一種分泌型多拷貝重組表達質粒pAO815Hr及其製備方法與應用的製作方法

2023-04-24 21:32:16

一種分泌型多拷貝重組表達質粒pAO815Hr及其製備方法與應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了一種分泌型多拷貝重組表達質粒pAO815Hr，其鹼基序列如SEQ?ID?NO.1所示，本發明中以質粒pPIC9和pAO815為模板，採用重疊PCR方法拼接質粒pAO815中酶切位點Cla?I起始並包括5′AOX啟動子區在內的基因片段與質粒pPIC9中信號肽基因序列起始的包括多克隆位點在內的基因片段並於3′端引入酶切位點BamH?I，同時除去質粒pPIC9中信號肽基因序列上遊的BamH?I位點，體外構建分泌型多拷貝重組表達質粒pAO815Hr。本發明中同時還提供了木聚糖酶DSB基因單拷貝重組質粒pAO815Hr-DSB以及雙拷貝重組質粒pAO815Hr-2×DSB。
【專利說明】—種分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr及其製備方法與應用
【技術領域】
[0001]本發明提供了一種分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr，以及其構建方法，特別是體外構建分泌型多拷貝工程質粒的方法，並能夠認為操縱外源基因插入的拷貝數，有利於外源基因在畢赤酵母中高效表達的改造，本發明屬於基因工程領域。
【背景技術】
[0002]甲醇酵母表達系統是一類最近發展十分迅速的外源蛋白質生產工具，同時具備原核生物的生長快，易於操作等特點和真核生物的翻譯後修飾的功能，畢赤酵母表達系統是近10年來得到廣泛應用的表達外源基因最成功的系統之一，使用最為廣泛，有許多蛋白質和多肽在該系統中成功表達並且獲得較高的表達量。
[0003]畢赤酵母酵母表達系統的質粒分為胞內表達和分泌表達兩種，其中分泌性表達的質粒具有表達量較高、糖基化完全、高級結構形成正確、後續分離純化程序比較簡單的優點，因而使用更普遍。影響工程菌表達量的因素有很多，外源性因素如培養基成份、酸鹼度和培養溫度、通氣量等，內源性的影響因素主要是目的基因特性和數量，雖然研究表明，基因的數量與表達量之間沒有必然的聯繫，很少數的試驗發現增加基因的數量表達量反而降低，但更多試驗證實，相當數量的目的基因可以提高表達量。
[0004]質粒pPIC9和pA0815是Invitrogen公司開發的應用於畢赤酵母表達系統的整合型質粒，各有其特點，適合不同的外源基因表達策略。質粒PA0815適合體外構建多拷貝，但質粒上不含編碼分泌信號肽 的基因序列，屬於胞內表達質粒，克隆位點僅有一個限制性酶EcoR I位點，對一些要求特殊的外源基因或特異克隆表達策略，會造成不便。質粒PPIC9攜帶分泌信號肽的基因序列，卻不能於體外構建目的基因的多拷貝。
[0005]為了提聞目的蛋白的表達量和避免質粒pA0815胞內表達、克隆位點單一的不足，利用質粒PPIC9分泌型質粒具有a -factor信號肽基因序列和多克隆位點的特點，可採用基因工程技術於體外對兩者進行改造，實現外源蛋白在畢赤酵母表達系統中的高效表達。

【發明內容】

[0006]本發明解決了【背景技術】中的不足，提供了一種分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr，其鹼基序列如SEQ ID N0.1所示。
[0007]本發明提供的分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr，用於在畢赤酵母中分泌表達外源基因。
[0008]本發明還提供了一種採用該重組表達質粒構建多拷貝外源基因重組質粒時的篩選驗證方法。
[0009]本發明中所提供的分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr的製備方法如下:(I)、根據pPIC9分泌型表達質粒和pA0815組成型多拷貝表達質粒的核酸序列，設計合成引物，所合成的引物如下:[0010]引物名稱引物序列
【權利要求】
1.一種分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr，其特徵在於:其鹼基序列如SEQ IDN0.1所示。
2.權利要求1所述的分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr的製備方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)、根據PPIC9分泌型表達質粒和pA0815組成型多拷貝表達質粒的核酸序列，設計合成引物，所合成的引物如下: 引物名稱引物序列
Cla 1-F5/ -GCATCGATAAGCTGACTCATGTTGG-3'
BER5' -GGAATCTTGGAATAGCCATCTCGTTTCGAATAATTAGTTG-3'
BEF5' -CAACTAATTATTCGAAACGAGATGGCTATTCCAAGATTCC-3'
BamH 1-R5/ -CGGGATCCGCACAAACGAACGTCTCACTTAATC-3; (2)、以質粒pA0815為模板，使用引物Cla1-F與BER，採用PCR反應合成分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr核心區的上遊基因片段，上遊基因片段為質粒pA0815中酶切位點Cla I起始並包括5' AOX啟動子區在內的基因片段(1027bp); (3)、以質粒pPIC9為模板，使用引物BEF與BamH1-R,採用PCR反應合成分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr核心區的下遊基因片段，下遊基因片段為質粒pPIC9中信號肽基因序列起始的包括多克隆位點 在內的基因片段(722bp)，並於3'端引入酶切位點BamH I，同時除去質粒PPIC9中信號肽基因序列上遊的BamH I位點； (4)、以步驟(2)和步驟(3)中合成的上遊基因片段和上遊基因片段為模板，使用引物Cla 1-F與BamH 1-R,採用PCR反應合成分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr核心區(1719bp)，該核心區基因序列Y端和:V端分別具有Cla I和BamH I酶切位點，且具有5' AOX啟動子區，信號肽基因序列和多克隆位點區，並除去了信號肽基因序列5'端的BamH I位點； (5)、將質粒pA0815與分泌型多拷貝重組表達質粒pA0815Hr核心區分別經ClaI與BamH I雙酶切後，純化回收目的產物並連接，將連接後的產物轉化Escherichiacoli DH5a感受態細胞，篩選出攜帶質粒pA0815Hr的陽性克隆菌株，並將其命名為pA0815Hr-DH5α 。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:步驟(2)中PCR反應程序為:950C 5min ;循環 30 次:95°C 30sec,55°C 30sec,72°C lmin30sec ；72°C IOmin0
4.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:步驟(3)中PCR反應程序為:950C 5min ;循環 30 次:95°C 30sec,62°C 30sec,72°C Imin ；72°C IOmin0
5.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:步驟(4)中PCR反應程序為:950C 5min ;循環 10 次:95°C 30sec,60°C 30sec (每個循環下降 0.5°C),72C2min ;循環 30次:95°C 30sec,55°C 30sec,72°C 2min ；72°C IOmin0
6.一種木聚糖酶DSB基因單拷貝重組質粒pA0815Hr-DSB，其特徵在於:該重組質粒採用如下方法構建:將權利要求1中所述質粒pA0815Hr與木聚糖酶DSB基因分別經EcoR I和Not I雙酶切後，回收目標產物並連接，連接產物轉化Escherichia coli DH5 α感受態細胞，篩選攜帶木聚糖酶DSB基因的陽性克隆菌株並將其命名為pA0815Hr-DSB-DH5 α。
7.一種木聚糖酶DSB基因雙拷貝重組質粒pA0815Hr-2XDSB，其特徵在於:該重組質粒採用如下方法構建:將權利要求6中的質粒pA0815Hr-DSB逐步經Bgl II和BamH I酶切並回收最終目標產物，將最終目標產物與質粒pA0815Hr-DSB經BamH I酶切後的回收產物進行連接，將連接產物轉化Escherichia coli DH5 α感受態細胞，篩選單菌落進行液體培養，提取重組菌株中的質粒，採用Cal I和Bam H I進行雙酶切驗證，從中篩選出攜帶兩個聚糖酶DSB基因且基因順序一致的陽性克隆菌株並將其命名為pA0815Hr-2XDSB-DH5 α。
8.一種產木聚糖酶DSB的重組畢赤酵母菌株DSB-GS115，其特徵在於:該重組菌株採用以下方法製備:將權利要求6所述的木聚糖酶DSB基因單拷貝重組質粒pA0815Hr-DSB採用限制性內切酶Bgl II線性化後，電擊轉化畢赤酵母GS115感受態細胞，採用酶活力檢測方法，篩選出高效表達木聚糖酶DSB基因的畢赤酵母基因工程菌株DSB-GSl 15。
9.權利要求1所述的分泌型多 拷貝重組表達質粒pA0815Hr，在畢赤酵母中分泌表達外源基因的應用。
【文檔編號】C12N15/66GK103789334SQ201410029534
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】熊海容, 王亞偉, 陳豐, 張巍 申請人:中南民族大學