dsRNA及其組合在控制蚜蟲危害中的應用的製作方法

2023-04-25 05:15:26 1

專利名稱：dsRNA及其組合在控制蚜蟲危害中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及dsRNA及其組合在控制蚜蟲危害中的應用。
背景技術：
麥蚜(尤其是麥長管蚜)是危害中國小麥生產的主要害蟲之一，據統計，中國每年小麥蚜蟲危害面積可高達0.17億公頃，佔小麥總種植面積的62%，造成減產15% — 30%，嚴重時可高達50%。近年來，由於全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲的繁殖能力和適應性顯著增強，其危害日趨嚴重。目前，蚜蟲防治以噴灑農藥為主，但大量使用農藥，不僅對人畜有害，而且造成了嚴重的環境汙染。培育抗蚜蟲小麥和蔬菜品種是防止蚜蟲危害的最有效途徑，但由於現有種質資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機制尚不明確，常規育種難以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因並通過基因工程培育小麥抗蚜新種質具有重要意義。植物介導的RNAi技術已成為農作物抗蟲基因工程的熱點之一，通過寄主植物表達相應昆蟲特異基因的dsRNA，昆蟲取食植物後沉默其相應的基因從而達到控制害蟲危害的目的。RNAi現象其作用過程是雙鏈RNA( dsRNA)進入生物體內，被Dicer酶切割成2l_23nt的siRNA，siRNA與RNA誘導沉默複合物結合，與互補序列的靶mRNA結合，被Dicer識別，造成靶基因表達量的下降。近年來，利用dsRNA體外飼餵或注射來篩選RNA靶標基因，導致靶標基因表達和沉默，已經廣泛應用於昆蟲生長發育關鍵基因的鑑定和功能分析。孟山都公司通過植物介導的昆蟲腸道特異基因RNAi技術成功獲得了抗玉米根螟的轉基因玉米，有效緩解了長期應用Bt轉基因玉米誘發昆蟲產生抗性等問題，目前已完成生產性試驗。棉鈴蟲腸道中特異P450基因可提高棉鈴蟲幼蟲對棉花次生代謝物質和棉酚的耐受性，試驗表明，利用表達棉鈴蟲P450基因dsRNA的轉基因菸草和棉花葉片飼餵棉鈴蟲幼蟲，可導致幼蟲體內P450基因的表達量下降，同時幼蟲發育受阻，表現出抗棉鈴蟲性能；Zha等從褐飛蝨中腸中克隆了 3個高度表達的基因:N1HT1、Nlcar和Nltry，構建載體，轉化水稻，褐飛蝨取食轉基因水稻後，體內3種基因的mRNA表達水 平下降了 40%到70%，並且在水稻的篩管部發現了 dsRNA和siRNA的存在。Pitino等將桃蚜的MpC002 (主要在唾液腺中表達)和Rack-1(主要在腸道中表達)2個基因分別導入菸草和擬南芥中，用轉基因植物飼餵桃蚜，導致桃蚜體內的MPC002或Rack-1的表達量降低了高達60%，蚜蟲的產仔數目減少。小麥抗蚜蟲種質資源缺乏，抗性機制尚不明確，常規育種難以奏效，每年給農業生產造成巨大經濟損失。迫切需要挖掘和鑑定新型抗蚜基因並通過基因工程育種提高小麥抗蚜特性。

發明內容
本發明的一個目的是提供了 dsRNA。本發明提供的dsRNA，為如下1)、2)或3):I)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ；
2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ；3)由如下兩條雙鏈RNA組成:I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA。上述3)所示的dsRNA中，I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA的質量比為1:1。上述1)、2)或3)所示的所述dsRNA的編碼基因也是本發明保護的範圍，具體如下:I)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列I所示的核苷酸；2)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列2所示的核苷酸；3)所示的dsRNA的編碼基因具體為由序列表中序列I所示的核苷酸所示的DNA分子和序列表中序列2所示的核苷酸所示的DNA分子組成的組合物。上述dsRNA或上述的編碼基因的下述任一種應用也是本發明保護的範圍:I)在防治蚜蟲中的應用或在製備防治蚜蟲產品中的應用；2)在促進蚜蟲死亡中的應用或在製備促進蚜蟲死亡產品中的應用；3)在抑制ill牙蟲生長中的應用或在製備抑制ill牙蟲生長廣品中的應用；

4)在抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達中的應用或在製備抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達產品中的應用。上述應用為將上述dsRNA導入蚜蟲，實現防治蚜蟲、促進蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長、抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達；所述導入具體為飼餵；
所述蚜蟲具體為麥長管蚜。上述基因8273的核苷酸序列為序列表中的序列1，基因22544的核苷酸序列為序列表中的序列2。含有上述dsRNA的編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系、重組菌或表達盒也是本發明保護的範圍。上述重組表達載體、轉基因細胞系、重組菌或表達盒的下述任一種應用也是本發明保護的範圍:I)在防治蚜蟲中的應用或在製備防治蚜蟲產品中的應用；2)在促進蚜蟲死亡中的應用或在製備促進蚜蟲死亡產品中的應用；3)在抑制蚜蟲生長中的應用或在製備抑制蚜蟲生長產品中的應用；4)在抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達中的應用或在製備抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達產品中的應用。所述蚜蟲具體為麥長管蚜。本發明的另一個目的是提供產品，其活性成分為如下A-C中至少一種:A、上述 dsRNA;B、上述的編碼基因；C、上述重組表達載體、轉基因細胞系、重組菌或表達盒；所述產品為如下I) -4)中任意一種:1)防治蚜蟲產品；2)促進蚜蟲死亡產品；3)抑制蚜蟲生長產品；4)抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達產品；所述蚜蟲具體為麥長管蚜。
抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544表達的物質的下述任一種應用也是本發明保護的範圍:I)在防治蚜蟲中的應用或在製備防治蚜蟲產品中的應用；2)在促進蚜蟲死亡中的應用或在製備促進蚜蟲死亡產品中的應用；3)在抑制蚜蟲生長中的應用或在製備抑制蚜蟲生長產品中的應用所述蚜蟲具體為麥長管蟲牙。本發明中抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544表達的物質為上A-C中任意一種。本發明的實驗證明，本發明得到麥長管蚜生長發育相關基因8273和22544cDNA的序列的dsRNA，採用體外飼餵dsRNA方法，無論是單獨飼餵一種dsRNA還是飼餵dsRNA的混合物，均導致麥長管蚜產生致死效應，並且隨著dsRNA濃度增大和飼餵時間延長，麥長管蚜的死亡率均逐漸增大，研究表明利用RNAi技術沉默麥長管蚜體內生長發育相關基因8273和22544表達。表明蚜蟲生長發育相關基因8273和22544的保守序列可應用於通過植物介導的RNAi技術提高小麥抗蚜性的研究。


圖1為基因8273、22544和GFP的PCR擴增圖2為飼餵8天後麥長管蚜的生長發育情況
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中麥長管蚜(錢幼亭，周廣和，張淑香，張向才.麥長管蚜有性世代的研究.植物保護，1982，1:14-15。公眾可從中國農業科學院作物科學研究所獲得)由中國農業科學院植物保護研究所提供，飼養蚜蟲的小麥品種為科農199，將蚜蟲接種到小麥幼苗上，放入人工氣候箱中(溫度(20±2) °C，溼度60% — 80%，光周期L: D=16: 8)進行繁殖。質粒提取試劑盒購自Biomega公司，內切酶BamH 1、EcoR V及Hiscribe T7體外轉錄試劑盒購自NEB公司，大腸桿菌菌株DH5 α、反轉錄試劑盒購自北京全式金公司，rTaqDNA 聚合酶購自 TaKaRa 公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel ExtractionKit、RNACleaningKit購自Qiagen公司，各種胺基酸及其它試劑均購自北京拜爾迪公司。實施例1、生長發育相關基因8273dsRNA和22544dsRNA的獲得1、麥長管蚜總RNA的提取和cDNA的合成分別取約20頭麥長管蚜，按照北京全式金公司的Trizol試劑盒說明書提取總RNA,用RNACleaningKit進行純化,反轉錄合成cDNA第一鏈,操作步驟均參考試劑盒說明書。2、引物設計與基因克隆根據本實 驗室對於麥長管蚜轉錄組測序的結果得到生長發育相關基因8273(序列I)和22544 (序列2)，利用Primer Primer5.0軟體設計引物Pl和P2 (表1)，由北京華大基因公司合成。綠色螢光蛋白基因(GFP)片段從國家小麥改良中心實驗室保存的GFP質粒上擴增，利用Primer Primer5.0軟體設計引物P3 (表1)。PCR 反應體系為 10XPCR Buffer5 μ L, dNTP (2.5mmol.L-1) 4 μ L、rTaq0.5 μ L，Forward primer (20 μ mol.L-1) 1μ L> Reverse primer (20 μ mol.L-1) 1μ L> cDNA/GFP M粒 1 μ L，用 ddH20補足至 50 μ L。PCR 的反應條件為 94℃ 4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s,39 個循環；72°C 10min ;4°C保存。以麥長管蚜的cDNA為模板，用Pl作為引物進行擴增，得到279bp PCR產物即為8273基因序列上部分片段(含40bp的T7啟動子序列)，經過測序，該279bp PCR產物具有序列表中的序列I (可人工合成)所示的核苷酸。以麥長管蚜的cDNA為模板，用P2作為引物進行擴增，得到263bp PCR產物22544基因序列上部分片段(含40bp的T7啟動子序列)，經過測序，該263bp PCR產物具有序列表中的序列2 (可人工合成)所示的核苷酸。以GFP質粒為模板，用P3作為引物進行擴增，得到324bp PCR產物(含40bp的T7啟動子序列)，其具有序列表中的序列3 (可人工合成)所示的核苷酸。將上述PCR 電泳結果如圖1 所示,M:Trans2K DNA marker ；1:8273 基因；2:22544基因；3:GFP，可以看出得到目的片段。表I為PCR擴增引物
權利要求
1.sRNA，為如下 1),2)或 3): O由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ； 2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA； 3)由如下兩條雙鏈RNA組成:I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA。
2.據權利要求1所述的dsRNA，其特徵在於:所述3)所示的dsRNA中，I)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA的質量比為1:1。
3.利要求1中1)、2)或3)所示的所述dsRNA的編碼基因； 1)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列I所示的核苷酸； 2)所示的dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列2所示的核苷酸； 3)所示的dsRNA的編碼基因具體為由序列表中序列I所示的核苷酸所示的DNA分子和序列表中序列2所示的核苷酸所示的DNA分子組成的組合物。
4.利要求1或2所述dsRNA或權利要求3所述的編碼基因的下述任一種應用: 1)在防治蚜蟲中的應用或在製備防治蚜蟲產品中的應用； 2)在促進蚜蟲死亡中的應用或在製備促進蚜蟲死亡產品中的應用； 3)在抑制Φ牙蟲生長中的應用或 在製備抑制Φ牙蟲生長廣品中的應用； 4)在抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達中的應用或在製備抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達產品中的應用。
5.據權利要求4所述的應用，其特徵在於:所述應用為將權利要求1或2所述dsRNA導入蚜蟲，實現防治蚜蟲、促進蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長、抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達。
6.據權利要求5所述的應用，其特徵在於: 所述導入為飼喂。
7.有權利要求1或2所述的dsRNA的編碼基因的重組表達載體、轉基因細胞系、重組菌或表達盒。
8.利要求7重組表達載體、轉基因細胞系、重組菌或表達盒的下述任一種應用: 1)在防治蚜蟲中的應用或在製備防治蚜蟲產品中的應用； 2)在促進蚜蟲死亡中的應用或在製備促進蚜蟲死亡產品中的應用； 3)在抑制Φ牙蟲生長中的應用或在製備抑制Φ牙蟲生長廣品中的應用； 4)在抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達中的應用或在製備抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達產品中的應用。
9.品，其活性成分為如下A-C中至少一種: A、權利要求1或2所述dsRNA； B、權利要求3所述的編碼基因； C、權利要求7所述的重組表達載體、轉基因細胞系、重組菌或表達盒； 所述產品為如下I)-4)中任意一種:1)防治蚜蟲產品；2)促進蚜蟲死亡產品；3)抑制蚜蟲生長產品；4)抑制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達產品。
10.制蚜蟲體內生長發育相關基因8273和/或22544的表達的物質的下述任一種應用: I)在防治蚜蟲中的應用或在製備防治蚜蟲產品中的應用；2) 在促進蚜蟲死亡中的應用或在製備促進蚜蟲死亡產品中的應用；3) 在抑制蚜蟲生長中的應用或在製備抑制蚜蟲生長產品中的應用。
全文摘要
本發明公開了dsRNA及其組合在控制蚜蟲危害中的應用。本發明提供的dsRNA，為如下1)、2)或3)1)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；3)由如下兩條雙鏈RNA組成1)所示的雙鏈RNA和2)所示的雙鏈RNA。本發明的實驗證明，本發明得到麥長管蚜生長發育相關基因8273和22544cDNA的dsRNA，採用體外飼餵dsRNA方法，進行了利用RNAi技術沉默麥長管蚜體內生長發育相關基因8273和22544，導致麥長管蚜生長發育受阻並產生致死效應。
文檔編號C12N15/63GK103088023SQ20131000717
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月9日 優先權日2013年1月9日
發明者夏蘭琴, 張珉, 李雪峰 申請人:中國農業科學院作物科學研究所