乾物；將蒸乾物加入蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉澱，得上清液；
(2)將上清液調pH至11，加入乙酸乙酯萃取；所得上層減壓蒸乾，獲得組分A，將所得下層調節PH至7，乙酸乙酯萃取，所得上層減壓蒸乾，製備到組分B，再將所得下層pH調節至2，乙酸乙酯萃取，所得上層和下層分別減壓蒸乾，獲得組分C和組分D ;將組分A、B、C、D分別溶解於無水甲醇中，得到4種甲醇溶液；
(3)將所得的4種甲醇溶液點樣於矽膠GF254上，組分A、組分B和組分C的甲醇溶液以體積比為15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，組分D的甲醇溶液以體積比為8:1的氯仿/甲醇為展開劑；展開後，紫外254nm下觀察；組分A甲醇溶液出現I個斑點，Rf為0.550 ;組分B甲醇溶液出現4個斑點，Rf為0.356、0.466、0.687和0.872 ;組分C甲醇溶液出現4個斑點，Rf為0.550、0.663、0.775和0.894 ;組分D的甲醇溶液出現2個斑點，Rf分別為0.216和0.585 ;在此基礎上，以劃線法多次點樣，合併收集相同Rf處條帶，重新溶解於丙酮，經離心和減壓濃縮，製備到11種組分，和前述斑點對應依次記為組分A1、組分V組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2 ;其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點樣於矽膠GF254上進行純化製備，以體積比為18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，製備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21 ；
(4)經化合物定性檢測、波長掃描和薄層層析檢測，13種組分物質中，組分Dll和組分D21是生物鹼，其餘組分為酚酸；分別減壓蒸乾，即得。
以上所述的本發明方法製得的酚酸或者生物鹼，可以用來抑制米氏凱倫藻或者中肋骨條藻的生長。
與現有技術相比，本發明方法可操作性強，製得的酚酸和生物鹼純度高，實現了從孔石蓴中提取製得酚酸和生物鹼的突破。該方法製得的多種酚酸和生物鹼具有海藻抑藻活性，具有實際應用價值。
【具體實施方式】
以下進一步描述本發明的具體技術方案，以便於本領域的技術人員進一步地理解本發明，而不構成對其權利的限制。
實施例1，一種從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法，其步驟如下:
(O向孔石蓴乾粉末加入無水甲醇，常溫超聲波下提取2h，過濾和減壓蒸乾，製備到蒸乾物；將蒸乾物加入蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉澱，得上清液；
(2)將上清液調pH至11，加入乙酸乙酯萃取；所得上層減壓蒸乾，獲得組分A，將所得下層調節PH至7，乙酸乙酯萃取，所得上層減壓蒸乾，製備到組分B，再將所得下層pH調節至2，乙酸乙酯萃取，所得上層和下層分別減壓蒸乾，獲得組分C和組分D ;將組分A、B、C、D分別溶解於無水甲醇中，得到4種甲醇溶液；
(3)將所得的4種甲醇溶液點樣於矽膠GF254上，組分A、組分B和組分C的甲醇溶液以體積比為15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，組分D的甲醇溶液以體積比為8:1的氯仿/甲醇為展開劑；展開後，紫外254nm下觀察；組分A甲醇溶液出現I個斑點，Rf為0.550 ;組分B甲醇溶液出現4個斑點，Rf為0.356、0.466、0.687和0.872 ;組分C甲醇溶液出現4個斑點，Rf為0.550、0.663、0.775和0.894 ;組分D的甲醇溶液出現2個斑點，Rf分別為0.216和0.585 ;在此基礎上，以劃線法多次點樣，合併收集相同Rf處條帶，重新溶解於丙酮，經離心和減壓濃縮，製備到11種組分，和前述斑點對應依次記為組分A1、組分V組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2 ;其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點樣於矽膠GF254上進行純化製備，以體積比為18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，製備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21 ；
(4)經化合物定性檢測、波長掃描和薄層層析檢測，13種組分物質中，組分Dll和組分D21是生物鹼，其餘組分為酚酸；分別減壓蒸乾，即得。
實施例2，一種從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法實驗:
孔石蓴幹品粉碎成0.3_粉末，加入無水甲醇，在常溫超聲波下提取2h。反覆提取3-4次後，合併提取液，經離心、過濾和減壓蒸乾，製備到蒸乾物；此蒸乾物加入適量蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉澱，保留上清液。用2-5mol/L氫氧化鈉將上清液PH調至11，加入乙酸乙酯萃取3-4次。上層減壓蒸乾，獲得組分A。調節下層pH至7，乙酸乙酯萃取3-4次，上層減壓蒸乾，製備到組分B。再將下層pH調節至2，乙酸乙酯萃取3-4次，上層和下層分別減壓蒸乾，獲得組分C和組分D。上述4種組分分別溶解於無水甲醇中，製備到4種甲醇溶液。將此4種甲醇溶液點樣於矽膠GF254上，組分A、組分B和組分C以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑，組分D以氯仿/甲醇(8:1)為展開劑。展開後，紫外254nm下觀察。組分A出現I個斑點，Rf為0.550 ;組分B出現4個斑點，Rf為0.356、0.466,0.687 和 0.872 ;組分 C 出現 4 個斑點，Rf 為 0.550,0.663,0.775 和 0.894 ;組分 D出現2個斑點，Rf分別為0.216和0.585。在此基礎上，以劃線法多次點樣，合併收集相同Rf處條帶，重新溶解於丙酮，經離心和減壓濃縮，製備到11種組分，記為組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2。其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點樣於矽膠GF254上進行純化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)為展開劑，製備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21。
取0.lmL13種組分的濃縮液，溶劑揮發後，加入lmol/L冰醋酸溶液I mL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6%鐵氰化鉀溶液和0.9%三氯化鐵溶液，使用前按0.9: 1.0混合而成，現用現配)，觀察顏色反應，發現組分V組分B1、組分B2、組分B3、組分B41、組分B42、組分C1、組分C2、組分C3、組分C41和組分C42呈現汙綠色，為酚酸類物質的陽性反應；波長掃描顯示，此11種組分在260-330nm範圍內有特徵吸收峰，為酚酸類物質的特徵吸收峰；13種組分的0.1mL濃縮液，溶劑揮發後，加入碘化鉍鉀溶液lmL，充分振蕩，僅組分D11和組分D21出現黃色沉澱，為生物鹼的陽性反應。將此13種組分溶液點樣於矽膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑下展開，發現此13種組分均呈現單一斑點；同時，採用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液或碘化鉍鉀溶液)，發現在此3種顯色劑下，此13種組分同樣呈現單一斑點，表明純度達到了薄層純。最後，抑藻活性檢測表明，此13種組分均能抑制米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長。減壓蒸乾，製備到13種抑藻活性物質。
實施例3，一種從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法實驗:
稱取孔石藥乾粉末400g,溶解於2000mL無水甲醇,室溫下超聲波提取2h。提取4次後，合併提取液，經離心、過濾和減壓蒸乾，製備到42.6g蒸乾物。此蒸乾物中加入40mL蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉澱，保留上清液。用2mol/L氫氧化鈉將上清液PH調至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上層40°C下減壓蒸乾，獲得暗綠色蒸乾物2.219g(組分A)。調節下層pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上層40°C下減壓蒸乾，製備到黃色蒸乾物
0.466g (組分B)。 再將下層pH調節至2，乙酸乙酯萃取4次，上層和下層分別在40°C減壓蒸乾，獲得棕黃色蒸乾物2.485g (組分C)和紅棕色蒸乾物3.219g (組分D)。上述4種組分分別溶解於無水甲醇中，製備到4種甲醇溶液。將此4種甲醇溶液點樣於矽膠GF254上，組分A、組分B和組分C以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑，組分D以氯仿/甲醇(8:1)為展開劑。展開後，紫外254nm下觀察。組分A出現I個斑點，Rf為0.550;組分B出現4個斑點，Rf 為 0.356、0.466、0.687 和 0.872 ;組分 C 出現 4 個斑點，Rf 為 0.550、0.663、0.775 和0.894 ;組分D出現2個斑點，Rf分別為0.216和0.585。在此基礎上，以劃線法多次點樣，合併收集相同Rf處條帶，重新溶解於丙酮，經離心和減壓濃縮，製備到11種組分，記為組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2。其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點樣於矽膠GF254上進行純化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)為展開劑，製備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21。
取0.lmL13種組分的濃縮液，溶劑揮發後，加入lmol/L冰醋酸溶液lmL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6%鐵氰化鉀溶液和0.9%三氯化鐵溶液，使用前按0.9: 1.0混合而成，現用現配)，觀察顏色反應，發現組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B41、組分B42、組分C1、組分C2、組分C3、組分C41和組分C42呈現汙綠色，為酚酸類物質的陽性反應；波長掃描顯示，此11種組分在260-330nm範圍內有特徵吸收峰，為酚酸類物質的特徵吸收峰；
13種組分的0.1mL濃縮液，溶劑揮發後，加入碘化鉍鉀溶液lmL，充分振蕩，僅組分D11和組分D21出現黃色沉澱，為生物鹼的陽性反應。將此13種組分溶液點樣於矽膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑下展開，發現此13種組分均呈現單一斑點；同時，採用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液或碘化鉍鉀溶液)，發現在此3種顯色劑下，此13種組分同樣呈現單一斑點，表明純度達到了薄層純。最後，抑藻活性檢測表明，此13種組分均能抑制米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長。減壓蒸乾，製備到13種抑藻活性物質，A1黃色油狀物0.054g、B1淡黃色針狀結晶0.032g、B2黃色結晶性粉末0.034g、B3黃色結晶0.026g、B41黃色針狀結晶0.006g、B42黃色粉末0.0OSgj1淡黃色粉末0.032g、C2淡黃色結晶0.083g、C3黃色粉末
0.085g、C41黃色結晶性粉末0.007g、C42黃色粉末0.004g、D11淡黃色粉末0.004g和D21淡黃色結晶0.009g。
實施例4，一種從孔石蓴中`分離純化製備酚酸和生物鹼的方法實驗:
稱取孔石藥乾粉末600g,溶解於3000mL無水甲醇，室溫下超聲波提取2h。提取4次後，合併提取液，經離心、過濾和減壓蒸乾，製備到58.4g蒸乾物。此蒸乾物中加入60mL蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉澱，保留上清液。用3mol/L氫氧化鈉將上清液PH調至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上層40°C下減壓蒸乾，獲得暗綠色蒸乾物
3.466g (組分A)。調節下層pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上層40°C下減壓蒸乾，製備到黃色蒸乾物0.531g (組分B)。再將下層pH調節至2，乙酸乙酯萃取4次，上層和下層分別在40°C減壓蒸乾，獲得棕黃色蒸乾物2.875g (組分C)和紅棕色蒸乾物3.658g (組分D)。上述4種組分分別溶解於無水甲醇中，製備到4種甲醇溶液。將此4種甲醇溶液點樣於矽膠GF254上，組分A、組分B和組分C以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑，組分D以氯仿/甲醇(8:1)為展開劑。展開後，紫外254nm下觀察。組分A出現I個斑點，Rf為0.550 ;組分B出現4個斑點，Rf為0.356,0.466,0.687和0.872 ;組分C出現4個斑點，Rf為0.550、
0.663,0.775和0.894 ;組分D出現2個斑點，Rf分別為0.216和0.585。在此基礎上，以劃線法多次點樣，合併收集相同Rf處條帶，重新溶解於丙酮，經離心和減壓濃縮，製備到11種組分，記為組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2。其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點樣於矽膠GF254上進行純化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)為展開劑，製備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21。取0.lmL13種組分的濃縮液，溶劑揮發後，加入lmol/L冰醋酸溶液lmL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6%鐵氰化鉀溶液和
0.9%三氯化鐵溶液，使用前按0.9: 1.0混合而成，現用現配)，觀察顏色反應，發現組分Ap組分B1、組分B2、組分B3、組分B41、組分B42、組分C1、組分C2、組分C3、組分C41和組分C42呈現汙綠色，為酚酸類物質的陽性反應；波長掃描顯示，此11種組分在260-330nm範圍內有特徵吸收峰，為酚酸類物質的特徵吸收峰；13種組分的0.1mL濃縮液，溶劑揮發後，加入碘化鉍鉀溶液lmL，充分振蕩，僅組分D11和組分D21出現黃色沉澱，為生物鹼的陽性反應。將此13種組分溶液點樣於矽膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑下展開，發現此13種組分均呈現單一斑點；同時，採用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液或碘化鉍鉀溶液)，發現在此3種顯色劑下，此13種組分同樣呈現單一斑點，表明純度達到了薄層純。最後，抑藻活性檢測表明，此13種組分均能抑制米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長。減壓蒸乾，製備到13種抑藻活性物質，A1黃色油狀物0.082g、B1淡黃色針狀結晶0.051g、B2黃色結晶性粉末0.049g、B3黃色結晶0.047g、B41黃色針狀結晶0.008g、B42黃色粉末0.01Ogj1淡黃色粉末0.048g、C2淡黃色結晶0.096g、C3黃色粉末0.098g、C41黃色結晶性粉末0.009g、C42黃色粉末0.005g、D11淡黃色粉末0.005g和D21淡黃色結晶0.0 Hg。
實施例5，一種從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法實驗:
稱取孔石藥乾粉末800g,溶解於3500mL無水甲醇,室溫下超聲波提取2h。提取4次後，合併提取液，經離心、過濾和減壓蒸乾，製備到84.2g蒸乾物。此蒸乾物中加入IOOmL蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉澱，保留上清液。用5mol/L氫氧化鈉將上清液PH調至11，加入乙酸乙酯萃取4次。上層40°C下減壓蒸乾，獲得暗綠色蒸乾物4.0Slg(組分A)。調節下層pH至7，乙酸乙酯萃取4次，上層40°C下減壓蒸乾，製備到黃色蒸乾物
0.782g (組分B)。再將下層pH調節至2，乙酸乙酯萃取4次，上層和下層分別在40°C減壓蒸乾，獲得棕黃色蒸乾物3.725g (組分C)和紅棕色蒸乾物5.383g (組分D)。上述4種組分分別溶解於無水甲醇中，製備到4種甲醇溶液。將此4種甲醇溶液點樣於矽膠GF254上，組分A、組分B和組分C以氯仿/丙酮/甲酸(15:3:2)為展開劑，組分D以氯仿/甲醇(8:1)為展開劑。展開後，紫外254nm下觀察。組分A出現I個斑點，Rf為0.550;組分B出現4個斑點，Rf 為 0.356,0.466,0.687 和 0.872 ;組分 C 出現 4 個斑點，Rf 為 0.550,0.663,0.775 和0.894 ;組分D出現2個斑點，Rf分別為0.216和0.585。在此基礎上，以劃線法多次點樣，合併收集相同Rf處條帶，重新溶解於丙酮，經離心和減壓濃縮，製備到11種組分，記為組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2。其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點樣於矽膠GF254上進行純化，以氯仿/丙酮/甲酸(18:1:3)為展開劑，製備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21。取0.lmL13種組分的濃縮液，溶劑揮發後，加入lmol/L冰醋酸溶液lmL，充分振蕩，加入鐵氰化鉀-三氯化鐵顯色劑(0.6%鐵氰化鉀溶液和0.9%三氯化鐵溶液，使用前按0.9: 1.0混合而成，現用現配)，觀察顏色反應，發現組分A1、組分B1、組分B2、組分B3、組分B41、組分B42、組分C1、組分C2、組分C3、組分C41和組分C42呈現汙綠色，為酚酸類物質的陽性反應；波長掃描顯示，此11種組分在260-330nm範圍內有特徵吸收峰，為酚酸類物質的特徵吸收峰；13種組分的0.1mL濃縮液，溶劑揮發後，加入碘化鉍鉀溶液lmL，充分振蕩，僅組分D11和組分D21出現黃色沉澱，為生物鹼的陽性反應。將此13種組分溶液點樣於矽膠GF254上，分別在氯仿/甲醇，環己烷/乙酸乙酯和正丁醇/醋酸/水等3種展開劑下展開，發現此13種組分均呈現單一斑點；同時，採用通用型顯色劑(10%硫酸溶液和碘)以及專屬顯色劑(鐵氰化鉀-三氯化鐵溶液或碘化鉍鉀溶液)，發現在此3種顯色劑下，此13種組分同樣呈現單一斑點，表明純度達到了薄層純。最後，抑藻活性檢測表明，此13種組分均能抑制米氏凱倫藻和中肋骨條藻的生長。減壓蒸乾，製備到13種抑藻活性物質，A1黃色油狀物0.098g、B1淡黃色針狀結晶0.059g、B2黃色結晶性粉末0.060g、B3黃色結晶0.048g、B41黃色針狀結晶0.01Og^B42黃色粉末0.0Hg^C1淡黃色粉末0.058g、C2淡黃色結晶0.147g、C3黃色粉末0.152g、C41黃色結晶性粉末0.01lg, C42黃色粉末0.006g、D11淡黃色粉末0.007g和D21淡黃色結晶0.016g。
採用抑藻圈實驗進行抑藻活性檢測。在數個直徑為1.5cm的圓形濾紙片上，分別滴加5 μ L待測組分丙酮濃縮液和丙酮(作為對照組)，待丙酮完全揮發後，將濾紙片放置於接種對數生長期的中肋骨條藻的固體培養基上，置於GXZ-260B智能型光照培養箱中培養，溫度(26±1) °C，光照強度62μπι01 JiT2s-1,光暗比為12:12。2d後，觀察濾紙片及周圍受試微藻的生長，發現13種待測組分均對中肋骨條藻的生長表現出較為明顯的抑制作用。通過測定抑藻圈，此13種待測組分的抑藻圈均超`過1.0cm0
【權利要求】
1.一種從孔石蓴中分離純化製備酚酸和生物鹼的方法，其特徵在於，其步驟如下: (O向孔石蓴乾粉末加入無水甲醇，常溫超聲波下提取2h，過濾和減壓蒸乾，製備到蒸乾物；將蒸乾物加入蒸餾水，充分振蕩，4°C下靜置過夜，離心、過濾，去除沉澱，得上清液； (2)將上清液調pH至11，加入乙酸乙酯萃取；所得上層減壓蒸乾，獲得組分A，將所得下層調節PH至7，乙酸乙酯萃取，所得上層減壓蒸乾，製備到組分B，再將所得下層pH調節至2，乙酸乙酯萃取，所得上層和下層分別減壓蒸乾，獲得組分C和組分D ;將組分A、B、C、D分別溶解於無水甲醇中，得到4種甲醇溶液； (3)將所得的4種甲醇溶液點樣於矽膠GF254上，組分A、組分B和組分C的甲醇溶液以體積比為15:3:2的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，組分D的甲醇溶液以體積比為8:1的氯仿/甲醇為展開劑；展開後，紫外254nm下觀察；組分A甲醇溶液出現I個斑點，Rf為0.550 ;組分B甲醇溶液出現4個斑點，Rf為0.356、0.466、0.687和0.872 ;組分C甲醇溶液出現4個斑點，Rf為0.550、0.663、0.775和0.894 ;組分D的甲醇溶液出現2個斑點，Rf分別為0.216和0.585 ;在此基礎上，以劃線法多次點樣，合併收集相同Rf處條帶，重新溶解於丙酮，經離心和減壓濃縮，製備到11種組分，和前述斑點對應依次記為組分A1、組分V組分B2、組分B3、組分B4、組分C1、組分C2、組分C3、組分C4、組分D1和組分D2 ;其中，組分B4、組分C4、組分D1和組分D2再次以劃線法點樣於矽膠GF254上進行純化製備，以體積比為18:1:3的氯仿/丙酮/甲酸為展開劑，製備到6種組分，依次記為組分B41、組分B42、組分C41、組分C42、組分D11和組分D21 ； (4)經化合物定性檢測、波長掃描和薄層層析檢測，13種組分物質中，組分Dll和組分D21是生物鹼，其餘組分為酚酸；分別減壓蒸乾，即得。
2.如權利要求1所述方法製得的酚酸或者生物鹼在抑制米氏凱倫藻或者中肋骨條藻的生長中的用途。
【文檔編號】A01N65/03GK103690571SQ201310649525
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】孫穎穎, 閻斌倫, 王輝 申請人:淮海工學院