癌細胞內過氧化氫檢測比色/螢光紙晶片的製備的製作方法
2023-04-24 14:49:43 1
本發明涉及低成本、易於攜帶且可視化的癌細胞內過氧化氫分析檢測技術領域，更具體的說是一種能夠用於癌細胞內過氧化氫檢測的比色/螢光紙晶片的製備。
背景技術：
過氧化氫，是活性氧簇中穩定性最好的一種，它是重要的胞內信號分子，主要調節DNA損壞，蛋白質合成及細胞凋謝等。低濃度下，過氧化氫作為普遍存在的胞內第二信使可以激活信號橋促使細胞的增殖，分化和遷移，對細胞起到調節保護作用。然而，當過氧化氫的濃度過度表達時，就會引起DNA鹼基的修改，如嘌呤和嘧啶的氧化和鏈的斷裂等，從而引起細胞的變異甚至產生癌變。因此細胞內過氧化氫高靈敏、高可信度的檢測顯得尤為重要。
除了一些傳統的方法，最近在納米酶研究方面產生了一些新的傳感方法，納米酶是具有類酶性質的納米粒子，而納米鈰是具有很好類酶活性的一類。當納米鈰與過氧化氫混合時，它的顏色由白色變為了橘黃色。因此，基於顏色改變的過氧化氫的直接檢測被報導。然而，比色生物傳感器只能夠對被測物進行直觀的、可視化測定，因其靈敏度低，只能進行半定量或定性檢測。而螢光檢測作為一種發展成熟的檢測方法，因其靈敏度高、操作簡單、專一等優點被廣泛應用在生物檢測和臨床醫學中。過氧化氫會替代吸附在納米鈰表面的DNA，從而產生螢光信號的「關-開」。兩種方法的結合不僅達到了高靈敏、直觀的檢測，還使得檢測結果的可信度得到大大的提高。
而微流控紙晶片，因其低消費，易攜帶，可控等特點，被廣泛應用在各種生物傳感器中。而中空通道紙晶片因其避免了樣品在通道中樣品揮發嚴重、流通緩慢等問題，引起了廣大研究者越來越多的關注。中空通道使螢光和比色的方法有效結合在一起，不僅解決了靈敏度和直觀性檢測的問題，而且有望在資源匱乏或偏遠地區得到廣泛的應用。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種長有二氧化鈰的中空通道微流控紙晶片，通過比色/螢光檢測的方法，從而實現癌細胞內低含量過氧化氫的快速、靈敏且可視化檢測。
為了解決上述技術問題，本發明是通過以下措施來實現的：一種新型的中空通道比色/螢光紙晶片的製備，其特徵是包括以下步驟：
（1）在計算機上設計如附圖1所示的螢光/比色紙晶片的疏水蠟列印區域和親水工作區域；
（2）通過蠟印表機將步驟（1）中設計的紙晶片列印上疏水圖案，隨後將得到的紙晶片於120-150 ºC下加熱1-2 min，使蠟融化，形成疏水層；
（3）利用雷射切割機，對步驟（2）中得到的紙晶片進行切割，將灰色區域切掉，製備孔洞；
（4）在步驟（3）中所得紙晶片的親水區域1上生長二氧化鈰；
（5）將生物相容性好的螢光物質修飾的DNA、適配體鏈及癌細胞固定到步驟（4）所得的紙晶片上，隨後用牛血清白蛋白封鎖活性位點；
（6）在步驟（5）所得的紙晶片親水區域2上埋伏儲備液；
（7）將步驟（6）所得的紙晶片按箭頭方向摺疊，進行可視化比色檢測；隨後放入螢光設備中，在一定的激發波長和發射波長下進行精確螢光測定。
本發明所設計的中空通道紙晶片的具體尺寸如附圖2所示，右側紙晶片的親水區域1和加樣區直徑為6 mm，親水區域2的直徑為4 mm，左側紙晶片灰色區域為與右側紙晶片的親水區域完全對應的孔洞，連接兩個孔洞的是長為4 mm，寬為2 mm的親水通道。
本發明所述在步驟（3）中所得紙晶片的親水區域1上生長二氧化鈰，具體步驟如下：
將相同體積的20.0 mM的氯鉑酸和10.0 mM 的硼氫化鈉溶液混合後，迅速吸取20.0 μL滴加到紙晶片的工作區域，室溫下生長10 min，用二次水徹底衝洗，在室溫下乾燥；接下來將0.374 g 硝酸鈰、0.09 g 六亞甲基四胺及0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮溶解在16 mL蒸餾水中，混勻，將混合物轉移到50 mL高壓釜中，之後，將生長有Pt納米粒子層的紙晶片浸入高壓釜中，並在180 ºC下保持100 min，然後冷卻到室溫，將紙晶片取出後，用乙醇和二次水徹底清洗，最後60 ºC真空乾燥。
本發明所述的生物相容性好的螢光物質為：量子點：石墨烯量子點，摻雜的石墨烯量子點，碳點，氮摻雜、氮硫摻雜碳點；金屬團簇：金簇，銀簇，銅簇，金銀簇。
本發明所述的在紙晶片親水區域2上埋伏的儲備液為10 µL癌細胞的相應刺激物血管內皮細胞生長因子佛波酯。
本發明所述的樣品的測定步驟，將步驟（6）所得的紙晶片按箭頭方向摺疊，進行樣品的測定，繪製灰度與癌細胞濃度的標準曲線，實現可視化比色測定；隨後放入螢光設備中，在一定的激發波長和發射波長下進行樣品的測定，繪製螢光強度與癌細胞濃度的標準曲線，實現精確螢光測定。
本發明的有益效果：
（1）紙上生長二氧化鈰，實現了比色/螢光雙模式的聯用，從而實現了癌細胞中低含量過氧化氫的靈敏、快速及可視化檢測。
（2）通過精巧地設計中空通道紙晶片，避免了刺激物與癌細胞的長期接觸。
附圖說明
圖1：紙晶片的疏水蠟列印圖案；
圖2：紙晶片的尺寸及摺疊方式。
具體實施方式
實施例1
MCF-7細胞內過氧化氫檢測比色/螢光紙晶片的製備：
（1）在計算機上設計如附圖1所示的比色/螢光紙晶片的疏水蠟列印區域和親水工作區域，右側紙晶片的親水區域1和加樣區直徑為6 mm，親水區域2的直徑為4 mm，左側紙晶片灰色區域為與右側紙晶片的親水區域完全對應的孔洞，連接兩個孔洞的是長為4 mm，寬為2 mm的親水通道；
（2）通過蠟印表機將步驟（1）中設計的紙晶片列印上疏水圖案，隨後將得到的紙晶片於120-150 ºC下加熱1-2 min，使蠟融化，形成疏水層；
（3）利用雷射切割機，對步驟（2）中得到的紙晶片進行切割，將灰色區域切掉，製備孔洞；
（4）在步驟（3）中所得紙晶片的親水區域1上生長二氧化鈰，亦即將相同體積的20.0 mM的氯鉑酸和10.0 mM 的硼氫化鈉溶液混合後，迅速吸取20.0 μL滴加到紙晶片的工作區域，室溫下生長10 min，用二次水徹底衝洗，在室溫下乾燥；接下來將0.374 g 硝酸鈰、0.09 g 六亞甲基四胺及0.4 g 聚乙烯吡咯烷酮溶解在16 mL蒸餾水中，混勻，將混合物轉移到50 mL高壓釜中，之後，將生長有Pt納米粒子層的紙晶片浸入高壓釜中，並在180 ºC下保持100 min，然後冷卻到室溫，將紙晶片取出後，用乙醇和二次水徹底清洗，最後60 ºC真空乾燥；
（5）將生物相容性好的石墨烯量子點修飾的DNA、適配體鏈及MCF-7細胞固定到步驟（4）所得的紙晶片上，隨後用牛血清白蛋白封鎖活性位點；
（6）在步驟（5）所得的紙晶片親水區域2上埋伏10 µL癌細胞的相應刺激物血管內皮細胞生長因子佛波酯；
（7）將步驟（6）所得的紙晶片按箭頭方向摺疊，進行樣品的測定，繪製灰度與癌細胞濃度的標準曲線，實現可視化比色測定；隨後放入螢光設備中，在一定的激發波長和發射波長下進行樣品的測定，繪製螢光強度與癌細胞濃度的標準曲線，實現精確螢光測定。
實施例2
製備步驟同例1，不同之處是：所用癌細胞為A549細胞，所用螢光物質為碳點。
SEQUENCE LISTING
濟南大學
癌細胞內過氧化氫檢測比色/螢光紙晶片的製備
2016
2
PatentIn version 3.3
1
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DNA
人工合成
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2
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人工合成
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