雙歧桿菌屬細菌和應用該細菌的發酵食品的製作方法
2023-04-24 17:07:21
專利名稱：雙歧桿菌屬細菌和應用該細菌的發酵食品的製作方法
技術領域：
本發明涉及屬於雙歧桿菌(Bifidobacterium)屬細菌和包含該細菌的發酵食品，該細菌即使在攪拌(agitation)貯藏後具有高的存活率。
背景技術：
屬於雙歧桿菌屬細菌是專性厭氧微生物，並且在有氧的條件下存活較弱。在發酵產品中，生產過程中的增殖和貯藏中的存活率是難以控制的。為了獲得屬於雙歧桿菌屬細菌的生理效應(腸功能控制效應或類似的其它效應)，細菌必須以儘可能多的活的形式到達腸。據認為這類發酵食品生產的一個重要因素是在發酵食品中提高細菌的存活率和餐後細菌到達腸的比率。
最近通過多種方法改進細菌菌株已經製備了增殖和存活率提高的菌株。另外，通過生產方法的改進和添加用以提高存活率的多種試劑，也在發酵食品中提高了存活率。所述試劑如N-乙醯氨基葡糖、泛酸、泛硫乙胺(pantethine)、泛醯巰基乙胺、肽和乳果糖。
然而，在發酵食品的生產地點，從生產成本和加工能力的觀點來看，在同一天包裝所有的雙歧桿菌細菌的發酵產品是困難的，並且目前，同其它添加劑混合的半成品等要被貯藏在有氧貯藏罐中一些時日。為了穩定提供具有優良存活率的產品滿足即使在這樣有氧條件下維持高的活菌計數的質量標準，要求存活率的進一步提高。
在這種情況下，生活在苛刻條件(如有氧的條件或者酸的添加)下的活的細菌不總是表現提高的存活率。結果是，獲得同已知細菌相比具有更優良存活率的細菌菌株是極其困難的。而且，即使通過生產方法的改進和添加多種存活率提高試劑，維持生產地點有氧貯藏的發酵食品中的細菌的存活率即使運輸後在一個足夠高的水平是困難的。
因此，本發明的目的是提供一種屬於雙歧桿菌屬細菌和應用該細菌生產的發酵食品，該細菌發酵後即使在貯藏所需時間後，直到包裝入容器並且運輸到市場，具有高的活菌計數和優良的存活率。
發明內容
考慮到這種實際情況，本發明者詳盡研究並且注意到這樣的事實，運輸前發酵奶貯藏中，通常在罐中給予攪拌處理以維持發酵食品的均一性。在發酵食品生產過程中，據認為雙歧桿菌被迫暴露於對於細菌的苛刻環境。本發明者發現如果選擇攪拌下有氧儲藏後具有表現高活菌計數性質的屬於雙歧桿菌屬細菌，並且應用該細菌發酵生產的發酵產品被振蕩貯藏，發酵產品中細菌的存活率顯著提高。本發明者也發現當應用所述發酵產品生產發酵食品時，在貯藏條件下細菌存活率顯著提高，從而完成本發明。
也就是說，本發明的一個目的是提供一種屬於雙歧桿菌屬細菌，當該細菌在包含奶作為主要成分的培養基中培養至獲得1×108cfu/ml或更高的活菌計數後，在有氧條件下10℃攪拌貯藏14天，具有30％或更高的存活率。
本發明的另一個目的是提供一種包含用所述屬於雙歧桿菌屬細菌發酵的發酵產品的發酵食品。
本發明的進一步目的是提供一種包含屬於雙歧桿菌屬細菌在發酵食品裡的發酵食品，該發酵食品中包含用一種或多種屬於雙歧桿菌屬細菌發酵的發酵產品，其中所述食品中屬於雙歧桿菌屬細菌的活菌計數在剛剛生產後為1×108cfu/ml或者更高，並且當食品在有氧條件下在10℃攪拌貯藏14天，屬於所述的雙歧桿菌屬的任一種細菌的存活率為30％或更高。
附圖簡要描述
圖1顯示，當實施例2中的包含每種菌株的發酵奶產品在10℃攪拌貯藏，不同菌株的活菌計數，圖2顯示，當包含每種菌株的發酵奶產品在10℃攪拌貯藏1個星期、包裝以及無氧靜止貯藏，不同菌株的活菌計數，實施發明的最佳方案本發明中的屬於雙歧桿菌屬細菌是這樣的細菌，當該細菌在包含奶作為主要成分的培養基中培養至獲得1×108cfu/ml或更高的活菌計數後，有氧條件下在10℃攪拌貯藏14天，具有30％或更高存活率。在這裡含有奶作為主要成分的培養基是這樣的培養基，包含奶作為主要營養源並且能夠使屬於雙歧桿菌屬細菌生長。奶的實例包括牛奶(全脂奶)及其作為其加工產品的脫脂奶。
在培養基中培養屬於雙歧桿菌屬細菌的培養條件不被特別限制，可以根據所用的屬於雙歧桿菌屬細菌的生長條件適當地設定，培養通常在30-40℃進行，優選地是33-37℃，且優選地是無氧條件下。在屬於雙歧桿菌屬細菌中，一些菌株僅僅依靠奶營養源生長是困難的，在這樣的情況下，可以添加雙歧桿菌必需營養源和生長促進物質，如多種糖、酵母提取物、肽等。而且，也可以和乳酸細菌同時培養，如乳酸乳球菌(Lactococuslactis)，乳酸細菌通過與其共培養可以促進雙歧桿菌細菌生長。
在用來培養雙歧桿菌細菌的培養基中，通常使用的培養基包括一種液體培養基，該培養基包含重量百分比(在下文中簡單表明為％)為20％的脫脂奶和0.03％的meast。幾乎所有可以在所述培養基裡生長的雙歧桿菌細菌，以及本發明的細菌在培養至活菌計數為1×109cfu/ml或更高后在以上攪拌貯藏條件下，能夠表現30％或者更高的存活率。
作為本發明的雙歧桿菌細菌，在所述培養基中培養至活菌計數為1×109cfu/ml或更高后，表現出存活率為30％或更高的菌株是尤其優選的。
通常，在包含雙歧桿菌細菌的食品和飲品(如發酵奶)的生產中，因為要求用小量獲得大的活菌計數，產品被設計為在貯藏後產品中維持活菌計數為1×107cfu/ml或更多，像本發明的菌株，在攪拌貯藏後具有1×108cfu/ml或更高的活菌計數和高的存活率，該菌株在具有高活菌計數的食品和飲品中具有高的振蕩耐受力(存活率)，同時，當產品在攪拌貯藏後靜止貯藏，例如在產品加工成商品形式後，貯藏狀態的存活率非常高。尤其是在培養至活菌計數為1×109cfu/ml或更高后具有高的存活率的菌株在上述效應上是更優良的。
而且，在本發明中攪拌貯藏的意思是，培養產品或發酵食品通過使用攪拌棒或混合推動器在持續攪拌的條件下有氧貯藏，其中培養產品中雙歧桿菌細菌培養在包含奶作為主要成份的培養基中，發酵食品是通過和糖漿等混合適當地製備。
雙歧桿菌細菌的存活率的確定通過一種方法完成，其中具體而言，300ml培養產品或發酵食品用攪拌棒注入300ml瓶中，用棉花塞塞住，在10℃培養箱裡用磁力攪拌器在大約120rpm速度下攪拌貯藏。
存活率表明貯藏後活的細菌細胞存在的程度，並且用常規方法可以測定活菌計數。例如，活菌計數可以這樣獲得，將適當稀釋的包含活細胞的發酵產品(食品)塗布在TYL瓊脂平板培養基上，在37℃無氧培養72小時，然後計數培養基上的菌落數。
在本發明中，「存活率」的意思是攪拌貯藏(10℃，14天)後的活菌計數相對於培養液體的活菌計數的比率，培養液體是指在包含奶作為主要成分的培養基中培養至活菌計數為1×108cfu/ml或更高，或者是指剛剛生產後貯藏前的發酵食品中的活菌計數。
在這樣的攪拌貯藏條件下具有存活率為30％或更高的雙歧桿菌細菌，即使用所述菌株生產的發酵食品時在罐中攪拌貯藏後，不僅能夠具有高的存活率，而且能夠在生產和貯藏商品後維持高的存活率。因此，本發明的雙歧桿菌細菌是非常有用的。
本發明中，屬於雙歧桿菌屬細菌的種不被特別限制。例如，可以適當使用短雙歧桿菌(Bifidobacterium breve)、雙歧雙歧桿菌(Bifidobacteriumbifidum)、長雙歧桿菌(Bifidobacterium longum)、嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium infantis)、鏈狀雙歧桿菌(Bifidobacterium catenulatum)、動物雙歧桿菌(Bifidobacterium animals)、假小鏈雙歧桿菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)和青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)。在它們中，短雙歧桿菌、雙歧雙歧桿菌和長雙歧桿菌是優選的，因為發酵食品生產後其存活率提高效果是高的，其安全性被充分證明，並且短雙歧桿菌是尤其優選。
攪拌貯藏後具有高的存活率的這樣的菌株可以獲得，例如，通過培養雙歧桿菌細菌的親本菌株，這樣獲得的發酵產品在攪拌下貯藏2個星期，並且從活細胞中篩選高的抗性菌株。
本發明者已經篩選了兩株驗證為在攪拌貯藏後具有高的存活率的菌株。短雙歧桿菌YIT 10001菌株(FERM BP-8205)和短雙歧桿菌YIT 10002菌株(FERM BP-8206)於2001年8月14日保藏於國家高級工業科學技術所國際專利生物保藏中心(Internaltional Patent Organism Depositary，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)(ChuoNo.6，1-1，Higashi-1-chome，Tsukuba，Ibarake，305-8566 日本)。
短雙歧桿菌YIT 10001和短雙歧桿菌YIT 10002具有下面分類學性質。
表1
表2
+陽性，W弱陽性，±假陽性，-陰性攪拌貯藏後具有高的存活率的菌株也能夠通過用紫外線或者誘突劑(如亞硝基胍(NTG)和甲磺酸乙酯(EMS))處理獲得。
本發明的發酵食品包含至少一種發酵產品，該產品通過上述舉例的屬於雙歧桿菌屬細菌發酵。當剛剛生產的發酵食品(包含具有1×108cfu/ml或更高的活菌計數的雙歧桿菌細菌)在有氧條件下10℃攪拌貯藏14天，雙歧桿菌細菌的存活率為30％或更高。發酵食品的實例包括發酵奶、發酵豆奶、發酵果汁和發酵植物奶，並且發酵奶和發酵豆奶因為其在產品貯藏後顯著提高的生存力而尤其優選。
發酵食品優選地的是包含這樣的雙歧桿菌細菌，在培養後的發酵產品中具有活菌計數為1×109cfu/ml或更高，並且通過添加其它成份剛剛生產的產品中包含1×108cfu/ml或更高。當細菌生長到這種程度，同使用其它菌株(如親本菌株)相比在存活率上能夠得到特別優良的提高效果。
在發酵食品的生產中，除了本發明的雙歧桿菌細菌以外的微生物可以結合使用。這些微生物的實例包括屬於乳桿菌屬(Lactobacillus)的細菌，如嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、加氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、布氏乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)、雞乳桿菌(Lactobacillus gallinarum)、食澱粉乳桿菌(Lactobacillus amylovorus)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、高加索酸奶乳桿菌(Lactobacillus kefir)、類乾酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、捲曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus)、德氏乳桿菌德氏亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckii)、德氏乳桿菌保加利亞種(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricul)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、玉米乳桿菌(Lactobacillus zeae)和唾液乳桿菌(Lactobacillus salivalius)；屬於鏈球菌屬(Streptococcus)的細菌，如唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcusthermophilus)；屬於乳球菌屬(Lactococcus)的細菌，如乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp.cremoris)和乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcuslactis subsp.Lactis)；屬於芽孢桿菌屬(Bacillus)的細菌，如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；和屬於酵母屬(Saccharomyces)、有孢圓酵母屬(Torulaspora)和假絲酵母屬(Candida)的酵母菌，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、戴爾有孢圓酵母(Torulaspora delbrueckii)和乳酒假絲酵母(Candida kefyr)。
在這些之中，屬於乳桿菌屬、鏈球菌屬和乳球菌屬的細菌是優選的，因為通過從其中選擇的一種或多種細菌結合生產的發酵奶產品具有優良的可接受性並且易於持續飲用。由於存活率的提高效果，這些細菌也是優選的。
本發明的發酵產品可以通過常規方法生產。例如，為了生產發酵奶，首先屬於雙歧桿菌屬細菌單獨或者和其它微生物結合接種在無菌奶培養基中，並且培養至攪勻後獲得發酵奶基質。向其中加入另外製備的糖漿溶液混合，用勻漿器攪勻，然後加入香料製備終產品。
本發明的這樣得到的發酵奶可以加工成任何類型的產品，如「planetype」、軟型、果味型、固體型和液體型。
常規發酵食品中使用的食品原料如多種糖、乳化劑、增稠劑，增甜劑，酸化劑和果汁可以任選混合。其中特定的實例包括糖，如蔗糖、異構化糖、葡萄糖、果糖、異麥芽酮糖(palatinose)、海藻糖、乳糖和木糖；糖醇，如山梨糖醇、木糖醇、赤藻糖醇、乳糖醇、異麥芽糖醇(palatinit)，還原粘性澱粉糖漿和還原粘性麥芽糖漿；乳化劑，如脂肪酸蔗糖酯、脂肪酸甘油酯和卵磷脂；增稠劑(穩定劑)，如角叉藻聚糖、黃原膠、瓜爾豆膠，果膠和刺槐豆膠；酸化劑，如檸檬酸、乳酸和蘋果酸；以及果汁，如檸檬汁、橙汁和漿果汁。維生素，如維生素A、維生素B、維生素C、維生素D和維生素E以及礦物質，如鈣、鐵、鎂和鋅，也可以添加。
實施例將通過實施例更詳細解釋本發明，但是本發明並不局限於這些實施例。
實施例1親本菌株A，短雙歧桿菌屬菌株(YIT 4065FERM BP-6223，於1996年2月2日保藏於國家高級工業科學技術所國際專利生物保藏中心(ChuoNo.6，1-1，Higashi-1-chome，Tsukuba，Ibaraki，305-8566 日本)(頭孢金素(cephalothin)-鏈黴素抗性菌株)和乳酸乳球菌接種到包含20％脫脂奶的培養基內並且在37℃混合培養24小時來製備細菌溶液。向這個細菌溶液中加入通過用20％脫脂奶在37℃培養20小時獲得的唾液鏈球菌嗜熱亞種細菌溶液(混合比例＝1∶2)。加入包含還原粘性麥芽糖糖漿的糖漿溶液至終濃度為5％來製備發酵奶產品。發酵奶產品灌注到玻璃瓶中在貯藏期間用棉塞塞住，在有氧環境下用攪拌器攪拌。在這種條件下，瓶子在10℃儲存2個星期。活細菌塗到培養基上，分離2,000株單菌落。
發酵奶產品用分離的菌株和雙歧桿菌菌株的親本菌株A通過上述相同方法製備。用攪拌器向300ml瓶中灌注300ml混合液，用棉塞塞住並且用攪拌器在120rpm攪拌下貯藏。比較細菌貯藏期間生存力，獲得了兩個具有比菌株A更優良的生存力的菌株。表3顯示攪拌貯藏2個星期後生存力。兩個菌株(YIT 10001和YIT 10002)在兩個星期的攪拌貯藏後表現了30％或更高的存活率。活菌計數應用具有表4所示組成的TYL培養基完成。
表3
表4，TYL培養基的組成胰蛋白腖(BBL)1.0(％)酵母提取物(Difco)0.5牛肉浸出粉(Oxoid)0.3磷酸二氫鉀 0.3磷酸氫二鉀 0.48硫酸銨 0.3硫酸鎂 0.02
L-半胱氨酸 0.05乳糖 1.0瓊脂 1.2實施例2存活率測定作為屬於雙歧桿菌屬細菌的短雙歧桿菌YIT 10001，YIT 10002和菌株A用來製備發酵奶產品。
明確地，2升20％奶培養基注入2.5升發酵罐中，在上文屬於雙歧桿菌屬的細菌菌株和乳酸乳球菌YIT 2027分別以2％和0.01％濃度作為種子引子(seed starter)接種，並且在37℃培養24小時通過在15Mpa下攪勻來製備細菌溶液。唾液鏈球菌嗜熱亞種在20％脫脂奶中37℃培養20小時通過在15 Mpa下攪勻製備細菌溶液。這些細菌溶液以1∶2的比例混合，並且加入包含還原粘性麥芽糖糖漿的糖漿溶液至終濃度為5％來製備發酵奶產品(活菌計數為菌株A 5.65×108cfu/ml，YIT 10001 5.34×108cfu/ml，以及YIT 10002 5.45×108cfu/ml)。
這些樣品的活菌計數通過和實施例1相同的方法在10℃攪拌貯藏後測定，或者在攪拌1個星期後裝入試管中，然後通過用氮氣代替空氣無氧貯藏。結果示於圖1和圖2。
YIT 10001和YIT 10002的存活率在貯藏14天後超過30％並且和菌株A相比提高。兩種菌株攪拌貯藏後和維持靜止貯藏的存活率和菌株A相比也顯著提高。
實施例3在2.5升的發酵罐中注入2升的24％奶培養基。短雙歧桿菌YIT 10001和乳酸乳球菌YIT 2027種子引子分別以2％和0.01％的濃度接種，並且在37℃培養24小時通過在15Mpa下攪勻來製備細菌溶液。乾酪乳桿菌和嗜酸乳桿菌的種子引子各以0.5％濃度接種到20％脫脂奶中在37℃培養24小時通過在15Mpa下攪勻製備細菌溶液。這些細菌溶液以2∶3的比例混合，並且加入包含異麥芽酮糖的糖漿溶液至終濃度為10％來製備發酵奶產品(YIT 10001的起始活菌計數5.76×108cfu/ml)。
在發酵奶產品中，YIT 10001在和實施例1中相同的方式下在10℃攪拌貯藏2個星期後表現了30％或更高的存活率。味道也優良。
工業應用性本發明的屬於雙歧桿菌屬的細菌即使在攪拌貯藏後表現了高的存活率，並且能夠生產包含大量活的微生物的發酵食品。從而，本發明的發酵食品包含高的活菌計數，並且表現了屬於雙歧桿菌屬細菌的高的生理效應，如對有害腸道細菌的抑制作用和腸功能的控制效應。
權利要求
1.一種屬於雙歧桿菌屬的細菌，當該細菌在包含奶作為主要成份的培養基中培養至獲得1×108cfu/ml或更高的活菌計數後，有氧條件下在10℃攪拌貯藏14天，具有30％或更高存活率。
2.根據權利要求1的屬於雙歧桿菌屬的細菌，其中細菌是短雙歧桿菌。
3.根據權利要求1或2的屬於雙歧桿菌屬的細菌，其中細菌是短雙歧桿菌YIT 10001或短雙歧桿菌YIT 10002。
4.一種發酵食品，其特徵在於包含由根據權利要求1-3的任一項的屬於雙歧桿菌屬的細菌發酵的發酵產品。
5.一種包含屬於雙歧桿菌屬細菌在發酵食品裡的發酵食品，該發酵食品包含用一種或多種根據權利要求1-3的任一項的屬於雙歧桿菌屬的細菌發酵的發酵產品，其中所述食品中的屬於雙歧桿菌屬細菌的活菌計數在剛剛生產完時為1×108cfu/ml或更高，並且當食品有氧條件下在10℃攪拌貯藏14天，任一屬於所述雙歧桿菌屬的細菌的存活率為30％或更高。
6.根據權利要求4或5的發酵食品包括發酵奶。
7.根據權利要求4-6任一項的發酵食品，其特徵在於進一步包含增甜劑。
全文摘要
本發明提供了一種屬於雙歧桿菌屬細菌，該細菌能夠在攪拌貯藏下表現高的存活率並且能夠生產包含大量活的細菌數的發酵食品。本發明進一步提供一種發酵食品，該發酵食品包含屬於雙歧桿菌屬細菌並且表現多種生理效應，比如抑制有害腸細菌的作用和腸功能控制效應。本發明進一步提供一種屬於雙歧桿菌屬的細菌和使用該細菌的發酵食品，當該細菌在包含奶作為主要成分的培養基中培養至獲得1×10
文檔編號A23C9/123GK1589322SQ0282314
公開日2005年3月2日 申請日期2002年11月1日 優先權日2001年11月5日
發明者世良田雅紀, 辻浩和, 園池耕一郎 申請人:株式會社益力多本社