一種初步篩選次生代謝產物產生菌的方法

2023-04-24 14:47:26

專利名稱:一種初步篩選次生代謝產物產生菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種初步篩選次生代謝產物產生菌的方法。
背景技術：
微生物產生的次生代謝產物在人類生活中得到了廣泛應用。最典型的莫過於1929年A.Fleming博士發現青黴素，經歷了半個多世紀，青黴素不但得到了廣泛的應用，而且有了許多重要發展，經久不衰。目前篩選次生代謝產物產生菌的方法很多，但是大部分可歸為兩大類。一類是直接根據待篩化合物的理化性質建立篩選方法和流程，如用液相色譜、薄層層析等層析的方法進行菌種發酵液的初篩，然後對初篩得到的嫌疑菌株用包括質譜、紫外光譜、紅外光譜和核磁共振等在內的方法進行進一步的篩選和鑑定，最終確定嫌疑菌株產生的是否為目標次生代謝產物。如果待篩選菌株產生的的目標化合物具有比較容易檢測的生物活性，可以採用第二類篩選方法，即在第一類方法中整合進基於生物活性檢測方法的篩選流程。
為了建立快速而有效的次生代謝產物產生菌篩選方法，或者稱之為篩選流程，初篩方法的選擇十分關鍵初篩速度和效率往往決定了整個篩選的速度和效率。這是因為，次生代謝產物產生菌的篩選往往基於一個小到幾千，大到十幾萬菌種的菌種庫，所以通過初篩手段快速準確的挑出嫌疑菌株，大大縮小篩選範圍是提高篩選速率的關鍵。專利CN1258743A發明的是一種快速篩選產醇腈酶微生物的方法，專利US 4,568,638發明的是一種篩選葡萄糖-2-氧化酶產生菌的方法，這兩種方法都採用了生物活性檢測方法作為初篩的手段，其關鍵點也都是如何建立快速有效的生物活性篩選方法。隨著分子生物學方法的普及和廣泛應用，一些篩選方法開始採用分子生物學技術作為篩選手段。專利02125509.1(公開號CN 1398986A)介紹了一種通過檢測待篩菌株中是否含有目標抗生素合成基因的方法，作為初篩手段，來篩選目標抗生素產生菌。
雖然以上方法大大提高了篩選速度和/或準確率，有些也明顯降低了相對篩選成本。然而，以上介紹的所有類型的篩選方法的篩選速度，還是不夠快，特別是當基於一個大的菌種庫篩選多種次生代謝產物時。
當篩選得到目標次生代謝產物產生菌後，為了作進一步的研究開發，特別是做進一步的科學研究、菌種選育和發酵生產，一般需要進行產生菌的菌種鑑定，即鑑定該菌種在微生物分類學上的位置，一般來講，大多是鑑定該菌株的屬、種甚至亞種。傳統的菌種鑑定方法從形態特徵和生理生化特徵上進行。然而，分子分類學方法在菌種分類學鑑定上得到了廣泛的應用，目前已經成為相對獨立的分類學鑑定方法。最常用的分子分類學方法是基於核糖體小亞基RNA基因(SmallSubunit Ribosomal RNA Gene，SSU rRNA基因)編碼區進行序列比對，或者利用位於SSU rRNA基因編碼區3』和下遊鄰近的核糖體大亞基RNA基因(Large SubunitRibosomal RNA Gene，LSU rRNA基因)編碼區5』之間的序列進行序列比對。SSUrRNA基因，對於原核細胞來講，就是16s rRNA基因，對於真核細胞來講，就是18srRNA基因。SSU-LSU rRNA基因編碼區間的序列，對於原核細胞而言，就是16S～23S rRNA基因編碼區間序列；對於真核細胞而言，就是18S～28S rRNA基因編碼區間的序列。為了方便起見，這裡所說的SSU rRNA基因，不僅僅包括SSU rRNA基因編碼區，而且包括下遊緊挨的SSU-LSU rRNA基因編碼區間的序列。基於核糖體RNA(rRNA)序列分析的分子分類學方法建立在如下基本事實上分類學上越相近的物種，其rRNA基因序列的相似性越強；分類學上相隔越遠的物種，其rRNA序列相似性越差。目前已經有了成熟的，進行序列比對和同源性分析的成熟實用的軟體。利用這類軟體，將未知菌株的上述序列跟大量已知種屬的菌株的對應序列進行比對，並利用專門的軟體進行親緣關係分析，就可以比較準確的確定未知菌株在分類學上的位置。目前這類軟體非常多，如Mega和Phylip等，並且可以利用龐大的網際網路基因資料庫，如Genebank進行在線分析，十分方便。一般而言，基於SSU rRNA基因序列進行分子分類學分析，可以將未知菌株確定到屬、種，甚至亞種和菌株的水平。
目前，基於SSU rRNA序列的分子生物學技術主要用於各種用途的鑑定工作，如在微生物製藥領域用於菌種分類學鑑定，在疾病檢測領域用於特殊致病菌的檢測。美國專利申請20040110247介紹了一種基於rRNA和rRNA基因檢測微生物的存在和存活狀態的方法，通過檢測rRNA基因，可以檢測微生物是否在樣品中存在過，而通過定量檢測rRNA的量，則可以檢測微生物的數量。
在多年的次生代謝產物產生菌篩選和隨後的菌種鑑定工作中，人們早就發現，某種特定的次生代謝產物產生菌往往局限在少數幾個屬，或者某個屬中的幾個種內，即，某種特定次生代謝產物產生菌具有一定程度上的分類學特異性。分類學上相差較遠的菌，產生相同抗生素的可能性較小(Giancarlo Lancini等編著 王以光主譯，《抗生素—多學科研究入門》，1998年，人民衛生出版社)。如，到目前為止，發現的10,000種微生物來源的生理活性物中，三分之二來源於放線菌，其次是真菌，以及細菌中有限的幾個屬。放線菌產生的活性物質，其中的鏈黴菌又佔了大部分(《微生物製藥》，吳劍波主編，2002年12月第一版，化學工業出版社)。又如，發現的青黴素產生菌絕大多數是青黴屬，少數是麴黴屬；目前發現的灰黃黴素的產生菌則均為青黴屬；已發現的埃博黴素(Epothilones)的產生菌目前僅限於黏細菌中的纖維堆囊菌(Sorangium Cellulosum)(《抗生素與微生物產生的生物活性物質》，張致平和姚天爵主編，2005年1月第一版，化學工業出版社)。也有一些次生代謝產物產生菌的屬種分布非常廣，如青黴素產生菌有青黴屬下的20多個種和麴黴屬下幾個種，高產菌則往往集中於產黃青黴等青黴屬下的少數幾個種。
需要說明的是，次生代謝產物產生菌並沒有非常嚴格的屬種專一性，這種屬種相對專一性分布是長期以來實踐中的統計學分析結果(Giancarlo Lancini等編著 王以光主譯，《抗生素—多學科研究入門》，1998年，人民衛生出版社)。儘管如此，這些統計學分析結果可以為實際篩選工作提供重要的指導如果已經知道某種次生代謝產物產生菌的分類學類別，先從庫中初步篩選在分類學上屬於同一類別，或者比較相近的菌株，然後進行進一步篩選，往往能夠大大縮短篩選周期和提高篩選效率。
目前這種次生代謝產物產生菌的屬種相對專一性特點也被人們用於指導實際篩選工作。如人們在篩選某種特定次生代謝產物前，有時會根據文獻報導的產生菌的屬種相對特異性從菌種庫中挑出特定屬或種的菌株，然後再根據目標產物的理化或者生物學活性進行篩選。這種挑選一般是基於形態特徵觀察，而且由於沒有量化、準確和便於快速鑑別的指標，而且也缺乏效率，費時費力，不適合菌種庫容量達到幾萬菌株的大規模篩選。目前，還沒有一種方法，將這種菌種分類學上的信息用於高通量篩選已知的次生代謝產物產生菌。
綜上所述，針對幾千甚至幾萬菌種容量的大菌種庫進行大規模篩選，需要高通量的篩選方法來進行高效篩選，才可能大大縮短篩選周期，節約篩選成本。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種快速、有效的初步篩選次生代謝產物產生菌的方法。
本發明所提供的初步篩選次生代謝產物產生菌的方法，包括以下步驟
1)測定待篩選的菌種庫中的每個菌株的核糖體小亞基RNA基因片段(SSU rRNA基因片段)的序列；2)將目標次生代謝產物的已知產生菌，或在分子分類學上與所述目標次生代謝產物的已知產生菌是同一個分類階元的菌株作為參照菌株；以所述參照菌株的核糖體小亞基RNA基因片段序列作為參照核糖體小亞基RNA基因片段序列；將所述參照核糖體小亞基RNA基因片段序列與步驟1)中的所述待篩選的菌種庫中的菌株的核糖體小亞基RNA基因片段序列進行一對一的同源性比對，和所述參照核糖體小亞基RNA基因片段序列的同源性大於等於根據篩選通過率確定的同源性數值的菌株即為初篩的嫌疑菌株。
所述嫌疑菌株和所述參照核糖體小亞基RNA基因片段序列同源性的高低可以根據篩選通過率的需要進行調節。
初篩嫌疑菌株的進一步篩選和鑑定可採用傳統方法進行，如採用，但不局限於，生物活性篩選方法、液相色譜、質譜等進行進一步篩選和分析嫌疑菌株發酵液，並最終用精確的方法分析鑑定嫌疑菌株產生的是否為目標次生代謝產物。如對於小分子化合物的最終結構鑑定，常常採用紅外光譜，紫外光譜、質譜和核磁共振等進行最終的結構鑑定。
該方法中，步驟1)和2)中所述核糖體小亞基RNA基因片段為選自下述a)、b)或c)中的一段長度大於等於100個核苷酸或100個核苷酸對的連續的多核苷酸序列a)核糖體小亞基RNA基因編碼區序列，b)SSU-LSUr RNA基因編碼區間的序列，c)核糖體小亞基RNA基因編碼區和SSU-LSUr RNA基因編碼區間的序列；所述SSU-LSU rRNA基因編碼區間的序列是指位於核糖體小亞基RNA基因編碼區的3』末端、和下遊鄰近的核糖體大亞基RNA基因(LSU rRNA基因)編碼區的5』末端之間的序列。
所述核糖體小亞基RNA基因編碼區是指核糖體小亞基RNA基因中編碼核糖體小亞基RNA的核苷酸序列。
所述核糖體小亞基RNA基因片段的長度優選為150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、1500、1700、1800、2100或2300個核苷酸或核苷酸對，其中每個片段中至少30個核苷酸或核苷酸對來自於核糖體小亞基RNA基因編碼區和/或SSU-LSUr RNA基因編碼區間的可變區。
所述核糖體小亞基RNA基因片段優選為整個SSU rRNA基因編碼區。
所述SSU rRNA基因，對於原核細胞來講，就是16s rRNA基因，對於真核細胞來講，就是18s rRNA基因。
所述SSU-LSU rRNA基因編碼區間的序列，對於原核細胞而言，就是位於16SrRNA基因編碼區3』末端和下遊鄰近的23S rRNA基因編碼區5』末端之間的序列；對於真核細胞而言，就是位於18S rRNA基因編碼區的3』末端和下遊鄰近的28SrRNA基因編碼區的5』末端之間的序列。
步驟2)中，所述產生菌是指產生某化合物的微生物，包括真菌、真細菌和古細菌。
本發明的方法較適合於所述已知產生菌的分類學名稱確定到屬或屬以下的目標次生代謝產物的嫌疑菌株的篩選。
所述分類學名稱是指用於鑑定或者區分某物種的名稱，它可能僅含屬的名稱，也可能既有屬的名稱，也有種的名稱，甚至進一步包含亞種的名稱。
所述嫌疑菌株是在篩選中得到的，可能會產生目標次生代謝產物的菌株。嫌疑菌株並不一定產生目標次生代謝產物。
所述參照菌株可為一株或多株。
當所述參照菌株為多株時，所述參照菌株可來自於同一分類階元，也可來自不同分類階元。
步驟2)中，所述參照菌株優選為目標次生代謝產物的已知產生菌，尤其優選為目標次生代謝產物的已知產生菌中最低分類階元的菌株。
步驟2)中，所述參照核糖體小亞基RNA基因片段序列可與步驟1)中的所述待篩選的菌種庫中的所有菌株或者部分菌株的核糖體小亞基RNA基因片段序列進行一對一的同源性比對。
步驟2)中，所述參照SSU rRNA基因片段是指採用SSU rRNA基因片段序列比對方法進行菌株篩選時，用於跟待篩選的菌種庫中的所有菌株或者部分菌株的的SSU rRNA基因片段進行相似性比較的一條或者幾條核酸序列，其對應的菌株稱為「參照菌株」。與參照SSU rRNA基因片段同源性越高，越有可能被挑選出來作為初篩得到的嫌疑菌株。參照菌株可以是目標次生代謝產物產生菌，也可以是在分子分類學上與目標次生代謝產物產生菌非常相近的菌株，即與之同屬、種甚至亞種的菌株。
步驟2)中，所述參照SSU rRNA基因片段序列可以是一條或多條序列。
本發明將SSU rRNA基因片段序列相似性比對的分子分類學技術用於篩選某種已知次生代謝產物的產生菌。該方法通過計算機軟體在記載有各個待篩菌種SSUrRNA基因片段序列的資料庫中進行序列比對，從而將原本耗時耗力的「實際篩選」工作轉變成了速度很快效率極高的計算機數據分析和檢索，從而成千倍的縮短了初篩時間。本發明的方法在大的菌種庫中，如5,000菌株以上，篩選多種次生代謝產物時，能更加明顯的顯示快速有效的特點。



圖1為提取的菌種基因組DNA凝膠電泳圖譜圖2為PCR產物凝膠電泳結果圖3為用待篩菌種和參照菌株在內的6條SSU rRNA基因片段序列，採用「Neighbor-Joining」法構建的分子進化樹圖4為用待篩菌種和參照菌株在內的5條SSU rRNA基因片段序列，採用「Neighbor-Joining」法構建的分子進化樹圖5為土黴素標準樣的液相色譜和正負離子流圖譜圖6為土黴素標準樣在保留時間5.7min處的ES+和ES-質譜圖圖7為土黴素標準樣在保留時間5.7min處的光吸收圖譜圖8為菌種11005發酵液提取物的液相色譜和正負離子流圖譜圖9為菌種11005發酵液提取物在保留時間5.7min處的質譜圖圖10為土黴素標準樣在保留時間5.7min處的光吸收圖譜圖11為菌種11002發酵液提取物的液相色譜和正負離子流圖譜具體實施方式
定義本發明的「資料庫」，具有存儲菌種相關的信息的功能，其中至少包括菌種的編號和對應SSU rRNA基因片段的信息。
本發明中的「序列比對算法」是指比較核苷酸序列間相似性的算法。
除非特別說明，本發明中的「菌種」和「微生物」的含義相同，均包括真菌，真細菌和古細菌。本發明中的「細菌」，包括真細菌和古細菌。
本發明中的微生物「分類學特異性」往往用於指微生物在屬，種，或者亞種上的特異性，但是嚴格來講，它泛指微生物分類學上的，各個分類階元上的特異性。
如前所述，一方面，自從分子分類學，特別是基於SSU rRNA基因片段序列分析的分類學建立以後，得益於全球相關科學家的無私共享，分類學名稱已知的微生物及其完整或者部分SSU rRNA基因序列越來越多地登記到了網際網路資料庫中。如在著名的GeneBank資料庫中，幾乎登記有所有已知的微生物種類的SSU rRNA基因片段序列，其SSU rRNA基因片段序列總數已達10萬以上，這些龐大而多樣的數據為進行基於SSU rRNA基因片段序列相似性比對，進而分析菌種間的分類和進化關係提供了可能。一般而言，分類學上越相近的微生物，其SSU rRNA基因片段的序列相似性，即同源性越強。基於SSU rRNA基因片段序列相似性比對的分子分類學技術已經相當成熟並且在微生物分類學上得到了廣泛應用。另一方面，某種特定次生代謝產物產生菌具有一定程度上的分類學特異性，分類學上相差較遠的菌，產生相同抗生素的可能性較小。這些統計學分析結果可以應用到實際篩選工作中，為從龐大的菌種庫中快速高通量的篩選目標化合物的產生菌提供重要的指導。建立在以上兩個重要的基礎上，可以以SSU rRNA基因片段序列相似性比對作為輔助手段，從龐大的菌種庫中快速篩選某種已知次生代謝產物產生菌。該方法的大致過程為(1)測定待篩選的菌種庫中的每個菌株的SSU rRNA基因片段的序列；(2)確定要篩選的，微生物來源的目標次生代謝產物的產生菌，該目標產物產生菌要求在篩選前已經在學術界有報導；(3)從各種途徑，如相關文獻、GenBank等相關資料庫，以及篩選者自己掌握的已知數據中，尋找到該類微生物的SSU rRNA基因片段序列，稱之為參照SSU rRNA基因片段序列；(4)將參照SSU rRNA基因片段序列跟菌種庫中的所有菌株或者部分菌株的SSU rRNA基因片段序列進行一對一同源比對，根據同源性分析結果，挑選跟參照序列同源性高的，一定數量的菌株作為初篩合格菌株，即初篩的嫌疑菌株；(6)初篩嫌疑菌株的進一步篩選和鑑定採用傳統方法進行。序列同源性分析方法很多，可以，但不局限於將參照序列與本地資料庫中的所有菌株的序列進行一對一相似性比對，選取與參照序列取相似性分值較高的序列的對應菌株作為初篩的嫌疑菌株，也可以將參照序列與庫中的部分或者所有序列一起，做多序列比對並根據比對結果分析進化關係(如建立進化樹)，選取與參照序列進化關係較近的序列對應的一個，或者多個菌株作為初篩的嫌疑菌株。對於比較大的菌種資料庫，可以先用參照序列與庫中所有序列進行BLAST，然後根據相似性分值從高到低，從庫中選取一定數量的序列，再將這些序列與參照序列一起進行分子進化關係的分析，如構建分子進化樹，然後選擇進化關係較近的菌株作為初篩的嫌疑菌株。控制初篩嫌疑菌株數量的方法也很多，可以但不局限於，通過設定一個相似性和同源性閾值來控制，也可以直接根據菌種庫的大小設定一個合適的初篩通過數量，然後根據相似性或者同源性從高到低進行嫌疑菌選擇。採用不同的同源性分析方法，從同樣的菌種庫中得到的嫌疑菌株結果可能會有所不同。但是，由於目前學術界的建立的同源性分析方法經過了理論和實踐的長期檢驗，因此都具有比較嚴格的科學性，這就可以保證與參照菌株在分子分類學上同源性很高的菌株不會遺漏。
可以通過提取待篩選的菌種庫中的每個菌株的基因組DNA，然後用聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)來特異性擴增基因組中的SSU rRNA基因片段，最後對擴增並純化的產物進行測序，就得到每個菌株的SSU rRNA基因片段序列。為了對SSU rRNA基因片段進行PCR擴增，擴增引物的設計非常關鍵。SSUrRNA基因總體上具有相對保守性，並且在每條SSU rRNA基因序列中，不同區域的保守性不同，如SSU rRNA基因編碼區內就有幾個保守性相對差的多變區，多變區之間間隔了保守性相對較強的保守區。而SSU-LSU rRNA基因編碼區間的序列總體上比SSU rRNA基因編碼區更加不保守，這個不保守區的序列可以用於在種，甚至亞種水平的分子分類。為了以後的SSU rRNA基因測序，並且讓序列比對達到區分具有不同分類學位置的菌株的SSU rRNA基因的目的，可以採用，但不局限於，通用性較強的SSU rRNA基因片段PCR引物。目前，許多文獻報導了在不同分類水平上的PCR擴增或者測序通用引物，採用某屬、某科甚至某界等通用引物進行PCR擴增，可以擴增出幾乎所有的該種、該屬或該科菌株的SSU rRNA基因片段。通過在GeneBank等資料庫中進行檢索，研究者也可以自己設計這樣的在一定分類水平上的通用引物。對於SSU rRNA基因片段擴增或者測序，目前學術界已經報導了多條非常實用的真細菌界，古細菌界和真核生物界的各自通用引物，這使測定微生物庫中的真核或原核微生物的SSU rRNA基因片段序列變得很容易。在實際PCR擴增中，有時候因為不能確定某種菌的大致分類學位置，可以將多套特定的引物對混合，來進行擴增。如，在實際PCR擴增之前，一般會對菌種庫中的每個菌種在真細菌界，古細菌界和真核微生物界上進行大致分類，但是也可以不作初步的分類，而將針對不同界的引物混合起來，做PCR擴增以得到該菌種的SSU rRNA基因片段。菌種SSU rRNA基因片段的擴增並不局限於PCR的方法，其他的替代方法也可以應用，如循環測序(cycle sequencing)技術(Murray V.，Nucl.Acid.Res.，1998，178889)等。
為了便於記錄和管理每個菌株的SSU rRNA基因片段序列，以及便於用序列比對分析程序對這些序列做相似性比對和檢索，可以，但不局限於，將菌種庫中每個菌株的SSU rRNA基因片段序列記錄在一個資料庫裡，該SSU rRNA基因片段序列資料庫將每個菌株與其SSU rRNA基因片段序列建立了一一對應關係，該資料庫可以是獨立的庫，也可以是整合在其他資料庫中，如整合在記錄整個菌種庫的資料庫中。記錄菌種庫中每個菌株的SSU rRNA基因片段序列的記錄也可以是其他形式，如可以是一個簡單的FASTA格式的文件，這對於記錄很小的菌種庫非常方便。記錄有多條序列信息的FASTA文件對多種序列比對軟體兼容，可以方便的進行序列比對。總之，無論採用哪種文件形式來記錄，應該能讓分析軟體快速對其中的每個SSU rRNA基因片段序列進行同源性分析。
微生物來源的，已經報導的某種次生代謝產物的產生菌分類學名稱一般比較容易得到，如通過學術文獻，專利文獻，技術書籍，以及專業資料庫等。已經報導的微生物來源的次生代謝產物產生菌，往往會確定到種或者屬，但少數情況下也沒有確定到屬的，有些甚至僅僅確定到屬以上(不包括屬)的分類階元。如果沒有確定到屬，則在SSU rRNA序列比對這個初篩階段，檢索的範圍將變大，初篩特異性會有明顯的降低，篩選效率也會有一定的下降。本發明的方法更適合於篩選那些產生菌分類學名稱確定到屬或者屬以下的次生代謝產物。對於沒有任何分類學信息的次生代謝產物產生菌，本方法不適用，如果某種次生代謝產物產生菌的分類學名稱僅僅確定到界，如僅僅知道為原核微生物，基於該方法進行的篩選實際上沒有明顯的優點。
確定了某種次生代謝產物產生菌分類學名稱以後，接下來就是確定「參照SSUrRNA基因片段序列」。如果目標次生代謝產物產生菌的分類學名稱已經確定到一定分類階元，如已經確定到屬或屬以下，一般傾向於採用對應於最低分類階元的SSU rRNA基因片段序列作為參照序列，也即傾向於採用屬於該最低階元的菌株作為參照菌，特別是傾向於直接採用該次生代謝產物產生菌的SSU rRNA基因片段序列作參照。但參照菌株和參照SSU rRNA基因片段序列的選擇並不局限於此即使產生菌的SSU rRNA基因片段序列可以得到，也可以不直接選擇產生菌，而是選擇其他的，屬於該最低階元的菌作為參照菌株。如果已報導的某種次生代謝產物產生菌並沒有嚴格的分類學專一性，特別是並不專一於某一特定的種，對於篩選這樣的次生代謝產物產生菌，分類學上不同類別的多個菌株的SSU rRNA基因片段序列均可作為參照序列，因此參照菌株及其SSU rRNA基因片段，即參照片段的選擇策略變得很多樣，可以採用，但並不局限於這兩種方法(1)從分類學上不同類別的產生菌中選取其中一類菌作為參照菌株，如青黴素的高產菌為產黃青黴菌的概率很大，則可選取產黃青黴菌作為參照菌株篩選青黴素產生菌；(2)從分類學上不同類別的產生菌中選取其中幾個或者所有的類別，分別作為參照菌株來進行篩選。如果手頭有待篩選的次生代謝產物產生菌，可以將其SSU rRNA基因片段進行測序，然後作為參照序列，特別是當從其他途徑找不到合適的參照序列時，這種方法是很有效的。多數情況下，不管採用哪種策略選擇參照SSU rRNA基因片段序列，符合條件的參照序列不止一條，選擇任何一條序列，或者選擇多條序列同時作為參照序列都是可行的。
確定了參照SSU rRNA基因片段序列後，便可以將菌種庫中的每個菌株的SSUrRNA基因片段序列與參照序列進行同源性分析。篩選時需要設定一個篩選的標準，將符合標準的菌株作為嫌疑菌株。可以採用多種方法進行同源性分析，這些方法基本類似，但是不完全相同。可以採用，但不局限於以下三種方法進行同源性分析(1)利用常用的算法，將庫中的每個菌株的SSU rRNA基因片段序列與參照序列進行一對一比對並得到序列相似性分析結果。根據分析結果，設定一個相似性閾值，與參照序列的相似性高於閾值的SSU rRNA基因片段序列對應的菌株，即是嫌疑菌株。閾值的高低可以根據篩選者的需要進行調節，以此達到控制篩選通過率的目的。目前已經有許多程序可以進行一對一核酸序列比對，如BLAST程序等。(2)將參照序列與多條待篩選的菌株的SSU rRNA基因片段序列放在一起，建立分子進化樹，按照優先選擇跟參照序列距離較近的SSU rRNA基因片段序列的原則，選擇一定數量的SSU rRNA基因片段序列，即選擇這些序列對應的菌株作為嫌疑菌。(3)先按照方法(1)進行序列相似性比對，然後按相似性從高到低選擇一定數量的SSU rRNA基因序列，再按方法(2)將參照序列跟這些所選擇的這些序列放在一起建立進化樹進行分析，選擇一定數量的嫌疑菌株。所有這些分析程序，可以是目前已經商業化的程序，包括免費程序，也可以是自己定製的專用程序。
初篩嫌疑菌株的進一步篩選和化合物結構鑑定則採用合適的傳統方法進行，如採用，但不局限於，生物活性篩選方法、液相色譜、質譜等進行進一步篩選和分析嫌疑菌株發酵液，並最終用精確的方法分析鑑定嫌疑菌株產生的是否為目標次生代謝產物。如對於小分子化合物的最終結構鑑定，常常採用紅外光譜，紫外光譜、質譜和核磁共振等進行最終的結構鑑定。
由於本發明是用來篩選結構、功能已經在科學界被研究和報導的，並且建立了完整的結構鑑定和功能檢測方法的微生物次生代謝產物，因此初篩嫌疑菌株的進一步篩選和化合物結構鑑定可以採用這些已經報導的成熟方法進行，這裡不再贅述。
以下舉幾個例子以更好的說明本發明，但是本發明並不局限於這些例子。
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、初步篩選土黴素產生菌的嫌疑菌株1、微生物基因組DNA的提取菌種10073，10025(中國工業微生物菌種保藏管理中心)均為枯草芽孢桿菌；菌種11005(中國工業微生物菌種保藏管理中心)為龜裂鏈黴菌，產土黴素；菌種11002(中國工業微生物菌種保藏管理中心)為灰色鏈黴菌，產鏈黴素。菌種A-1為從土壤中分離的一株菌，疑為真菌，具體種屬未知。所有菌種採用無菌LB培養液(1％胰化蛋白腖，0.5％酵母膏，1％NaCl，蒸餾水配，pH7.0)復甦和培養，培養於裝有5ml對應培養液的試管中，A-1的試管中還加入1g直徑4mm的無菌玻璃珠。所有菌種於220轉/分鐘，30℃振蕩培養至OD600值為0.6後，取1.5ml菌液，採用Easy-DNA試劑盒(Invitrogen)，按照試劑盒說明書提取基因組DNA，並最終將提取得到的每種菌的DNA溶於100μl TE緩衝液中。提取的基因組DNA樣品各取5μl，採用0.8％的瓊脂糖凝膠進行電泳，EB顯色進行檢測，結果見圖1所示，表明成功的提取了各個菌種的基因組DNA，各個基因組DNA片段大小均在10kb以上。圖1中，泳道1為GenRuler 1kb DNA Ladder(Fermentas)，其最大的條帶為10kb。泳道2、3、4、5、6依次為10073基因組DNA，10025基因組DNA，11005基因組DNA，11002基因組DNA，A-1基因組DNA。
2、微生物SSU rRNA基因片段的擴增、測序和記錄採用PCR方法分別對步驟1中提取得到的各個菌種基因組DNA片段中的SSUrRNA基因片段進行擴增。每個菌種單獨一個反應體系。引物BSF8/20(5』AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3』)和BSR1541/20(5』AAGGAGGTGATCCAGCCGCA3』)用於擴增真細菌(10073，10025，11005和11002)SSU rRNA基因片段，引物NSF4/18(5』CTGGTTGATYCTGCCAGT3』)和NSR1787/18(5』CYGCAGGTTCACCTACRG3』)用於擴增真核生物A-1 SSU rRNA基因片段，其中NSF4/18和NSR1787/18均為簡併引物，「Y」代表C/T簡併(http://www.psb.ugent.be/rRNA/ssu/index.html)。每條引物(簡併引物作為一條看待)均配成20μM。反應體系中加入0.25μl ExTaq(5U/μl，Takara)，5μl 10×Ex Taq Buffer(Mg2+ Plus，Takara)，4μldNTP混合物(各2.5mM，Takara)，1μl菌種基因組DNA，引物BSF8/20、BSR1541/20、NSF4/18和NSR1787/18各1μl，最後加入ddH2O補充到總體積50μl。反應條件為94℃預熱5min；然後94℃解鏈1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，擴增30個循環後72℃額外延伸5min，最後4℃保溫。PCR產物各取20μl，採用0.8％的瓊脂糖凝膠進行電泳，EB顯色進行檢測，結果如圖2所示，表明除了A-1的PCR產物大小約為1.8kb，其他的均約為1.5kb。圖2中，泳道1為GenRuler 1Kb DNALadder(Fermentas)，泳道2、3、4、5、6依次為10073，10025，11005，11002，A-1的PCR產物。
為了進一步測序，切下凝膠中10025，10073，11005和11002的PCR產物在1.5kb附近的條帶，切下A-1的PCR產物在1.8kb附近的條帶，均採用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(Sangon)進行回收。其中10025，10073，11005的膠回收產物直接送Invitrogen上海(原上海博亞公司)測序。11002的膠回收產物進一步連接到克隆載體pGEM-T-easy(Promega)上並轉化入大腸桿菌DH5α中，通過藍白斑篩選和PCR的方法挑選重組質粒，然後將重組質粒送Sangon進行測序；A-1的膠回收產物也如11002的產物連接到克隆載體pGEM-T上，最後將挑選出的重組質粒送Invitrogen上海進行測序。測序結果如序列表中序列1至5所示，10025具有序列表中序列1的核苷酸序列，由1445個核苷酸組成；10073具有序列表中序列2的核苷酸序列，由1444個核苷酸組成；11005具有序列表中序列3的核苷酸序列，由1413個核苷酸組成；A-1具有序列表中序列4的核苷酸序列，由1778個核苷酸組成；11002具有序列表中序列5的核苷酸序列，由1519個核苷酸組成。所有這些序列都通過在Genbank上進行同源比對，確認為對應菌株的SSU rRNA基因片段的正義鏈。
3、以SSU rRNA基因片段序列比對方法初步篩選土黴素產生菌的嫌疑菌株將以上測出的5個菌種的SSU rRNA基因片段序列分別用DNAStar軟體中的Editseq程序處理，並分別保存為「.Seq」格式的文件。為了便於後面的數據分析，將這五個文件用Editseq程序同時打開，並輸出為一個記錄了這五條序列信息的FASTA格式的文件。具體操作為，用Editseq打開這五個文件以後，點擊「File」菜單下的「Export all as one」命令，保存為FASTA格式的文件「Local_database.Fas」。
土黴素產生菌的分類學位置可以通過多種途徑了解到，本實施例中參考了《抗生素與微生物產生的生物活性物質》(張致平和姚天爵主編，2005年1月第一版，化學工業出版社)、Pubmed信息和ATCC在線資料庫，通過信息檢索了解到有些高產菌屬於streptomyces riosus這個種。在GenBank的Nucleotide資料庫中按「riosus」和「rRNA」關鍵詞進行檢索，得到多個屬於streptomyces riosus種的菌株的SSU rRNA基因片段序列信息，通過初步的同源性比對，選取其中具有代表性的，一條名稱為「Streptomyces rimosus subsp.rimosus」的菌株作為「參照SSU rRNA基因片段序列」(GenBank AcessionAB045883；GI10038685)，其序列信息見序列表中序列6。
然後將菌株10025，10073，11005、11002和A-1的SSU rRNA基因片段序列與「參照SSU rRNA基因片段序列」做同源性比對，將同源性較高的序列對應的菌株作為土黴素嫌疑產生菌。步驟如下1)用BioEdit 6.0.7軟體將記載有5個待篩菌株SSU rRNA基因片段信息的文件「Local_database.Fas」設置為本地資料庫，然後用參照SSU rRNA基因片段序列與該資料庫進行本地BLAST(Local BLAST)，結果見表1。
2)選取BLAST分值顯著高於其他菌株的11005和11002作為土黴素嫌疑產生菌，以作進一步的篩選檢測。其中11002分值為2936，11005為2795。
表1.參照SSU rRNA基因片段序列在本地SSU rRNA基因片段資料庫中的BLAST簡要結果BLASTN 2.2.2[Dec-14-2001]ReferenceAltschul，Stephen F.，Thomas L.Madden，Alejandro A.Schaffer，Jinghui Zhang，Zheng Zhang，Webb Miller，and David J.Lipman(1997)，″Gapped BLAST and PSI-BLASTa new generation of protein database searchprograms″，Nucleic Acids Res.253389-3402.
Query＝Streptomyces_rimosus_subsp._rimosus.seq(1485 letters)Databased/PROGRA～1/bioedit/database/Local_database.fas5 sequences；7599 total lettersSequences producing significant alignments Score(bits) E Value11002.seq 2936 0.011005.seq 2795 0.0
10025.seq 228 2e-06210073.seq 210 4e-057A-1.seq 40 9e-006作為一種替代方法，也可以通過做多序列比和分子進化樹來進行初篩。做法如下1)用Mega3.0軟體，將10025，10073，11005、11002和A-1的SSU rRNA基因片段序列，以及「參照SSU rRNA基因片段序列」，採用Clustal W方法進行多序列比對，基於多序列比對結果，採用「Neighbor-Joining」方法構建進化樹，進化樹結果見圖3。
2)選取與參照菌株進化關係明顯比其他菌株近的兩株菌，即11002和11005作為土黴素嫌疑產生菌，以作進一步篩選檢測。
另外，可以將以上兩種方法綜合起來進行嫌疑菌株的初步篩選。如通過LocalBLAST篩選排除分值僅為40的A-1，然後對10025，10073，11005、11002和參照序列構建進化樹，結果見圖4，明顯可以看出，11002和11005與參照菌株形成一個相對緊密的群，與10025和10073形成的群區別開來，因此從中篩選11002和11005作為土黴素嫌疑產生菌。
實施例2、初篩嫌疑菌株的進一步篩選——高效液相色譜-質譜聯用儀檢測嫌疑菌株的發酵液按照中國工業微生物菌種保藏管理中心產品目錄中，菌種發酵培養基為花生餅2％，磷酸氫二鉀0.01％，澱粉6％，NaCl 0.5％，玉米漿0.5％，碳酸鈣0.8％，用鹽酸調pH值為6.9。實施例1中用LB培養基培養的嫌疑菌株按1％(體積比)的接種量，接種於裝有5ml滅菌的發酵培養基的試管中，30℃培養2天，然後按10％(體積比)接種量轉接於裝有50ml發酵培養基的搖瓶中，30℃培養4天。
用草酸將5ml發酵液pH調至2.0，室溫下振蕩20分鐘，然後過濾除去菌體，得到澄清濾液。濾液用0.2M NaOH調至pH4.7，室溫放置60min，經過過濾，乾燥得固體，放入1.5ml聚丙烯離心管，管中加入200μl二甲亞碸(分析純，Sigma)，40℃保溫1小時，10,000g離心5min，收集上清液於一個新的1.5ml離心管，從而製成11002和11005的發酵液提取物。
採用高效液相色譜-質譜聯用法檢測嫌疑菌株11005和11002的發酵液提取物，進樣量為土黴素游離鹼標準樣(Sigma)5μl，11002和11005的提取物各100μl。高效液相色譜檢測條件為Waters 2690高效液相色譜儀(Waters)，Waters996全波長檢測器(Waters)全波長掃描，Angilent公司C18色譜柱，流動相A為10mM乙酸銨，流動相B為5％-95％乙腈梯度，梯度變化時間0-10min。質譜檢測條件為Waters ZMD質譜儀(Waters)，電噴霧電離源，電噴霧電壓3.0V，電噴霧接口乾燥器流速250L/hr，脫溶劑溫度250℃，碰撞誘導解離電壓30V，離子源溫度120℃。高效液相色譜-質譜聯用法檢測結果如圖5-11所示。圖5表明土黴素的液相色譜保留時間為5.7min左右，該處出現單一的光吸收峰和離子流峰，從上到下依次為液相色譜圖、負離子流圖譜和正離子流圖譜。圖6為土黴素標準樣在5.7min處的質譜圖，其中ES+圖譜(圖6中上側圖譜)中的461.5峰為土黴素的特徵峰(土黴素游離鹼分子量為460.4)，而483.4峰為加Na+的峰，亦為土黴素特徵峰；ES-圖譜(圖6中下側圖譜)中的459.4為特徵峰。圖7為保留時間5.7min處土黴素標準樣品的光吸收圖譜，其中274nm和356nm附近為土黴素的兩個特徵吸收峰。圖8是11005發酵液提取物的液相色譜和正負離子流圖譜(上到下依次為液相色譜圖、負離子流圖譜和正離子流圖譜)，在土黴素的保留時間5.7min處出現了光吸收峰和離子流峰，說明該發酵液提取物可能含有土黴素。圖9是11005樣品在5.7min處的質譜圖，出現了土黴素標準樣在ES+圖譜(圖9的上側圖譜)中的兩個特徵峰461.4和483.4，以及在ES-(圖9的下側圖譜)中的特徵峰459.4。圖10進一步顯示了11005樣品在5.7min附近的光吸收圖譜，其光吸收圖譜不僅在274.6nm和356.6nm出現了土黴素標準樣的兩個特徵吸收峰，而且整個光圖譜與土黴素標準樣一致。圖10中274.6和356.6為土黴素特徵吸收峰。綜合這幾個檢測結果，可以初步判定11005發酵液含有土黴素。
圖11是11002發酵液提取物的液相色譜圖，可以看出，11002樣品在土黴素的保留時間5.7min附近沒有明顯的光吸收峰和離子流峰出現。可以初步判定嫌疑菌株11002不產土黴素。圖11中從上到下依次為液相色譜圖、負離子流圖譜和正離子流圖譜。
因此，在SSU rRNA基因片段序列比對方法的輔助下，採用液相色譜-質譜聯用方法成功的從五株菌中篩選得到一株土黴素產生菌11005，並成功的將初篩得到的土黴素嫌疑產生菌11002排除掉。該篩選結果與購買時菌種提供方提供的菌種信息也是吻合的，說明該篩選方法有效。
需要說明的是，基於大的菌種庫，如5,000菌株以上，篩選多種次生代謝產物時，本發明展示的方法能更加明顯的顯示快速有效的特點，這些特點是跟該發明的這固有特點分不開的即在初篩時，將原本繁瑣的實際篩選工作，變成利用計算機軟體直接對「海量的」菌種的SSU rRNA進行高速的數據分析和檢索，從而成千倍的縮短了初篩時間。雖然以上實施例並不是基於一個大的菌種庫進行，但是任何從事活性次生代謝產物產生菌篩選，以及生命科學和信息科學領域的技術人員，都能很容易的通過這些實施例合理的推理並理解本發明的技術特點，即基於大菌種庫進行多個品種的篩選的快速和有效性。
序列表160621012111445212DNA213枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)220
223
4001tgcgagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120atgcttgttt gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240ccgacctgag agggtgatcg gccaaactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc cgttcaaata 420gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atgggcagaa 1200caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380cccgaagtcg gtgaggtaac ctttttggag ccagccgccg aaggtgggac agatgattgg 1440ggtga 144521022111444
212DNA213枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)220
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權利要求
1.初步篩選次生代謝產物產生菌的方法，包括以下步驟1)測定待篩選的菌種庫中的每個菌株的核糖體小亞基RNA基因片段的序列；2)將目標次生代謝產物的已知產生菌，或在分子分類學上與所述目標次生代謝產物的已知產生菌是同一個分類階元的菌株作為參照菌株；以所述參照菌株的核糖體小亞基RNA基因片段序列作為參照核糖體小亞基RNA基因片段序列；將所述參照核糖體小亞基RNA基因片段序列與步驟1)中的所述待篩選的菌種庫中的菌株的核糖體小亞基RNA基因片段序列進行一對一的同源性比對，和所述參照核糖體小亞基RNA基因片段序列的同源性大於等於根據篩選通過率確定的同源性數值的菌株即為初篩的嫌疑菌株。
2.根據權利要求
1所述的方法，其特徵在於步驟1)和2)中所述核糖體小亞基RNA基因片段為選自下述a)、b)或c)中的一段長度大於等於100個核苷酸或100個核苷酸對的連續的多核苷酸序列a)核糖體小亞基RNA基因編碼區序列，b)SSU-LSUr RNA基因編碼區間的序列，c)核糖體小亞基RNA基因編碼區和SSU-LSUr RNA基因編碼區間的序列；所述SSU-LSU rRNA基因編碼區間的序列是指位於核糖體小亞基RNA基因編碼區的3』末端和下遊鄰近的核糖體大亞基RNA基因編碼區5』末端之間的序列。
3.根據權利要求
2所述的方法，其特徵在於所述核糖體小亞基RNA基因片段的長度為150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、1500、1700、1800、2100或2300個核苷酸或核苷酸對，其中每個片段中至少30個核苷酸或核苷酸對來自於核糖體小亞基RNA基因編碼區和/或SSU-LSUr RNA基因編碼區間的可變區。
4.根據權利要求
3所述的方法，其特徵在於所述核糖體小亞基RNA基因片段為整個SSU rRNA基因編碼區。
5.根據權利要求
1所述的方法，其特徵在於所述已知產生菌的分類學名稱確定到屬或屬以下。
6.根據權利要求
1至5中任一所述的方法，其特徵在於步驟2)中，所述參照菌株為產生目標次生代謝產物的已知產生菌。
7.根據權利要求
6所述的方法，其特徵在於所述參照菌株為目標次生代謝產物的已知產生菌中最低分類階元的菌株。
8.根據權利要求
1至5中任一所述的方法，其特徵在於所述參照菌株為一株或多株。
9.根據權利要求
8所述的方法，其特徵在於所述參照菌株為多株；所述參照菌株來自於同一分類階元或不同分類階元。
10.根據權利要求
1至5中任一所述的方法，其特徵在於所述參照核糖體小亞基RNA基因片段序列為一條或多條。
專利摘要
本發明公開了初步篩選次生代謝產物產生菌的方法。該方法包括以下步驟1)測定待篩選的菌種庫中的每個菌株的核糖體小亞基RNA基因片段的序列；2)將目標次生代謝產物的已知產生菌，或在分子分類學上與所述目標次生代謝產物的已知產生菌是同一個分類階元的菌株作為參照菌株；以所述參照菌株的核糖體小亞基RNA基因片段序列作為參照核糖體小亞基RNA基因片段序列；將所述參照核糖體小亞基RNA基因片段序列與步驟1)中的所述待篩選的菌種庫中的菌株的核糖體小亞基RNA基因片段序列進行一對一的同源性比對，和所述參照核糖體小亞基RNA基因片段序列的同源性大於等於根據篩選通過率確定的同源性數值的菌株即為初篩的嫌疑菌株。
文檔編號C12Q1/68GKCN1966717SQ200510114891
公開日2007年5月23日 申請日期2005年11月17日
發明者彭晶生 申請人:彭晶生導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan