一對擴增嗜酸硫桿菌屬16SrRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測嗜酸硫桿菌的方法

2023-04-25 01:47:06

專利名稱：一對擴增嗜酸硫桿菌屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測嗜酸硫桿菌的方法
技術領域：
本發明涉及一對擴增嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測嗜酸硫桿菌的方法
背景技術：
生物冶金技術是利用微生物、空氣和水等天然物質從礦石中直接提取有價金屬，而無需選礦及火法煉製的短流程清潔生產工藝，通過微生物氧化礦石產生硫酸高鐵和硫酸等浸出劑，浸出過程基本不消耗除礦石、水、空氣以外的其它資源，沒有二氧化硫排放，資源消耗低，對環境友好。生物冶金新技術使浮選-火法冶煉工藝不能利用的低品位及偏遠地區銅資源得以大規模開發，並使過去長年堆存的表外礦即使含銅0. 1 %以下亦有經濟利用價值。生物冶金技術被認為是二十一世紀礦產資源加工的戰略性技術。 生物冶金過程是一個化學過程，微生物的作用主要是氧化鐵和還原態硫，以及提供溶解反應發生的空間(胞外聚合層)，但是細菌的作用是不能忽視的。浸礦環境中的細菌可以分為兩種一種就是可以氧化鐵或(和)硫的細菌，如At. ferrooxidans，氧化Fe"的速度是溶解氧氧化速度的5X 105 1 X 106倍，產生的Fe3+通過化學作用氧化硫化礦，氧化硫產生的硫酸也可溶解一部分硫化礦；還有一種菌就是異養菌，它們通過代謝自養菌產生的有機物獲得能量，一方面可以消除有機物對自養菌的毒害作用，另一方面可以在低氧壓條件下異養生長，以Fe3+為電子受體，可以產生Fe2+供鐵氧化菌利用，如Acidiphiliumacidophilum。 生物浸礦過程是一個複雜的過程，其中涉及多種因素(生物、化學、物理)的相互作用，微生物群落會隨著浸礦環境中溫度、pH、溶解氧濃度、C02濃度、Fe37Fe2+、硫酸鹽濃度和金屬離子濃度等的變化而變化，而微生物群落的變化就會影響到浸礦的效率。現有的浸礦微生物檢測的方法多是基於PCR擴增後，再對所擴增的PCR產物進行檢測，這種終點法的檢測往往不能真實的反應浸礦環境中的微生物組成。在PCR基礎上發展起來的real-timePCR技術，實現了環境中微生物組成的起點檢測，省去了電泳檢測的時間，使得檢測的時間大大縮短，同時提高了檢測的準確性，並能夠檢測低至幾個拷貝的分子。
因此，real-time PCR技術的應用能夠解決快速定量檢測浸礦微生物的要求。

發明內容
本發明提供一對擴增嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測嗜酸硫桿菌屬的方法，該方法實現了環境中微生物組成的起點檢測，省去了電泳檢測的時間，使得檢測的時間大大縮短，同時提高了檢測的準確性，並能夠檢測低至幾個拷貝的分子。 為實現上述目的，本發明採取以下技術方案 本發明提供的用於檢測嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)的引物對包括正向引物(F) (5' -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和反向引物(R) (5' -CATTGCTTCGTCAGGGTTG-3')(引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成)。 這種利用權利要求1所述引物對的實時PCR的定量檢測嗜酸硫桿菌屬方法，其特徵在於它包括以下步驟 (1)、選擇陽性克隆，提取該克隆的16S rDNA，以該DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，切膠純化，以純化後的基因組DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，測定產物的吸光度值，並將吸光度值轉化成DNA濃度，再將DNA產物的質量轉化為拷貝數；純化的PCR產物定量後，進行梯度稀釋，並以PCR產物為模板，數據構建標準曲線； (2)、在實時定量PCR儀中擴增環境中嗜酸硫桿菌屬的16S rDNA基因，通過儀器檢測擴增過程中相應的螢光信號，然後利用(1)中已建好的標準曲線將螢光信號轉換到起始反應的核酸分子拷貝數。 由於細菌在進化過程中基因存在一定的突變，因此在引物設計時在Genbank中選取某種細菌及相似細菌的16S rDNA序列進行比對，挑取該種細菌不同於別的細菌的序列作為設計引物的基礎(用Promega 3)。 本發明提供的用於檢測嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)的方法為以上面提供的引物對在實時定量PCR儀中擴增環境中嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)的16SrDNA基因。通過儀器檢測擴增過程中相應的螢光信號，然後利用已建好的標準曲線將螢光信號轉換到起始反應的核酸分子拷貝數，從而達到定量檢測環境樣品中嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)的數量。


圖1為嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)的標準曲線
圖2為3種樣品的螢光變化曲線圖
具體實施方式
實施例1 挑取本實驗室保存的與Acidithiobacillus sp.(該標準菌株Acidithiobacillussp.可從中國典型培氧物保藏中心購買(武漢)具有99%相似性的陽性克隆，提取該克隆的16S rDNA，以該DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，採用Applied Biosystems的GeneAmp PCR System 2700型基因擴增儀。50 ii 1的反應體系組成為5 Xbuffer lOiU，25mM Mg2+3ii 1， 10mM dNTP 1 P 1，正向引物(F) 0. 5 ii 1 ，反向引物(R) 0. 5 ii 1，模板1 ii 1，GoT叫DNA聚合酶O. 25iU，無菌去離子水33. 75iU，每個樣品做3個重複。反應條件為95°C預變性2min，然後為30個循環的95°C變性45s， 54°C退火45s， 72°C延伸lmin，最後72"C延伸10min。反應結束後將所得PCR產物按照Promega的Wizard SV Gel and PCRClean-Up System操作說明進行切膠純化。純化後的PCR產物採用Optizen 2120紫外分光光度計(MecasysCo. ， Ltd.)在260nm測定產物的吸光度值。然後根據公式(濃度=0D260 X 50 ii g/ml X稀釋倍數)將吸光度值轉化成DNA濃度。再根據下面的公式將DNA產
物的質量轉化為拷貝數
質量(g) x阿佛加德羅常數 +血n札
單個5JS的平均摩爾質量X模板長度
對於雙鏈DNA，採用660g/摩爾/鹼基。10—9g的400bp的PCR產物相當於2. 51X109 個拷貝。 純化的PCR產物定量後，進行梯度稀釋，使得PCR產物的拷貝數為1C)7-101。以此 PCR產物為模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000實時定量PCR儀進行擴增。 25iU的反應體系組成為12. 5iU的含有SYBRGreen I染色劑、AmpliTaq Gold 醒聚 合酶、dNTPs和緩衝溶液的SYBRGreen PCR Master Mix(Applied Biosystems)，正向引物 (F)6. 25pmol，反向引物(R)6. 25pmol，模板1 yl，無菌去離子水6. 5 yl，每個樣品做3個重 復。反應條件為95t:預變性5min，然後為45個循環的95。C變性15s，6(TC延伸lmin。反 應結束後，將溫度由65t:緩慢升至95t:進行溶解曲線分析，檢測反應的特異性。
反應結束後，將溫度緩慢升高，此時雙鏈DNA解鏈成為單鏈，內參的螢光染料會被 釋放出來，螢光信號逐漸減弱。基於產物長度和G/C含量的不同，擴增產物會在不同的溫度 點解鏈。隨著產物的解鏈就可以看到螢光值的降低並被儀器所測量。對溶解曲線進行微 分可以計算出溶解峰。溶解峰可以反映反應中擴增到的產物，因此用溶解曲線就可以對反 應的特異性進行監督了。如果溶解曲線只有一個峰，說明反應的特異性很好，如果出現多個 峰，說明有非特異性產物生成，結果就不可信。 反應結束後，利用軟體(軟體為Rotor-Gene 6000 series software versionl. 7(Build 3))將反應中的數據構建標準曲線(如圖1) 。 R表示所構建標準曲線的 相關係數，R'2表示標準曲線相關係數的平方，M表示標準曲線的斜率，B表示標準曲線的截 距，Efficiency表示反應的擴增效率。通常好的標準曲線R > 0. 99， R'2 > 0. 97。
實施例2 分別提取3種環境樣品(搖瓶浸出、柱浸和生物堆浸)中的微生物基因組DNA，用 Promega的基因組DNA純化試劑盒(Promega， USA)，按照操作說明將DNA粗提液純化。以純 化後的基因組DNA作為模板，利用Corbett Research的Rotor-Gene 6000實時定量PCR儀， 採用特異性擴增嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)、引物對進行擴增。25iU的反應體系 組成為12. 5iU的含有SY服Green I染色劑、八!^1^&9001(1@0脆聚合酶、(1^1^和緩衝溶 液的SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems,為進口的一種試劑名稱)，正向引 物(F)6. 25pmol，反向引物(R)6. 25pmol，模板1 yl，無菌去離子水6. 5 yl，每個樣品做3個 重複。反應條件為95t:預變性5min，然後為45個循環的95t:變性15s，6(TC延伸lmin。反 應結束後，將溫度由65t:緩慢升至95t:進行溶解曲線分析，檢測反應的特異性。然後導入 已建立的標準曲線利用螢光定量PCR儀自帶的軟體計算Ct值，之後將Ct值轉化為核酸分 子的拷貝數。然後根據轉化係數(Acidithiobacillus sp.為12)將拷貝數轉化為細胞數。 (由於細菌通常存在多個拷貝的16S rRNA基因，因此需要一個轉化係數將拷貝數轉化為細 菌數，這個轉化係數在Zammit，C.M. ，Mutch，L.A. ，Watling，H. R. and Watkin，E. L. J. ，2008. Evaluation of quantitative real—tim印olymerase chain reaction for enumeration of biomining microorganisms in culture Hydrometallurgy94(1_4) :185-189.中可以 查閱。) 經計算嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobaci 1 lus)在3種樣品中的數量分別為4. 3X 105/mL、l. 3X106/mL、5. 3X103/g。 申請人:採用本方法檢測過多種其他菌種(包括大腸桿菌、假單胞菌，以及四種待 檢測細菌互相進行引物驗證)，結果發現反應特異性很好，非待測菌株曲線不起飛，沒有信號。本發明的檢測限為IO個拷貝，檢測在10-10'7(10-107)個拷貝間。序列表〈110〉北京有色金屬研究總院〈120〉 一對擴增嗜酸硫桿菌屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測嗜酸硫桿菌的方法〈130〉〈160>2〈170>PatentIn version 3. 1〈210>1〈211>19〈212>DNA〈213〉人工合成〈400>1gagtttgatc ctggctcag 19〈210>2〈211>19〈212〉DNA〈213〉人工合成〈400>2cattgcttcg tcagggttg 19
權利要求
一對擴增嗜酸硫桿菌屬16S rRNA基因的引物，其特徵在於所述的引物對包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是(5』-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』)，反向引物的序列是5』-CATTGCTTCGTCAGGGTT G-3』.
2. —種利用權利要求1所述引物對的實時PCR的定量檢測嗜酸硫桿菌屬方法，其特徵 在於它包括以下步驟(1) 、選擇陽性克隆，提取該克隆的16S rDNA，以該DNA為模板用上述引物進行PCR擴 增，切膠純化，以純化後的基因組DNA為模板用上述引物進行PCR擴增，測定產物的吸光度 值，並將吸光度值轉化成DNA濃度，再將DNA產物的質量轉化為拷貝數；純化的PCR產物定 量後，進行梯度稀釋，並以PCR產物為模板，數據構建標準曲線；(2) 、在實時定量PCR儀中擴增環境中嗜酸硫桿菌屬的16S rDNA基因，通過儀器檢測擴 增過程中相應的螢光信號，然後利用(1)中已建好的標準曲線將螢光信號轉換到起始反應 的核酸分子拷貝數。
3. 根據權利要求1所述引物對的實時PCR的定量檢測嗜酸硫桿菌屬方法，其特徵在 於所用的反應體系組成為12. 5iU的含有SY服Green I染色齊U、 AmpliTaq Gold DNA聚 合酶、dNTPs和緩衝溶液的SYBR GreenPCR Master Mix，正向引物(F) 6. 25pmol，反向引物 (R)6. 25pmol，模板1 y l，無菌去離子水6. 5iU，每個樣品做3個重複。
4. 根據權利要求1所述引物對的實時PCR的定量檢測嗜酸硫桿菌屬方法，其特徵在於 所用的反應條件為95t:預變性5min，然後為45個循環的95。C變性15s，6(TC延伸lmin。
5. 根據權利要求1所述引物對的實時PCR的定量檢測嗜酸硫桿菌屬方法，其特徵在於 所述的環境為生物浸出液或酸性礦坑水。
全文摘要
本發明提供一對擴增嗜酸硫桿菌屬16S rRNA基因的引物以及實時PCR定量檢測嗜酸硫桿菌的方法，所述的引物對包括正向引物和反向引物，所述的正向引物的序列是(5』-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』)，反向引物的序列是5』-CATTGCTTCGTCAGGGTTG-3』。傳統方法相比，本方法具有時間短、通量大、工作量小、可靠性高的優點，從樣品的處理到定量檢測環境中嗜酸硫桿菌屬(Acidithiobacillus)的時間縮短至4小時，而且由於是一種起始檢測法，檢測結果更加準確。
文檔編號C12Q1/06GK101705284SQ20091020458
公開日2010年5月12日 申請日期2009年12月1日 優先權日2009年12月1日
發明者劉興宇, 溫建康, 陳勃偉 申請人:北京有色金屬研究總院