粘蛋白-1抗原性多肽及其作為腫瘤疫苗的用途

2023-04-24 11:47:26

粘蛋白-1抗原性多肽及其作為腫瘤疫苗的用途
【專利摘要】本發明提供了人類粘蛋白-1腫瘤抗原性多肽或其連續10個胺基酸的片段，其可結合HLA?I並被CD8+T細胞識別。本發明還提供了編碼上述多肽的核酸。本發明還提供了可在細胞表面呈遞上述多肽的抗原呈遞細胞，以及可識別上述多肽或抗原呈遞細胞的免疫效應細胞。本發明還提供了所述多肽或其變體，核酸，抗原呈遞細胞或免疫效應細胞在用於製備治療或預防癌症的疫苗或藥物組合物中的用途。本發明提供的腫瘤疫苗在較大的人群中有良好的治療效果，尤其是適合亞洲人種，例如中國人。
【專利說明】粘蛋白-1抗原性多肽及其作為腫瘤疫苗的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及腫瘤和免疫預付和治療領域。具體的，本發明涉及人類粘蛋白-1腫瘤多肽衍生物和其作為腫瘤疫苗的用途。
【背景技術】
[0002]目前臨床上對於癌症的治療是以手術為主,化療和放療為輔,但治療的特異性不足，常常對正常組織和器官造成損傷，並且手術治療仍存在術後高度復發及易轉移的問題。腫瘤疫苗的免疫治療可以產生針對腫瘤的特異性反應，甚至能清除殘餘的腫瘤病灶，並產生免疫記憶。現已成為繼手術、化療和放療之後的第四種腫瘤治療方式，且與三大常規療法有明顯的互補性。
[0003]作為預防或治療性疫苗，腫瘤疫苗是免疫治療的一種方式。其中利用多肽製作疫苗是利用腫瘤特異性抗原及其它免疫調節細胞來治療和預防腫瘤。抗腫瘤免疫反應過程中先由抗原遞呈細胞(APC)腫瘤抗原處理遞呈給T細胞而激發的。樹突狀細胞(DendriticCell，DC)是人體內功能最強的專職APC。應用負載腫瘤抗原的DC，能夠激發體內腫瘤特異性T細胞，從而能有效殺傷腫瘤細胞，並且能夠建立起持久的抗腫瘤特異性免疫應答。
[0004]人粘蛋白I (MUCl)是一種高度O-糖基化和含有連續重複肽序列為特徵的高分子量糖蛋白，存在於多種上皮組織，具有多種功能。粘蛋白在癌組織中異常表達，表達量豐富。人粘蛋白I(MUCl)是一種腫瘤相關抗原(Tumor associated antigen, TAA),存在於90%癌細胞表面的分子。健康的人體細胞中也含有粘蛋白1，但數量很少，無法觸發免疫反應。免疫系統遭遇粘蛋白I濃度高的癌 細胞可能觸發免疫反應，激活的毒性T淋巴細胞可攻擊和殺死癌細胞。
[0005]細胞免疫，特別是細胞毒性T細胞(下文中稱為CTL)在從活體中清除腫瘤細胞、病毒感染的細胞等中發揮重要作用。CTL識別腫瘤細胞上的抗原肽(腫瘤抗原肽)和MHC (主要組織相容性複合體)I類抗原(在人中其被稱為HLA抗原)的複合物，並攻擊和殺死腫瘤細胞。
[0006]當細胞內合成腫瘤特異性蛋白(即腫瘤抗原蛋白質)後，該腫瘤特異性蛋白通過蛋白酶的細胞內降解產生腫瘤抗原肽。得到的腫瘤抗原肽與內質網中的MHC I類抗原(HLA抗原)結合以形成複合物，其被運輸至細胞表面並作為抗原呈遞。當腫瘤特異性CTL識別了作為抗原呈遞的複合物時通過細胞毒性作用或淋巴因子的產生展示抗腫瘤作用。對一系列這些作用的闡明使通過使用腫瘤抗原蛋白或肽作為所謂的癌症免疫治療劑(癌症疫苗)在具有腫瘤的患者中提高腫瘤特異性CTL的療法成為可能。在腫瘤免疫治療中，清除腫瘤細胞依靠T細胞的免疫作用。T細胞對抗原的識別，並不是完整的抗原分子。在抗原遞呈細胞(APC)中，腫瘤相關抗原被酶分解成多肽，然後再在肽鏈轉運蛋白的參與下被轉運到內質網腔與新合成的HLA分子(human leukocyte antigen,人類白細胞抗原,包括HLA I分子或HLA II分子)結合併移至APC表面，形成HLA/抗原肽複合物，T細胞通過其表面特異的TCR識別抗原呈遞細胞表面的HLA/抗原肽複合物後，再收到協同刺激信號(B7分子與CD28分子相互作用)。在雙信號刺激下，T細胞被激活並發生增殖，大部分進而分化成效應細胞。其中cd8+t細胞有殺傷力，使外源細胞破裂而死亡。cd8+t細胞分泌白介素等細胞因子使cd8+t
細胞、Μφ以及各種有吞噬能力的白細胞集中於腫瘤細胞周圍，將腫瘤細胞消滅。其中一部分τ淋巴細胞，成為記憶細胞，再次遇到相同抗原刺激時，它將更迅速地增殖分化為效應細胞。少數記憶細胞再次分裂為記憶細胞,持久地執行特異性免疫功能。
[0007]1991年,Rotzschke等用X射線晶體衍射揭示,HLA I類分子頂部α I和α 2鏈組成的抗原肽結合區呈凹槽狀結構，可容納8~12個胺基酸殘基組成的短肽。凹槽內胺基酸組成在不同型別的HLA I分子中高度保守，可與表位肽N端殘基和C端殘基形成穩定而強大的氫鍵，保證了 HLA I分子可以識別特殊表位。在不同基因型HLA I的凹槽內胺基酸可以有各種變化，這是形成HLA I多態性的基礎。雖然抗原肽與HLA I類分子的結合有一定的選擇性，但與抗體和抗原結合的機理不一樣，只要被結合的多肽有2~3個關鍵的有相似化學性質的胺基酸殘基(錨定位點)，就能恰當地連接到凹槽內的多肽結合基序(bindingmotif)的相應位置上。多肽與之結合後，並被運送到細胞表面遞呈給⑶8+τ細胞。ra8+T細胞通過其表面的T細胞受體(TCR)特異性識別抗原呈遞細胞表面的HLA/抗原肽複合物後，被激活化並增殖，進而分化成效應細胞。正是這一結構基礎，所以每個HLA I分子能與一定數量的不同多肽結合。這為不同型別的分子結合肽的序列進行表位預測提供了理論基礎，從而使計算機輔助手段進行CTL表位的分析乃至預測成為可能。
[0008]HLA-DP、DQ、DR等HLA II類分子是由HLA II類基因編碼的α鏈和β鏈非共價連接的糖蛋白組成。α鏈和β鏈在內質網分別合成後，各自盤繞成一個α螺旋和β片層構成凹槽。凹槽內也有錨定位點，凹槽與抗原肽結合形成HLA/多肽複合體。由於它的末端是開放的，故可容納較長的多肽(約12~20個胺基酸)。當HLA II的凹槽與抗原肽結合形成MHC/多肽複合體，並被運送到細胞表面遞呈給ra4+T細胞。ra4+T細胞通過其表面TCR特異性識別抗原呈遞細胞表面的HLA/抗原肽複合物後，被活化和發生增殖，進而分化成效應細胞。ra8+T細胞必須要有刺激cd4+t細胞的信號，才能產生有效的免疫反應。激活的ra4+T細胞能有效促進CD8+T細胞產生記憶細胞，從而使機體產生長期的抗腫瘤的CTL反應。除此之外，激活的cd4+t細胞也可直接殺傷腫瘤細胞。
[0009]HLA不同基因座位或同基因同一座位的不同等位基因之間結構上的差異，可形成不同的HLA分子凹槽的結構。由此造成不同HLA等位基因編碼分子對各種抗原肽的結合具有選擇性。而且，能夠和同一類HLA分子結合的抗原肽，其錨定位點和錨定殘基往往相同或相似。這表明，特定的HLA分子可憑藉所需要的共同性基序選擇性地結合抗原肽，在這個意義上，兩者的結合具有一定的選擇性。事實上，不同HLA分子可選擇性地結合具有不同錨定位和殘基的肽段，故不同HLA等位基因產物有可能提呈同一抗原分子的不同表位，造成不同個體(帶有相異的MHC等位基因)對同一抗原的應答在強度上出現差異。這上是HLA以其多態性參與和調控免疫應答的一種重要機制。
[0010]深入研究還發現，HLA分子對抗原肽的識別並非呈現嚴格的一對一關係。這一可變通性可表現在不同方面:一，組成共同性基礎序列的抗原肽，其順序和結構可變；二，同一HLA分子(如HLA II分子)所要求的錨定殘基往往不止一種胺基酸，結果是對應的特定共同基礎序列的肽鏈數量可以相當地多，造成一種HLA分子可結合多種抗原肽，激活多個特異T細胞克隆；三，不同HLA分子接納的抗原肽，可擁有相似的共同基序。例如，在HLA I類分子中至少已知A2、A3、B4、B44四個家族，這些家族中的成員(各種等位基因產物)可選擇性地共同識別擁有相同或相似錨定殘基的抗原肽。這意味著能夠被某一 HLA分子所識別和提呈的抗原肽，也可能被其所屬家族中的其它分子所提呈。這對應用多肽疫苗，體外致敏樹突狀細胞疫苗或T細胞疫苗進行免疫預防和免疫治療提供了便利。同時也為鑑定和改造腫瘤疫苗的多肽順序提供依據。
[0011]不僅每個HLA I分子能與一定數量的不同多肽結合，T細胞也具有交叉反應現象，即單一的T細胞能夠識別兩個或兩個以上不同的多肽抗原與MHC的蛋白質複合體。這又在另一個層面上提供了鑑定和改造腫瘤疫苗的多肽序列的依據。[0012]研究表明，克服HLA多態性的障礙，尋找有效的覆蓋大部分人群的腫瘤表位疫苗已成為腫瘤特異性多肽疫苗免疫治療研究的重要前提。
[0013]據統計，僅僅HLA A2(包括 A*0201、A*0202、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207 和A*0208)與HLA A3 (包括A*0301、A*1101、A*3101和A*6801)兩個大型在中國人的總平均
分布頻率超過85%。同一大型識別的肽序列非常相似。
[0014]本領域還需要更有效的覆蓋大部分人群的腫瘤疫苗。

【發明內容】

[0015]本發明提供了可被MHC (主要組織相容性複合體)抗原(在人中其被稱為HLA抗原，包括HLA I和HLA II)識別並進而激發腫瘤相關T細胞的人類粘蛋白I的抗原決定簇。本發明提供的抗原決定簇在亞洲人，特別是中國人中佔了大多數，即出現的頻率較高。
[0016]本發明還提供根據這些人類粘蛋白I的抗原決定簇製備得到的多肽和相關腫瘤多肽疫苗。這些製備得到的腫瘤多肽疫苗在較大的人群中有良好的治療效果。
[0017]具體的，本發明提供了一種分離的多肽或其變體，所述多肽包含與下列(a)或(b)的胺基酸序列相同或基本上相同的胺基酸序列:
[0018](a) SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列；
[0019](b)所述(a)的胺基酸序列的片段。
[0020]SEQ ID NO:1 所示的胺基酸序列為 MTPGTQSPFFLLLLLTVLTV VTGS。
[0021]本發明的多肽或其變體可結合HLA I或HLA II分子並被OT8+T細胞或OT4+T細胞識別。在本發明的其中一個方面，本發明的多肽或其變體可結合HLA I分子並被CD8+T細胞識別。
[0022]本發明中，術語「分離」是指非天然的形式。
[0023]在本發明中，術語「變體」或「多肽的變體」是指與所述多肽在蛋白活性，例如抗原性上，表位上或免疫學上等同或具有更好活性的變體。在一些實施方案中，本領域技術人員可以通過改變所述多肽上不破壞其活性的部分，例如取代、缺失、插入、增加該多肽的胺基酸序列中的一個或多個胺基酸而得到所述變體。在一些實施方案中，可以通過鑑定相似多肽之間保守的分子的殘基和部分而對所述多肽進行相關胺基酸的替換而得到所述變體。本領域技術人員還能分析與相似多肽中的結構相關的三維結構和胺基酸序列。根據這樣的信息，本領域技術人員可以預測抗原三維結構的胺基酸序列比對，由此製備在各個期望的胺基酸殘基處包含單一胺基酸取代作用的試驗變體。然後可以應用本領域技術人員公知的活性測定來對這些變體進行篩選。[0024]在本發明中，表述「多肽包含某胺基酸序列」中的「包含」包括「具有」的含義。
[0025]本發明提供的多肽包括具有SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的多肽的片段(免疫原性片段)，即具有所述SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的一個連續部分，該部分能產生識別SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的多肽的免疫應答。優選的片段包括，例如，具有SEQ IDNO:1的一部分連續的胺基酸序列的截短多肽。
[0026]在本發明的一個方面，提供了上述多肽，其中(b)中所述片段為包含或具有SEQ IDNO:1所示的胺基酸序列中連續10個胺基酸的片段。
[0027]在本發明的又一個方面，提供了上述多肽，其具有FLLLLLTVLT (SEQ ID NO:2),LLLLLTVLTV (SEQ ID NO:3), LLLLTVLTVV (SEQ ID NO:4), FFLLLLLTVL (SEQ ID NO:5),GTQSPFFLLL (SEQ ID NO:6), TQSPFFLLLL (SEQ ID NO:7)的胺基酸序列。
[0028]在本發明的一個方面，上述多肽可結合HLA I分子並被ra8+T細胞識別。OT8+T細胞也被稱為細胞毒性T細胞(CTL)。在本發明的又一個方面，其中所述HLA I為HLA A2或HLA A3型，優選為HLA A2，更優選為A*0201或A*0202。
[0029]在本文，「基本上相同的胺基酸序列」是指胺基酸序列中一個到幾個(例如2、3、4或5個)胺基酸被置換、缺失、添加或插入，其與該胺基酸序列相比具有相同或相似或更好的活性。在本發明中，所述活性可以是指，例如，被HLA I和HLA II識別並進而激發腫瘤相關T細胞的活性。
[0030]可依照在常規肽化學中使用的方法合成本發明的多肽。這些已知方法包括例如在下列文獻中描述的方法:Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966。
[0031]也可以通過常規的基因工程製備本發明的多肽。例如，可使用常規DNA合成和基因工程方法製備的編碼所述多肽的核苷酸來製備所述多肽。即通過下述方法製備所述多肽:將上述多核苷酸插入常用的表達`載體；用得到的重組表達載體轉化宿主細胞；培養得到的轉化體；和從培養物中收集所述多肽。可參照例如以下文獻中描述的方法進行:Molecular Cloning, Τ.Maniatis 等人，CSH Laboratory (1983)。
[0032]本發明還提供了由編碼本發明的上述多肽的鹼基序列組成的分離的核酸。本發明的核酸可為cDNA、mRNA或DNA/RNA嵌合體，優選DNA。所述核酸可以是雙鏈或單鏈。當所述核酸是雙鏈的，它可以是雙鏈DNA、雙鏈RNA或DNA: RNA雜合體。當本發明的多核苷酸為雙鏈時，可將其插入表達載體以產生用於表達本發明的肽的重組表達載體。因此，本發明的核酸包含通過將本發明的雙鏈多核苷酸插入表達載體得到的重組表達載體。
[0033]編碼本發明的上述信號肽的鹼基序列不受特別限制，只要它在翻譯之後產生本發明的上述多肽的胺基酸序列的任何一個。編碼所述胺基酸序列的鹼基序列可以通過PCR方法等以含有粘蛋白序列的基因組DNA或RNA作為I旲板而獲得。另一方面，考慮到在宿主細胞中的表達效率，通常優選選擇非常經常用於所用宿主細胞的密碼子。在各種生物品種中密碼子的使用頻率數據可以從遺傳密碼使用頻率資料庫獲得。本發明的核酸的也可通過DNA/RNA自動合成儀進行化學合成。
[0034]在本發明的一個方面，提供了含有上述本發明的多肽或核酸的疫苗和藥物組合物。在本發明提供的所述疫苗和藥物組合物可用於治療或預防癌症。上述本發明的多肽可用作治療或預防癌症的疫苗和藥物組合物。上述本發明的核酸也可用作治療或預防癌症的疫苗和藥物組合物。本發明的核酸可以通過慣用的方式表達從而得到本發明的多肽，進而用於上述用途。
[0035]本發明的多肽可被呈遞至抗原呈遞細胞的HLA抗原，因此可治療或預防患者的腫瘤。本發明的多肽可被呈遞至抗原呈遞細胞的HLA，特異性激發能識別HLA抗原和呈遞的多肽的結合的複合物的T細胞，特別是CD8+T細胞，可增殖從而殺死腫瘤細胞，因此可被用於治療或預防患者的腫瘤。
[0036]包含本發明的多肽作為活性成分的用於誘導T細胞，特別是CD8+T細胞的試劑可與藥學上可接受的載體例如合適的佐劑混合或組合施用，從而有效建立細胞免疫。可使用的佐劑的例子包括在文獻Clin.Microbiol.Rev.,7:277-289, 1994 (其在此處引入作為參考)中描述的那些。
[0037]本發明的多肽能夠在HLA A2與HLA A3兩個大型中特別有效地被呈遞和誘導特異性細胞毒性 T 細胞(CTL)。HLA A2 型包括 A*0201、A*0202、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207和A*0208。HLA A3包括A*0301、A*1101、A*3101和A*6801。這兩個大型在中國人的總平均分布頻率超過85%。因此，本發明的多肽和基於本發明的多肽的預防和治療腫瘤的疫苗或藥物組合物能夠有效的覆蓋大部分人群。優選的，本發明的多肽能夠在HLA A2型中有效地被呈遞和誘導特異性細胞毒性T細胞(CTL)。更優選的，本發明的多肽能夠在A*0201、A*0202型中有效地被呈遞和誘導特異性細胞毒性T細胞(CTL)。
[0038]包含本發明的多肽或衍生物作為活性成分的用於誘導預防或治療性免疫反應的疫苗可與藥學上可接受的載體例如合適的佐劑混合或組合施用，從而更有效建立免疫反應。
[0039]可使用的佐劑的實例包括，例如，微生物來源的成分或其衍生物，細胞因子，植物來源的成分或其衍生物，海洋生物來源的成分或其衍生物，礦物質凝膠例如氫氧化鋁、溶血卵磷脂，表面活性劑例如多元醇，聚陰離子，肽，油性乳化劑(乳化劑製劑)等等。另外也可考慮脂質體製劑，與具有幾微米直徑的珠連接的納米微粒製劑，具有連接的脂的製劑，微球製劑，微膠囊製劑等等。
[0040]本發明的上述疫苗或藥物組合物的施用的方法包括皮內、皮下、肌肉內、靜脈施用等等。在製劑中的本發明的肽的劑量可根據待治療的疾病，患者的年齡和體重等適當地調整。通常，本發明的肽在製劑中的劑量為0.0001至lOOOmg，優選0.001至lOOOmg，更優選
0.1至10mg，優選地每幾天或I至幾個月施用I次。
[0041]上述本發明的疫苗和藥物組合物也可通過體外方法用於治療腫瘤患者。換句話說，本發明的多肽或核酸可在體外與抗原呈遞細胞和/或免疫效應細胞接觸，產生能夠識別本發明抗原或抗原複合體的抗原呈遞細胞，從而誘導特異性T細胞，特別是cd8+t細胞，然後返回患者體內以用於預防或治療癌症。本發明提供了通過在體外將來源於腫瘤患者的外周血淋巴細胞和本發明的多肽或核酸接觸而誘導的T細胞，特別是cd8+t細胞，以及產生上述細胞的方法。
[0042]在本發明的一個方面，提供了產生抗原呈遞細胞的方法。在本發明的其中一個方面，所述方法包括將上述本發明的多肽與具有抗原呈遞能力的細胞接觸的步驟。在本發明的其中一個方面，所述 方法包括將上述本發明的核酸與具有抗原呈遞能力的細胞接觸的步驟。如上所述的本發明的多肽和核酸可與具有抗原呈遞能力的細胞接觸，可以產生抗原呈遞細胞。將本發明的多肽或核酸與具有抗原呈遞能力的細胞接觸，可以產生抗原呈遞細胞。本發明的多肽和核酸可在體外使用，用於預防或治療腫瘤。例如，通過在體外將本發明的多肽或核酸與具有抗原呈遞能力的細胞接觸，可以產生抗原呈遞細胞。本發明的多肽和核酸也可在體內使用，用於預防或治療腫瘤。
[0043]在本發明中，具有抗原呈遞能力的細胞是在所述細胞表面表達呈遞多肽的HLA抗原的細胞。其中一種具有抗原呈遞能力的細胞是樹突細胞。
[0044]本發明提供了一種抗原呈遞細胞，在所述細胞表面表達呈遞本發明的多肽的HLA抗原的細胞。其中一種具有抗原呈遞能力的細胞是樹突細胞。本發明的抗原呈遞細胞可以通過將本發明的多肽或核酸加入上述具有抗原呈遞能力的細胞而製備。
[0045]本發明的抗原呈遞細胞可通過下述方法獲得:從腫瘤患者中分離具有抗原呈遞能力的細胞，用本發明的多肽在體外刺激細胞，並允許抗原呈遞細胞呈遞HLA抗原和多肽的複合物。當使用樹突細胞時，可從腫瘤患者的外周血中分離淋巴細胞、去除不能粘附培養皿的細胞、在GM-CSF和IL-4的存在下培養粘附細胞以誘導樹突細胞、和培養並用本發明的肽刺激樹突細胞而製備本發明的抗原呈遞細胞。
[0046]在通過將本發明的核酸加入到具有抗原呈遞能力的細胞中而製備本發明的抗原呈遞細胞。所述核酸可為DNA或RNA形式。所述核酸可在具有抗原呈遞能力的細胞中表達本發明的多肽。
[0047]本發明提供了一種免疫效應細胞，所述細胞能夠特異性識別表面表達呈遞了本發明的多肽和HLA抗原複合物的呈遞細胞，並被激活並發生增殖，分化成效應細胞。效應細胞包括各種T細胞，例如CD8+T細胞和CD4+T細胞。在本發明的一個方面，本發明提供了一種免疫效應細胞，其為CD8+T細胞，對癌症細胞有殺傷力，使癌症細胞破裂而死亡，還成為記憶細胞，再次遇到相同抗原刺激時，它將更迅速地增殖分化為效應細胞。
[0048]本發明的免疫效應細胞可以通過將本發明的多肽或核酸加入具有抗原呈遞能力的細胞，然後將呈遞了本發明的多肽和HLA抗原複合物的呈遞細胞與具有免疫效應能力的細胞接觸而製備。
[0049]本發明提供的上述本發明的抗原呈遞細胞可用作治療或預防癌症的疫苗或藥物組合物。本發明的抗原呈遞細胞具有免疫誘導活性，可用於製備誘導抗原特異性效應細胞的試劑。被誘導的cd8+t細胞能夠通過細胞毒性作用和淋巴因子的產生發揮抗腫瘤作用。因此，本發明的抗原呈遞細胞可為用於治療或預防腫瘤的疫苗或藥物組合物的活性成分。包含抗原呈遞細胞作為活性成分的用於誘導CTL的疫苗可包含鹽水、磷酸鹽緩衝液(PBS)、培養基等等以穩定地維持抗原呈遞細胞。施用的方法包括靜脈內施用。可將包含抗原呈遞細胞作為活性成分的用於誘導CD8+T細胞的試劑返回患者的體內，因此可在對本發明多肽有反應的患者體內有效誘導特異性CD8+T細胞，結果可治療或預防腫瘤。
[0050]本發明的免疫效應細胞可用作治療或預防癌症的疫苗或藥物組合物。本發明的效應細胞包括各種T細胞，例如cd8+t細胞。本發明的cd8+t細胞能夠通過細胞毒性作用和淋巴因子的產生發揮抗腫瘤作用。因此，本發明的免疫效應細胞可為用於治療或預防腫瘤的疫苗或藥物組合物的活性成分。包含抗原呈遞細胞作為活性成分的免疫效應細胞的疫苗可包含鹽水、磷酸鹽緩衝液(PBS)、培養基等等以穩定地維持免疫效應細胞。施用的方法包括靜脈內施用。可將包含免疫效應細胞作為活性成分的試劑返回患者的體內，結果可治療或預防腫瘤。[0051]在本發明的一個方面，提供了含有上述本發明的抗原呈遞細胞或免疫效應細胞的疫苗和藥物組合物。在本發明提供的所述疫苗和藥物組合物可用於治療或預防癌症。上述本發明的抗原呈遞細胞或免疫效應細胞可用作治療或預防癌症的疫苗和藥物組合物。
[0052]上述本發明的含有抗原呈遞細胞或免疫效應細胞的疫苗和藥物組合物可通過體外方法用於治療腫瘤患者。本發明的多肽或核酸可在體外與抗原呈遞細胞和/或免疫效應細胞接觸，產生能夠識別本發明抗原或抗原複合體的抗原呈遞細胞，從而誘導特異性效應細胞，例如T細胞(特別是CD8+T細胞)，然後將所述抗原呈遞細胞和/或免疫效應細胞返回患者體內以用於預防或治療癌症。在本發明的一個方面，所述患者為HLA I型，優選為HLAA2或HLA A3型，更優選為HLA A2型，最優選為A*0201或A*0202型。
[0053]本發明的免疫效應細胞，例如T細胞(特別是CD8+T細胞)，可用作用於治療或預防腫瘤的疫苗或藥物組合物的活性成分。
[0054]上述本發明的多肽或核酸，以及上述本發明的抗原呈遞細胞或免疫效應細胞，可用於預防或治療癌症。所述癌症包括血癌、實體瘤等，更具體地講，包括肺癌、惡性淋巴瘤(例如網狀細胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病(Hodgkin’s disease)等)、消化器官癌(例如胃癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌等)、乳腺癌、卵巢癌、肌與骨骼肉瘤(musculoskeletal sarcoma)(例如骨肉瘤(osteosarcoma)等)、膀胱癌、白血病(例如急性白血病，包括慢性髓細胞性白血病急性發作)、腎癌、前列腺癌等，優選為消化器官癌，例如胃癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌等。優選的，為肝癌。
[0055]本發明還提供了如前所述的本發明的多肽或其變體，或如前所述的本發明的核酸，或如前所述的本 發明的抗原呈遞細胞，或如前所述的本發明的免疫效應細胞在用於製備治療或預防癌症的疫苗或藥物組合物中的用途。所述癌症包括血癌、實體瘤等，更具體地講，包括肺癌、惡性淋巴瘤(例如網狀細胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病(Hodgkin’s disease)等)、消化器官癌(例如胃癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌等)、乳腺癌、卵巢癌、肌與骨骼肉瘤(musculoskeletal sarcoma)(例如骨肉瘤(osteosarcoma)等)、膀胱癌、白血病(例如急性白血病，包括慢性髓細胞性白血病急性發作)、腎癌、前列腺癌等，優選為消化器官癌，例如胃癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌等。優選的，為肝癌。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0056]圖1a細胞系MUCl蛋白表達western免疫印跡檢測；
[0057]圖1b細胞系HLA-A2蛋白表達western免疫印跡檢測；
[0058]圖2a受呈遞本發明多肽的樹突細胞激發的T細胞增殖；
[0059]圖2b對照組的T細胞形態；
[0060]圖2c荷載了抗原肽的DCs刺激的T細胞形態；
[0061]圖3T細胞殺傷腫瘤細胞效果；
[0062]圖4T細胞殺傷腫瘤細胞效果；
[0063]圖5T細胞殺傷腫瘤細胞效果；
[0064]圖6T細胞殺傷腫瘤細胞效果；
[0065]圖7T細胞殺傷腫瘤細胞效果；[0066]圖8T細胞分泌細胞因子IFNy ；
[0067]圖9成熟DC細胞表面標記；
[0068]圖1OaT細胞殺傷腫瘤細胞效果；
[0069]圖1ObT細胞殺傷腫瘤細胞效果；
[0070]圖11細胞系MUCl蛋白表達western免疫印跡檢測；
[0071]圖12a抗原肽在小鼠體內治療腫瘤效果；
[0072]圖12b抗原肽在小鼠體內預防腫瘤效果。
【具體實施方式】
[0073]通過以下實施例進一步說明本發明，但這些實施例不在任何方面限制本發明。
[0074]實施例1抗原肽的合成
[0075]人工合成多肽MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGS (SEQ ID NO:1)，以下簡稱為抗原肽。合成的多肽純化至97%。將凍幹的抗原肽溶解於二甲亞碸(25mM)，儲存於_80°C。
[0076]用同樣方法合成多肽FLLLLLTVLT (SEQ ID NO:2), LLLLLTVLTV (SEQ ID NO:3),LLLLTVLTVV (SEQ ID NO:4), FFLLLLLTVL (SEQ ID NO:5), GTQSPFFLLL (SEQ ID NO:6),TQSPFFLLLL (SEQ ID NO:7)，分別簡稱為抗原肽1、抗原肽2、抗原肽3、抗原肽4、抗原肽5和抗原肽6。
[0077]實施例2樹突細胞(Dendritic Cells，DCs)的製備
[0078]外周血中單個核細胞(PBMC)包括淋巴細胞和單核細胞，其體積、形狀比重為
1.075左右。用比重為1.077的Ficol1-Hypaque分離液進行密度梯度離心，使一定比重的細胞按相應密度梯度分布，可將各種血細胞加以分離。
[0079]從香港紅十字血液中心取得健康志願者的白細胞濃縮液，用PBS將其稀釋適當倍數，然後加入到Ficoll-Hypaque分離液表面上，18_20°C, 800g密度梯度離心30min,離心完畢，離心管內容物分為三層，上層為血漿(內含血小板)，中間層為分離液，底層為紅細胞和粒細胞，在上、中層液分界面處可見到乳白色渾濁的PBMC層。取出PBMC層，重懸於PBS中，400g離心lOmin，重複上步，將細胞沉澱重懸於含有10%胎牛血清的RPMI1640中，37°C培養2小時，取出非貼壁細胞，用於分離T細胞，向貼壁的細胞中加入含1000U/ml hGM-CSF和500U/ml hIL-4的RPMI1640培養基，37°C培養I周，誘導單核細胞分化為DCs，其中每兩天換一次培養基和細胞因子，收穫非吸附的及吸附較松的細胞，即為DCs。
[0080]實施例3T細胞的製備(尼龍棉法)
[0081]T細胞表面絨毛短而少，B細胞絨毛多而長，由於細胞表面光滑程度不同，B細胞在37°C時易戮附於尼龍棉纖維上，而T細胞則不具有此能力。利用這一特性，可分離T細胞和B細胞。
[0082]尼龍棉柱的製備:Ig尼龍棉/柱滅菌處理後，加入RPMI1640培養基，37 °C放置2小時，讓RPMI1640流出。將上述的非貼壁細胞重懸於適當體積的RPMI1640中，使得細胞濃度為0.5-1.0x107ml，然後加入到所製備的尼龍棉柱中，2ml/柱，37°C保溫I小時，向尼龍棉柱中加入RPMI1640，IOml/柱，洗脫未吸附到尼龍棉上的細胞，收集洗脫液，即為T細胞懸液。400g離心5min，將細胞沉澱重懸於細胞凍存液中，凍存備用。
[0083]實施例4T細胞增殖測定(3H-TdR摻入法)[0084]細胞增殖的前提是細胞質和細胞核的複製，一般一個細胞周期大致分為4個時期，即Gl期、S期、G2期、M期。其中，S期是DNA合成期，主要功能是進行DNA合成。3H_TdRSP (甲基-3H)胸腺嘧啶核苷酸是DNA合成的前體，將其加入細胞培養液中後，會被細胞攝取，可作為DNA合成的原料。細胞合成的DNA越多，所摻入的3H-TdR也越多，檢測所摻入的3H-TdR就可反映出細胞增殖的程度。
[0085]向DCs的培養液中加入適當濃度的抗原如本實驗的各抗原肽，37°C溫育4小時，收穫DCs，並用PBS洗一次，按照一定的細胞比例，將來自同一志願者的DCs和T細胞加入到96孔平底培養板中，37°C共培養5天後，加入3H-TdR，IuCi/孔，37°C保溫18小時，利用多頭細胞收集器，將細胞收集到玻璃纖維濾紙上，並依次用PBS、5%三氯乙酸和無水乙醇洗滌各三次，烘乾濾紙，將濾紙放入到閃爍液中，在β液閃計數儀上測定cpm值。
[0086]實施例5細胞毒性T淋巴細胞(CTLs)測定(LDH法)
[0087]乳酸脫氫酶(LDH)是活細胞的胞漿內含酶之一，正常情況下不能透過細胞膜，但當靶細胞受到效應細胞攻擊而受損時，細胞膜的通透性改變，LDH就會釋放到介質中。而LDH在催化乳酸生成丙酮酸的過程中，可使氧化輔酶I(NAD)變成還原輔酶I (NADH)，後者再通過遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)還原碘硝基氯化四氧唑(INT)，INT接受H2+被還原成紫紅色的甲肷化合物，該化合物在490nm處有一高吸收峰，利用讀取的A490nm作為指標，可知靶細胞被效應細胞殺傷的程度。
[0088]向DCs的培養液中加入適當濃度的抗原如本實驗的各抗原肽，37°C溫育4小時，收穫DCs，並用PBS洗一次，按照一定的比例，將來自同一志願者的DCs和T細胞加入到24孔培養板中，37°C共培養7-10天，其中培養液中加入20U/ml hIL_2，利用Ficoll-Hypaque密度梯度離心收集T細胞以作為效應細胞。5mM EDTA消化腫瘤細胞系(例如SMMC-7721或K562)細胞以作為靶細胞。
[0089]分別將效應細胞和靶細胞重懸於一定體積的分析培養基(含1%BSA的RPMI1640)中，按不同的比例，將效應細胞(IOOul)和靶細胞(IOOul)加入到96孔圓底培養板中，37°C保溫5小時，取出上清IOOul/孔，並加入到96孔酶標板中，加入IOOul/孔LDH反應液，室溫下暗處反映30min，加入IMHCL終止液，50ul/孔，測定A490nm，A630nm作為參照波長。計算細胞毒性:細胞毒性(%)=[(殺傷試驗孔-靶細胞自發釋放孔-效應細胞自發釋放孔)/ (最大釋放孔-靶細胞自發釋放孔)]X100%。
[0090]注:殺傷實驗孔為效應細胞+靶細胞；靶細胞自發釋放孔為靶細胞+分析培養基；效應細胞自發釋放孔為效應細胞+分析培養基；最大釋放孔為靶細胞+2%TritionX100。
[0091]實施例6ELISA_spot (ELISPOT)法測定 IFNy
[0092]細胞因子ELISP0T法用於測定單細胞懸液中細胞因子分泌細胞的數量，它檢測速度快，具有很高的靈敏度，且易於操作。其原理是先將高親和力的抗細胞因子的抗體包被於ELISP0T板上，當將待測細胞加入到ELISP0T板中後，其所分泌的細胞因子就會被所包被的抗體捕捉到，這樣在除掉待測細胞懸液後，加入標記的另一種抗細胞因子的抗體，然後加入相應的顯色試劑後，就可以在ELISP0T板上產生表示細胞因子分泌數量和位置的斑點。
[0093]向DCs的培養液中加入適當濃度的抗原如本實驗的各抗原肽，37°C溫育4小時，收穫DCs，並用PBS洗一次，按照一定的比例，將來自同一志願者DCs和T細胞加入24孔培養板中，37°C共培養7-10天，其中培養液中加入20U/ml hIL_2，利用Ficol1-Hypaque密度梯度離心並收集T細胞以作為效應細胞，利用5mM EDTA消化SMMC-7721，並用Y射線輻射處理以作為靶細胞，分別將效應細胞和靶細胞重懸於一定體積的培養基中，按一定的比例，將效應細胞(IOOul)和靶細胞(IOOul)加入到預先包被了 IFNy抗體的96孔ELISPOT反應板中，37°C溫育18小時，去除細胞懸液，PBST洗10次，加入生物素標記的IFNy抗體，37°C溫育2小時，PBST洗10次，加入酶標記的抗生物素的抗體，37』 C溫育2小時，PBST洗10次，加入底物溶液，室溫下暗處反應15-30min，利用ELISPOT自動讀數儀進行計數。
[0094]實施例7流式細胞測定(FACS)
[0095]製備單細胞懸液:收穫待測細胞，並用冷的PBS洗滌細胞，將細胞重懸於50ul/管PBS中，加入相應的抗體，冰上放置I小時，用冷PBS洗滌2次，加入FITC標記的二抗，冰上放置30min，用冷PBS洗滌2次，將細胞重懸於2%多聚甲醛中，用於流式細胞測定。
[0096]實施例8Western法鑑定具有MUCl蛋白和HLA-A2蛋白的腫瘤細胞系
[0097]採用本領域通用的SDS-PAGE和Western免疫印跡法，即蛋白質經單向電泳後分離後被轉移到硝酸纖維濾膜上，然後用放射性或酶標記的特異抗體來檢測相應抗原的存在的方法，來鑑定腫瘤細胞含有的蛋白。
[0098]實驗使用了腫瘤細胞系SMMC-7721和SMMC-7721-0201。SMMC-7721是上海細胞生物學研究所提供的可商購的肝癌腫瘤細胞系(參見Lu J.,Xu R.B.and Doung R.C.(1985)The glucocorticoid receptors and the induction of tyrosine aminotransferase byglucocorticoid in the human liver cancer cell line(SMMC-7721)in vitr0.Shi YanSheng Wu Xue Baol8:231-238)。SMMC-7721-0201 是通過在 SMMC-7721 轉染和穩定表達人類HLA-0201基因的細胞系。
[0099]先用0.25%胰蛋白酶消化腫瘤細胞SMMC-7721和SMMC-7721-0201，然後用1640完全培養基(含10%FBS和1%青-鏈黴素)吹散細胞，收集於15ml離心管中。lOOOrpm，離心5min，棄去上清液。用80 μ I P`BS重懸細胞(細胞量多可以適當增加PBS體積)，再加入5 X SDS-PAGE上樣Buffer，混勻後沸水浴煮5min。
[0100]樣品處理後按常規方法進行SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和 Western 免疫印跡實驗。Western 免疫印跡實驗中的一抗分別為抗Mucl單抗和抗HLA-A2單抗(BB7.2細胞上清)，二抗為羊抗鼠 IgG-HRP。
[0101]圖1a和圖1b為SDS-PAGE和Western免疫印跡實驗結果。
[0102]其中圖1a的第I泳道為SMMC-7721-0201細胞株樣品，第二泳道為SMMC-7721細胞株樣品。
[0103]其中圖1b的第一泳道為SMMC-7721-0201細胞株樣品，第二泳道為SMMC-7721細胞株樣品。
[0104]如圖1a所示，腫瘤細胞株SMMC-7721和SMMC-7721-0201都表達了 MUCl蛋白。
[0105]如圖1b 所示，腫瘤細胞株 SMMC-7721 為 HLA-A2 陰性；SMMC-7721-0201 為 HLA-A2陽性。
[0106]另外的實驗還測試了 SMMC-7721和SMMC-7721-0201中MHC I的表達情況，證明細胞株 SMMC-7721 和 SMMC-7721-0201 是 MHC I 陽性。
[0107]實施例9荷載了各抗原肽的DCs刺激T細胞的增殖[0108]利用實施例1 中製備的抗原肽，即 MTPGTQSPFFLLLLLTVLTVVTGS (SEQ ID NO:1)來刺激DCs，然後利用得到的荷載了抗原肽的DCs來刺激自身的T細胞，測定荷載了抗原肽的DCs能否刺激自身T細胞的增殖。
[0109]用10ug/ml抗原肽來荷載DCs，荷載條件是37°C溫育4小時，然後DCs與自身T細胞以不同的比例(DCs:T=1: 10和DCs:T=1:3)進行共培養，5天後，加入3H_TdR，18小時後測定3H-TdR的攝入，以測定T細胞的增殖狀況。作為對照，T細胞與未荷載抗原肽的DCs共培養，或T細胞單獨培養。如圖2a所示，各組T細胞的增殖水平是明顯不同的，在DCs:T=l: 10時，荷載了抗原肽的DCs所刺激的T細胞的增殖水平是未荷載DCs所刺激的T細胞增殖水平的10倍，及單獨培養的T細胞的15倍；當將DCs:T提高到1:3時，T細胞的增殖水平也明顯升高。這些實驗結果表明:荷載了抗原肽的DCs能夠有效的刺激自身T細胞的增殖，而未荷載抗原肽的DCs則不能刺激自身T細胞的增殖。
[0110]另外，如圖2b和2c所示，在形態上，經荷載了抗原肽的DCs刺激的T細胞明顯不同於對照組的T細胞，呈現明顯的激活狀態，如細胞體積增大、數目增多等。
[0111]對抗原肽1、抗原肽2、抗原肽3、抗原肽4、抗原肽5和抗原肽6進行相同測試，荷載了抗原肽的DCs能夠有效的刺激自身T細胞的增殖。
[0112]實施例10荷載了各抗原肽的DCs能夠激活腫瘤細胞特異性的CTLs
[0113]在機體抗腫瘤的免疫應答中，CTLs發揮著極其重要的作用。利用實施例1中製備的抗原肽來刺激DCs，然後利用製得的荷載了抗原肽的DCs來刺激自身的T細胞，測定荷載了抗原肽的DCs能否激活腫瘤細胞特異性的CTLs。
[0114]用不同濃度的抗原肽來荷載DCs,37°C溫育4小時，然後DCs與T細胞以DCs: T=1: 5的比例進行共培養，7-10天後， 利用LDH法測定T細胞對表達MUCl蛋白的肝癌細胞SMMC-7721-0201的殺傷力。實驗中，T細胞與荷載抗原肽的DCs共培養，作為對照，T細胞與未荷載抗原肽的DCs共培養、或T細胞單獨培養。如圖3所示，經荷載了抗原肽的DCs所刺激的T細胞能夠有效的殺傷表達MUCl蛋白的腫瘤細胞，而與未荷載抗原肽的DCs共培養的T細胞及單獨培養的T細胞則不能殺傷腫瘤細胞。如圖4所示，當增加荷載DCs的抗原肽的濃度時，經此DCs所刺激的T細胞對腫瘤細胞的殺傷能力也隨之增強。
[0115]為了測定效應細胞對腫瘤細胞的殺傷力是由於激活了腫瘤細胞特異的CTLs而不是由於非特異性殺傷細胞NK細胞的存在，在細胞毒性測定中，利用可商購的NK細胞敏感性細胞系K562(ATCC.Cat.n0.:CCL_243)作為靶細胞，如圖5所示，經荷載了抗原肽的DCs刺激的T細胞能夠有效的殺傷表達MUCl蛋白的肝癌細胞SMMC-7721，而SMMC-7721正是抗原肽的來源細胞。但經荷載了抗原肽的DCs刺激的T細胞不能殺傷K562細胞。表明殺傷肝癌細胞的是特異性的CTLs而不是非特異的NK細胞。
[0116]為了進一步測定對肝癌細胞殺傷活性的特異性，在細胞毒性測定中，利用了人的肝癌細胞系SMMC-7721-0201和SMMC-7721作為靶細胞，另外，為了測定殺傷活性是否是MHCI限制性的，將靶細胞表面的MHC I用抗MHC I的抗體封閉，如實施例8的結果所述，其中SMMC-7721-0201和SMMC-7721都是MHC I和抗原肽陽性。如圖6實驗結果顯示，CTLs對SMMC-7721-0201的殺傷活性明顯高於對SMMC-7721的殺傷活性，當SMMC-7721-0201表面的MHC I被封閉後，CTLs對其的殺傷力也消失了，相反的，當SMMC-7721表面的MHC I被封閉後，CTLs對其的殺傷力卻沒有明顯變化。這表明CTLs對SMMC-7721的殺傷力是MHC I限制性，從而說明了對SMMC-7721的殺傷活性是由CTLs介導的。
[0117]由於作為抗原來源的細胞SMMC-7721和作為效應細胞的T細胞不是來自同一個體，所以T細胞對SMMC-7721的殺傷活性可能是同種異型反應(allogeneic response)。為了排除這種同種異型反應的可能性，在細胞毒性測定中，利用荷載了抗原肽的DCs及未荷載的DCs作為靶細胞。如圖7所示，由於DCs和T細胞是來自於同一個體，因此T細胞對未荷載的DCs沒有殺傷活性，相反的，T細胞對荷載了抗原肽的DCs表現出明顯的殺傷活性，這是由於荷載了抗原肽的DCs對抗原肽所結合的腫瘤多肽進行了加工呈遞，在細胞表面表達腫瘤抗原，這表明CTLs對SMMC-7721的殺傷活性是特異於腫瘤抗原的抗腫瘤免疫應答而不是同種異型反應。 [0118]以上實驗結果表明:抗原肽所結合腫瘤抗原被DCs成功的加工並呈遞給T細胞，從而有效的激活了腫瘤細胞特異的CTLs。
[0119]對抗原肽1、抗原肽2、抗原肽3、抗原肽4、抗原肽5和抗原肽6進行相同測試，其能有效激活腫瘤細胞特異的CTLs。
[0120]實施例11荷載了抗原肽的DCs能夠刺激T細胞分泌細胞因子IFN Y
[0121]在抗腫瘤的免疫應答中，細胞介導的抗腫瘤應答起著關鍵作用，其中，CTLs反應和IFNy的分泌是細胞應答的主要特徵。
[0122]測定了荷載了抗原肽的DCs能否刺激自身T細胞分泌細胞因子IFNy。按實施例6描述的方法，用40ug/ml的抗原肽荷載DCs，37°C溫育4小時，然後DCs與T細胞以DCs: T=1: 5的比例進行共培養，7-10天後，測定T細胞分泌IFN Y的狀況。作為對照，T細胞與未荷載抗原肽的DCs共培養，或T細胞單獨培養。刺激過的自身T細胞通過梯度離心收穫，IFNy分泌用ELISPOT測定。自身T細胞和未荷載抗原肽DCs共培養及自身T細胞自身作為對照。如圖8所示，經荷載了抗原肽的DCs所刺激的T細胞在遇到靶細胞SMMC-7721時，能夠分泌高水平的IFN Y，而經未荷載抗原肽的DCs刺激的T細胞及單獨培養的T細胞在遇到靶細胞SMMC-7721時，則沒有明顯的IFNy分泌。此實驗結果與上述的CTLs實驗結果相一致，表明荷載了抗原肽的DCs能夠激活腫瘤細胞特異的T細胞，該T細胞能夠分泌高水平的細胞因子IFNy。
[0123]實施例12抗原肽刺激DCs成熟
[0124]如上所述，荷載了抗原肽的DCs能夠激活腫瘤細胞特異性的CTLs，這表明DCs已經加工呈遞了抗原肽所結合的腫瘤抗原，並引發了特異性的抗腫瘤免疫應答。由於DCs的表型轉變，即由不成熟DCs轉變成成熟DCs，是DCs發揮作用的前提，所以可以推出荷載了抗原肽的DCs必定發生了表型轉變。為了檢測這一推論，測定了抗原肽能否刺激DCs的成熟。
[0125]DCs在與40ug/ml的抗原肽於37°C溫育4小時後，繼續培養48小時，然後利用流式細胞技術測定DCs表面的HLA-DR、⑶80、⑶86、⑶83和⑶40的表達狀況。如圖9所示，經抗原肽刺激後，DCs表面的HLA-DR、共刺激分子⑶80和⑶86、及細胞成熟標誌分子⑶83和CD40的表達水平明顯提高。這表明，抗原肽能夠有效的刺激DCs成熟，是DCs的有效活化分子。
[0126]以上各實驗結果表明，從腫瘤細胞中分離純化的各抗原肽結合了腫瘤抗原，能夠有效的刺激DCs的成熟；而且荷載了抗原肽的DCs能夠有效的加工呈遞腫瘤抗原，並激活腫瘤細胞特異性的抗腫瘤細胞免疫應答，其中包括刺激T細胞的增殖、激活腫瘤細胞特異的CTLs和刺激T細胞分泌細胞因子IFN Y等。
[0127]實施例13荷載了抗原肽的DCs能夠激活腫瘤細胞特異性的CTLs並有效攻擊腫瘤細胞
[0128]本實驗測試了本發明的各抗原肽的HLA表型特異性。
[0129]實驗採用了購自PerkinElmer (AD0116)的試劑盒進行細胞毒性T淋巴細胞的殺傷性測定:
[0130]用0.25%胰蛋白酶消化靶細胞(腫瘤細胞SMMC-7721和SMMC-7721-020，其中 SMMC-7721 和 SMMC-7721-0201 都為 MUCl 蛋白陽性；SMMC-7721 為 HLA-A2 陰性；SMMC-7721-0201為HLA-A2陽性)後用1640完全培養基(含10%FBS和1%青-鏈黴素)洗滌一次；再用1640完全培養基重懸細胞，調整細胞數到lX106cells/ml。取Iml細胞加入I μ I BATDA, 37°C，5%C02培養箱中放置15min。然後200g，離心5min，棄去上清，用含2%FBS的PBS洗滌5次，每次200g離心5min。最後用1640完全培養基重懸細胞，並調整細胞數為5 X 104cells/ml。
[0131]通過如實施例9描述的方法向DCs的培養液中分別加入適當濃度的抗原，包括抗原肽和抗原肽2來刺激DCs，然後利用得到的荷載了所述抗原肽的DCs來刺激自身的T細胞。
[0132]收集已被刺激的CD8+T細胞，1000rpm離心，棄上清，用1640完全培養基重懸CD8+T細胞，調整細胞數到lX106cells/ml。
[0133]取100 μ I CD8+T細胞和100 μ I腫瘤細胞(BATDA-loaded)加入至Ij 96孔板中。同時設立空白對照組(培養基對照)，腫瘤細胞自發釋放組(100 μ I腫瘤細胞+100 μ I培養基)和腫瘤細胞最大釋放組(10 μ I裂解液+90 μ I培養基+100 μ I腫瘤細胞)，τ細胞設立未刺
激組。實驗組需要設立3個重複孔。
[0134]將96孔板放於37°C，5%C02培養箱中培養2h後，200g離心5min，吸取20 □ I上清到Elisa板中(試劑盒自帶),並加入200 □ I Europium Solution,室溫水平搖動15min。使用PerkinElmer公司的檢測儀器(Victor2V multilabel counter)進行檢測,激發濾光片(emission filter)選擇 615nm。
[0135]實驗結果的計算:
[0136]
實駿嫌—胂瘤細胞自犮釋放組
攻擊效果(%) = --- X 1001
腫瘤細胞最大釋放組一I+瘤細胞自發釋放組
[0137]結果如圖1Oa和圖1Ob所示。其中圖1Oa中顯示的是使用抗原肽荷載DCs後攻擊腫瘤細胞的結果，圖1Ob為使用抗原肽2荷載DCs後攻擊腫瘤細胞的結果。
[0138]實驗結果顯示，負載抗原(包括抗原肽和抗原肽2)的DCs刺激的T細胞都可以殺傷MUCl 蛋白陽性的 SMMC-7721 和 SMMC-7721-0201。其中殺傷 SMMC-7721-0201 細胞(HLA-A2+，MUCl+)的能力要高於SMMC-7721細胞(HLA_A2_，MUC1+)。證明本發明的抗原肽更有效攻擊HLA-A2陽性細胞。
[0139]實施例14動物實驗:荷載了抗原肽的DCs在小鼠體內抑制腫瘤
[0140]1.構建穩定表達MUCl蛋白的B16 (用於動物實驗)細胞系[0141]B16為可商購的小鼠黑色素瘤細胞株(ATCC CAT.N0.CRL-6322)。含MUCl基因的質粒購自 Origene 公司(Cat.N0.RC221390)。
[0142]用0.25%胰蛋白酶消化B16細胞，並用1640完全培養基(含10%FBS和1%青-鏈黴素)吹散細胞。然後取適量細胞鋪在24孔板中(共接種三個孔)，36h後利用脂質體轉染法轉染含MUCl基因的質粒進入B16細胞中(質粒為0.5 μ g/孔)。第二天用0.25%胰蛋白酶消化轉染後的細胞，分接到所有的24個孔中，繼續培養。第三天換液，加入含1.2mg/mlG418的1640完全培養基繼續培養。
[0143]每天觀察細胞的死亡情況，隔天換液；四天後存活細胞逐漸穩定，對細胞進行有限稀釋，接種到96孔板中，細胞量為0.5個細胞/孔(接10-20塊96孔板)。觀察96孔板中細胞的生長狀況，尋找單克隆細胞，並做下標記。對已長滿細胞孔的單克隆細胞進行擴大培養，收集細胞後採用如前所述的Western方法鑑定MUCl陽性的細胞。對鑑定陽性的細胞進行擴大培養並凍存。
[0144]圖11中，第I泳道為未轉染的B16細胞株，第2泳道為MUC1-4單克隆細胞，第3泳道為MUC1-6單克隆細胞。
[0145]從圖11結果看，MUC1-4和MUC1-6 二株單克隆細胞有明顯條帶，檢測為陽性。所以確定MUC1-4和MUC1-6 二株單克隆細胞為穩定表達MUCl蛋白的B16細胞系。
[0146]2.動物實驗
[0147]實驗小鼠(C57BL/6小鼠，6_8周齡)分為兩組:治療組和免疫保護組。其中治療組為先給予小鼠腫瘤細胞，然後給予本發明的多肽(分別為抗原肽和抗原肽2)。其中免疫保護組為先給予小鼠本發明的多肽(分別為抗原肽和抗原肽2)，然後給予腫瘤細胞。
[0148]治療組:實驗小鼠共32隻，分為4組，每組8隻，並標記為A、B、C、D。其中A組8隻小鼠注射B16細胞，剩餘3組都注射B16-MUC1-4細胞。接種部位為前肢右腋皮下，每隻小鼠注射I X IO4細胞，劑量為200 μ I。一周後開始注射多肽，A和B兩組共16隻小鼠注射PBS，C和D兩組分別注射兩種多肽:抗原肽和抗原肽2，每隻小鼠注射40 μ g/100 μ I。以後二周各組每周再重複注射一次同樣的多肽，劑量相同，每天觀察小鼠腫瘤生長情況，並記錄數據。
[0149]圖12a為抗原肽在小鼠體內治療腫瘤效果。
[0150]其中，
[0151]B16_g:A 組，注射 B16 細胞；
[0152]B16-mg:B 組，注射 B16-MUC1-4 細胞；
[0153]B16-mg53:C 組，注射 B16-MUC1-4 細胞和抗原肽 2 ；
[0154]B16-mg64:D 組，注射 B16-MUC1-4 細胞和抗原肽；
[0155]由於B16_g和B16_mg兩組結果相同，所以線條重疊。
[0156]圖12b為抗原肽2在小鼠體內免疫預防腫瘤效果。
[0157]其中
[0158]B16_g:E 組，注射 B16 細胞；
[0159]B16-mg:F 組，注射 B16-MUC1-4 細胞；
[0160]B16-mg53:G 組，注射 B16-MUC1-4 細胞和抗原肽 2 ；
[0161]B16-mg64:H 組，注射 B16-MUC1-4 細胞和抗原肽。[0162]從實驗結果得出，和對照組比較，注射多肽組的小鼠能夠延長壽命超過兩周。給予抗原肽和抗原肽2之間的比較，以給予抗原肽組小鼠的存活率高。從實驗分組上比較，注射多肽組中，免疫組小鼠的存活率比治療組高。
[0163]以上各實驗結果表明，本發明提供的多肽，包括SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的抗原肽和其片段，包括其連續8-10個胺基酸，特別是連續10個胺基酸的片段(例如多肽FLLLLLTVLT, LLLLLTVLTV, LLLLTVLTVV, FFLLLLLTVL, GTQSPFFLLL, TQSPFFLLLL),能夠有效地刺激腫瘤特異性的DCs的成熟，而且荷載了抗原肽的DCs能夠有效的加工呈遞腫瘤抗原，並激活腫瘤細胞特異性的抗腫瘤細胞免疫應答，其中包括刺激T細胞的增殖、激活腫瘤細胞特異的CTLs和刺激T細胞分泌細胞因子IFN Y等。
[0164]不受任何理論限制的，發明人探討了本發明的抗原多肽的治療和預防作用。計算輔助方法在近年已經成為一種成熟的，有效的和高效的分析蛋白或多肽結構和功能的方法，已被廣泛應用於包括分析抗原表位的蛋白分析和預測中。本領域技術人員能總結和根據蛋白的結構功能研究，鑑定對於活性或結構重要的相似多肽中的殘基，從而預測蛋白質中胺基酸殘基的作用，進而分析蛋白質胺基酸序列的活性和功能。計算輔助方法在近年已經成為一種比較成熟的，有效的和高效的確定抗原表位方法。計算輔助確定抗原表位通過對現有數據的整理、分析，根據得到的規律建立表位活性模型，通過計算機方法分析和預測具有抗原性的表位的序列和其與抗原或MHC的結合活性。
[0165]一般說來抗原性識別區域具備親水、位於蛋白表面和結構上易變形性等特點。因為在大多數的天然(自然)環境中，親水區域傾向於集中在蛋白表面，而疏水區域常常被包裹在蛋白內部，同樣道理，抗體只能與在蛋白表面發現的識別區域相互作用，而當這些識別區域有足夠的結構易變形性而轉移到抗體可接觸的位置時，將會與抗體間有很高的親和性。連續的與不連續的 識別區域是由連續或不連續的胺基酸序列(殘基)構成的識別區域。很多抗體是針對連續識別區域的表位，抗體能與這類表位以很高的親和力相結合。不連續的識別區域是代表有一定摺疊的一段多肽序列，或是將兩段分離開的多肽連在一起的抗體的識別區域。在某些情況下，針對這樣不連續識別區域的抗體也能產生，但這些抗原多肽具備與該不連續識別區域相似的二級結構，而序列的長度需要符合相關的要求。表位的長度通常在8-20個胺基酸殘基之間。
[0166]應用生物信息學方法分析，用表位預測網站如http: //www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/ ；http://www.epitope-1nformatics.com/Links.htm ；http://bi0.dfc1.harvard.edu/Tools/index.html 等，以及 SYFPEITHI, BIMAS, IMMUNEEPITOPE, MHC2PRED等多種軟體對本發明的抗原肽進行了分析。
[0167]通過上述手段分析了不同HLA-A，-B, -C與本發明的抗原肽或其片段及其表位序列變異體的結合力的差異，特別是HLA A2分子與HLA A3分子，發現在本發明的所述抗原肽(SEQ ID NO:1)中存在具有高效激活ra8+T細胞的表位，包括其連續8-10個胺基酸，特別是連續 10 個胺基酸的片段(例如多肽 FLLLLLTVLT，LLLLLTVLTV, LLLLTVLTVV, FFLLLLLTVL,GTQSPFFLLL, TQSPFFLLLL等)，以及在所述抗原肽中存在具有高效激活CD4+T細胞的表位，包括:MTPGTQSPFF LLLLLTVLTV VTGS、MTPGTQSPFF LLLLL 和 SPFF LLLLLTVLTV VTGS 等。這些表位在 HLA A2(包括 A*0201、A*0202、A*0204、A*0205、A*0206、A*0207 和 A*0208)與 HLAA3(包括A*0301、A*1101、A*3101和A*6801)中與HLA分子的結合力較高。[0168]本發明出乎意料地發現了 SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的抗原肽和其片段，包括其連續8-10個胺基酸，特別是連續10個胺基酸的片段(例如多肽FLLLLLTVLT，LLLLLTVLTV, LLLLTVLTVV, FFLLLLLTVL, GTQSPFFLLL, TQSPFFLLLL)，能夠有效地刺激腫瘤特異性的DCs的成熟，而且荷載了抗原肽的DCs能夠有效的加工呈遞腫瘤抗原，並激活腫瘤細胞特異性的抗腫瘤細胞免疫應答，在動物體內能有效地治療或預防腫瘤。因此，本發明提供了腫瘤多肽抗原作為癌症疫苗的應用。同時，本發明提供了所述多肽有效地致敏樹突狀細胞得到的DC腫瘤疫苗，或用上述腫瘤多肽抗原致敏的樹突狀細胞激活T細胞而製成的T細胞腫瘤疫苗，以及直接應用這些多肽或組合物為腫瘤疫苗的製備方法及用途。[0169]除非另外指出，本發明的實踐將使用生物技術、有機化學、無機化學等的常規技術，顯然除在上述說明和實施例中所特別描述之外，還可以別的方式實現本發明。其它在本發明範圍內的方面與改進將對本發明所屬領域的技術人員顯而易見。根據本發明的教導，許多改變和變化是可行的，因此其在本發明的範圍之內。本文所提到的所有專利、專利申請與科技論文均據此通過引用結合到本文。
【權利要求】
1.一種分離的多肽或其變體，所述多肽包含與下列(a)或(b)的胺基酸序列相同或基本上相同的胺基酸序列: (a)SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列； (b)所述(a)的胺基酸序列的片段。
2.權利要求1的多肽或其變體，其中(b)中所述片段為包含SEQID NO:1所示的胺基酸序列中連續10個胺基酸的片段。
3.權利要求2的多肽或其變體，所述片段具有LLLLLTVLTV的胺基酸序列。
4.權利要求1-3中任一項的多肽或其變體，所述片段可結合HLAI分子並被CD8+T細胞識別。
5.權利要求4的多肽或其變體，其中所述HLAI為HLA A2或HLA A3型，優選為HLAA2,更優選為 A*0201 或 A*0202。
6.一種分離的核酸，其基本上由編碼權利要求1-5中任一項的多肽的鹼基序列組成。
7.抗原呈遞細胞，其可在細胞表面呈遞權利要求1-5中任一項的多肽或其變體，優選的，所述抗原呈遞細胞為樹突細胞。
8.免疫效應細胞，其可識別權利要求1-5中任一項的多肽或其變體或在細胞表面呈遞權利要求1-5中任一項的多肽或其變體的抗原呈遞細胞，優選的，所述免疫效應細胞為T細胞，例如CD8+T細胞。
9.產生抗原呈遞細胞的方法，所述方法包括將權利要求1-5中任一項的多肽或其變體與具有抗原呈遞能力的細胞接觸的步驟，或是包括將權利要求6中的核酸在具有抗原呈遞能力的細胞中表達的步驟，優選的，所述具有抗原呈遞能力的細胞為樹突細胞。
10.產生免疫效應細胞的方法，所述方法包括將權利要求7的抗原呈遞細胞與具有免疫效應能力的細胞接觸的步驟，優選的，所述抗原呈遞細胞為樹突細胞，以及，優選的，其中所述免疫效應細胞為T細胞，例如cd8+t細胞。
11.一種在患者中治療或預防癌症的疫苗或藥物組合物，其包括權利要求1-5中任一項的多肽或其變體，或包括權利要求6的核酸，或包括權利要求7的抗原呈遞細胞，或包括權利要求8的免疫效應細胞。
12.權利要求11的疫苗或藥物組合物，其中所述患者的HLA為HLAI型，優選為HLA A2或HLA A3型，優選為HLA A2型，更優選為A*0201或A*0202型。
13.權利要求11或12的疫苗或藥物組合物，其中所述癌症為血癌、實體瘤等，優選為肺癌、惡性淋巴瘤(例如網狀細胞肉瘤、淋巴肉瘤、霍奇金病等)、消化器官癌(例如胃癌、膽囊癌、膽管癌、胰腺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌等)、乳腺癌、卵巢癌、肌與骨骼肉瘤(例如骨肉瘤等)、膀胱癌、白血病(例如急性白血病，包括慢性髓細胞性白血病急性發作)、腎癌、前列腺癌。
14.權利要求1-5中任一項的多肽或其變體,或權利要求6的核酸,或權利要求7的抗原呈遞細胞，或權利要求8的免疫效應細胞在用於製備治療或預防癌症的疫苗或藥物組合物中的用途。
【文檔編號】A61P35/00GK103570821SQ201310320478
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年7月27日 優先權日:2012年7月27日
【發明者】謝雍, 杜琳 申請人:北京智飛綠竹生物製藥有限公司