檢測氯黴素的試劑盒的製作方法

2023-04-24 14:50:11 1

專利名稱：檢測氯黴素的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及酶聯免疫和獸藥殘留檢測分析技術領域中的一種檢測氯黴素的試劑盒。
背景技術：
氯黴素(chloramphenicol，CAP)是應用廣泛的抗菌素，在畜禽疾病控制和治療中起到了重要作用。但由於氯黴素存在嚴重的副作用，能抑制骨髓細胞內線粒體的蛋白質合成，造成骨髓細胞和肝細胞的毒性，從而引起人的再生性障礙性貧血，粒細胞缺乏症，新生兒、早產兒灰嬰綜合症等疾病，歐美等發達國家已相繼禁止或嚴格禁止使用。2002年12月中國農業部公告第235號文規定，氯黴素及其鹽、酯(包括琥珀氯黴素)在所有食品動物的所有可食組織中不得檢出。但由於氯黴素價格便宜且為廣譜抗生素，違法使用仍很普遍。因此加強對動物性食品中氯黴素的殘留檢測是非常必要的。
目前，常用於氯黴素殘留檢測的方法主要有微生物法和儀器分析法。微生物檢測法雖然經濟、操作簡便，但在樣本中有其他微生物抑制劑存在時，其靈敏度和特異性受到限制；高效液相色譜分析法、氣譜、氣質聯機法等單純的儀器分析方法，雖然靈敏度高，但是樣本前處理及測定操作煩瑣，費用高，不適宜於大量樣本篩查，可以作為殘留的確證分析。免疫化學法，尤其是酶聯免疫吸附測定法(ELISA)其靈敏度比微生物法高，樣品前處理又比儀器分析法簡單，特別適於現場監控和大量樣本篩查。
發明創造內容本發明的目的是提供一種檢測氯黴素的試劑盒。
本發明所提供的檢測氯黴素的試劑盒，包括酶標氯黴素及包被的氯黴素特異性抗體。
其中，所述氯黴素特異性抗體可為氯黴素單克隆抗體或氯黴素多克隆抗體，所述氯黴素單克隆抗體或多克隆抗體可為鼠源、馬源、羊源、兔源和豚鼠源抗體，所述氯黴素單克隆抗體優選為氯黴素鼠單克隆抗體，所述氯黴素多克隆抗體優選為氯黴素兔多克隆抗體。以上抗體均可以用氯黴素與載體蛋白的偶聯物作為免疫原按常規方法製備。所述載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、卵清蛋白(OVA)或血蘭蛋白(KLH)等常用載體蛋白。所述標記酶可為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酯酶，優選為辣根過氧化物酶。
可作為固定所述氯黴素特異性抗體的載體的物質很多，如聚苯乙烯、纖維素、聚丙烯醯胺、聚乙烯、聚丙烯、交聯葡聚糖、玻璃、矽橡膠、瓊脂糖凝膠等。該載體的形式可以是試管、微量反應板凹孔、小珠、小圓片等。
為了更方便現場監控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括氯黴素標準溶液、顯色劑、終止液、濃縮洗滌液和濃縮復溶液。
所述濃縮洗滌液為含有0.8-1.2％吐溫的磷酸鹽緩衝液；所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯苯胺(TMB)；所述濃縮復溶液為含有0.8-1.2％吐溫的檸檬酸鹽緩衝液。
本發明的檢測原理為將氯黴素特異性抗體作為包被原吸附於固相載體上，加入樣品和酶標氯黴素，待測樣品中殘留的氯黴素和酶標氯黴素競爭固相載體上包被的氯黴素特異性抗體，顯色後終止，測定樣品吸光值，該值與樣品中氯黴素殘留量呈負相關，與標準曲線比較即可得出氯黴素的含量。同時根據酶標板上的樣品顏色的深淺，與系列濃度的氯黴素標準溶液顏色的比較可判斷樣品的濃度範圍。
本發明的檢測氯黴素的試劑盒主要採用直接競爭ELISA方法定性或定量檢測動物組織(豬、雞、牛、羊的肌肉組織及肝臟、魚蝦等)、尿樣、血清血漿、飼料、蜂蜜、牛奶等樣品中氯黴素的殘留量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批樣品；該試劑盒採用高特異性的氯黴素單克隆抗體或多克隆抗體，主要試劑均以工作液形式提供，使用方便，具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點，可在動物性食品氯黴素殘留檢測中發揮重要作用。


圖1為檢測氯黴素的試劑盒的結構示意圖具體實施方式
實施例1、抗原及抗體的製備(1)酶標抗原的合成將氯黴素和辣根過氧化物酶進行偶聯，得到辣根過氧化物酶標記的氯黴素。
(2)免疫原的合成將氯黴素和牛血清白蛋白(BSA)採用活化酯法進行偶聯得到免疫原。
(3)氯黴素鼠單克隆抗體製備動物免疫程序採用Balb/c小鼠作為免疫動物，以氯黴素與牛血清白蛋白偶聯物為免疫原，免疫劑量為80-100μg/只，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合製成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔2-3周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，四免後腹腔加強免疫一次，3天後取脾細胞。
細胞融合與克隆化取免疫BALB/c小鼠脾細胞，按5-10∶1比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，採用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進行克隆化，得到穩定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
細胞凍存和復甦取處於對數生長期的雜交瘤細胞用凍存液製成1-5×106個/ml的細胞懸液，分裝於凍存管，在液氮中長期保存。復甦時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液後，移入培養瓶內培養。
單克隆抗體的製備與純化採用體內誘生法，將Balb/c小鼠(8周齡)腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7-14天後腹腔注射雜交瘤細胞5×105-106個/只，7-10天後採集腹水。經辛酸-飽和硫酸銨法進行腹水純化，小瓶分裝，-20℃保存。
(4)氯黴素兔多克隆抗體的製備採用紐西蘭大白兔作為免疫動物，以氯黴素與牛血清白蛋白偶聯物為免疫原，免疫劑量為1mg/kg·b.w.，首免時將免疫原與等量的弗氏完全佐劑混合製成乳化劑，頸背部皮下多點注射，間隔3-4周取相同劑量免疫原加等量弗氏不完全佐劑混合乳化，加強免疫一次，共免疫5次，最後一次不加佐劑。最後一次免疫7-10d後採血，測定血清抗體效價，心臟採血，經硫酸銨分級沉澱得到純化的多克隆抗體。
實施例2、檢測氯黴素的試劑盒(1)檢測氯黴素的試劑盒的結構試劑盒的結構如圖1所示，主要由盒體1、鋁膜真空包裝96孔/40孔酶標板2、6瓶氯黴素系列濃度標準品3、終止液4、酶標記物工作液5、底物顯色液A液6、底物顯色液B液7、濃縮洗滌液8、濃縮復溶液9和泡沫託架10，泡沫託架10上制有凹孔，上述試劑瓶3-9安放在泡沫託架的凹孔內，泡沫託架10及酶標板2安放在盒體內。其中酶標板2由塑料支架和可拆分的塑料條組成。
(2)所用試劑的配製a.氯黴素標準溶液∶氯黴素系列標準溶液6瓶，0、0.01、0.25、2.5、5.0、10.0ng/ml，1-3ml/瓶。
b.包被緩衝液pH9.6，0.05mol/L的碳酸鹽緩衝液。
c.封閉液3-10％小牛血清。
d.濃縮洗滌液含0.8-1.2％吐溫的磷酸鹽緩衝液(0.01M pH7.4)，為正常使用濃度的15-25倍，30-50ml/瓶，1瓶。
e.酶標記物工作液酶標氯黴素工作液，5-8ml/瓶，1瓶。
f.底物顯色液A液過氧化氫或過氧化脲，5-8ml/瓶，1瓶。
g.底物顯色液B液鄰苯二胺(OPD)或四甲基聯苯胺(TMB)，5-8ml/瓶，1瓶。
h.終止液1-2mol/L硫酸或鹽酸，5-8ml/瓶，1瓶。
i.濃縮復溶液含0.8-1.2％吐溫的檸檬酸鹽緩衝液，為正常使用濃度的5-10倍，30-50ml/瓶，1瓶。
(3)酶標板的製備用包被緩衝液將氯黴素特異性抗體稀釋成0.1-1μg/ml，每孔加入100μl，37℃溫育2h，4℃過夜，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次1min，拍幹，然後在每孔中加入150-200μl封閉液，37℃溫育1-2h，傾去孔內液體，乾燥後用鋁膜真空密封保存。
實施例3、樣品的前處理(1)動物組織稱取5g勻漿後的樣品，加入20ml乙酸乙酯，渦動，3000g離心5分鐘，取有機相於雞心瓶中。再向樣品中加入20ml乙酸乙酯重複提取一次，3000g離心，取上清，將兩次上清合併於雞心瓶中。50℃減壓蒸乾，4.5ml蒸餾水溶解，加正己烷，混勻，靜置，棄上層有機相。加入0.5ml濃縮復溶液，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(2)尿樣取1ml尿液，加入0.5ml 100mM醋酸鈉緩衝液，pH4.8，加入8μlβ-葡萄糖醛酸酶，37℃孵育3h，恢復至室溫後加入2ml乙酸乙酯混合，3000g離心10分鐘，取出1ml上層液體用氮氣吹乾，用濃縮復溶液稀釋樣品，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(3)血清血漿取1ml血清血漿，加入2ml乙酸乙酯，混合振蕩，3000g離心10分鐘，取1ml上層液用氮氣吹乾，用濃縮復溶液稀釋樣品，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(4)飼料取5g飼料加入20ml乙酸乙酯，混合，振蕩，3000g離心10分鐘。取1ml上層液用氮氣吹乾。用1ml異辛烷+氯仿(40+60)溶解殘留物。用濃縮復溶液稀釋樣品，3000g離心10分鐘，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(5)蜂蜜 取1g蜂蜜，加入4ml蒸餾水，再加4ml乙酸乙酯，混合，振蕩，3000g離心10分鐘。取2ml上層液用氮氣吹乾，用濃縮復溶液稀釋樣品，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(6)牛奶 將奶樣6000g離心10分鐘，吸除上層的脂肪，取0.5ml去除脂肪奶用復溶液稀釋，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
實施例4、檢測雞肝樣品中殘留的氯黴素(1)樣品前處理稱取5g勻漿後的樣品，加入20ml乙酸乙酯，渦動，靜置20分鐘，3000g離心5分鐘，取有機相於雞心瓶中。再向樣品中加入20ml乙酸乙酯重複提取一次，3000g離心10分鐘，取上清，將兩次上清合併於雞心瓶中。50℃減壓蒸乾，加入4.5ml蒸餾水溶解，加正己烷5ml，混勻，靜置，棄上層有機相。加入0.5ml濃縮復溶液，得到待測樣品溶液，取50μl進行分析。
(2)樣品檢測向用氯黴素特異性抗體包被的96孔酶標板微孔中加入系列標準溶液或樣品溶液(各2孔)50μl，然後加入酶標氯黴素工作液50μl，用蓋板膜封板，37℃恆溫箱中反應1h。倒出孔中液體，每孔加入250μl濃縮洗滌液(含1.2％吐溫的磷酸鹽緩衝液(0.01M pH7.4))，1分鐘後倒出孔中液體，用吸水紙拍幹，如此重複操作共洗板5次。每孔加入底物顯色液A液(過氧化脲)50μl，再加B液(鄰苯二胺)50μl，輕輕振蕩混勻，37℃恆溫箱避光顯色5-10min。每孔加入終止液(1.5mol/L硫酸)50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標儀測定每孔吸光度值(OD值)。
本實施例所用的試劑均按照實施例2中的試劑配製方法進行配製。
所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個標準(0標準)的吸光度值(B0)再乘以100，即百分吸光度值。
公式中B為標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值，B0為0μg/L標準溶液的平均吸光度值。以氯黴素濃度(μg/L)的自然對數值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪製標準曲線圖，相對應每一個樣品的濃度(μg/L)可以從標準曲線上讀出。也可以用回歸方程法計算出樣本溶液濃度。利用計算機專業軟體，更便於大量樣品的快速分析。整個檢測過程只需1.5小時就可以完成。
實施例5、試劑盒靈敏度、特異性、精密度、準確度和保存期試驗(1)試劑盒靈敏度試驗50％抑制濃度(既IC50，指0標準溶液的吸光度值的50％處所對應的藥物濃度)常作為評價競爭ELISA試劑盒靈敏度的指標。分別測定20次標準曲線的50％抑制濃度，確定該試劑盒標準曲線IC50應在1.5-4.0μg/L的範圍之內。分別測定20份雞肉、雞肝、豬肉、豬肝、魚蝦、血清血漿、尿樣、蜂蜜、牛奶和飼料的空白樣品及20份氯黴素0標準品。結果判定該試劑盒對氯黴素0標準品最低檢測限為0.05μg/L。對肌肉、肝臟、魚蝦、血清血漿、尿樣、蜂蜜和飼料的最低檢測限均小於0.1μg/L；對牛奶樣品的最低檢測限為0.15μg/L。
(2)試劑盒特異性試驗選擇與氯黴素類似結構和類似功能的4種氯黴素類藥物測定交叉反應率。通過各種藥物的標準曲線分別得到其50％抑制濃度。用下式計算試劑盒對其它藥物的交叉反應率。交叉反應率愈小，表明試劑盒的特異性愈高。

表1.試劑盒的特異性

試劑盒特異性試驗結果如表1所示，結果表明該試劑盒對氯黴素和琥珀氯黴素的交叉反應率高(注琥珀氯黴素進入體內經酶消解成為氯黴素發揮藥理作用，所以在動物源食品中均以氯黴素形式存在)，可保證對動物源食品及飼料中氯黴素殘留檢測結果的可靠性。
(3)試劑盒精密度試驗標準可重複性從三批酶聯板中，每板各抽出20個微孔，測定同一濃度標準溶液的吸光度值(OD值)，重複測定10次，計算變異係數。變異係數範圍在3.5-9.7％。
樣品可重複性取不同濃度的氯黴素標樣，添加到樣品中，分別取三個不同批次的試劑盒各三個，每個濃度重複5次。分別計算板內、批內、批間變異係數。動物肌肉、動物肝臟、魚蝦、血清血漿、尿樣、牛奶和蜂蜜的變異係數均低於20.0％，飼料的變異係數均低於15.0％。
(4)試劑盒的準確度取4個濃度的氯黴素標樣，對樣品進行添加回收試驗，每個濃度設4個平行，分別計算回收率。動物肝臟、動物肌肉、魚蝦、血清血漿、尿樣、蜂蜜、牛奶和飼料的添加回收率均在60.0-120.0％範圍內。
(5)試劑盒保存期試驗試劑盒保存條件為2-8℃，經過6個月的測定，試劑盒的最大吸光度值(零標準)、50％抑制濃度、氯黴素添加實際測定值均在正常範圍之內。考慮在運輸和使用過程中，會有非正常保存條件出現，將試劑盒在37℃保存的條件下放置6天，進行加速老化實驗，結果表明該試劑盒各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況發生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍5天，測定結果也表明試劑盒各項指標完全正常。從以上結果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存6個月以上。
權利要求
1.一種檢測氯黴素的試劑盒，包括酶標氯黴素及包被的氯黴素特異性抗體。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒還包括氯黴素標準溶液、顯色劑、濃縮洗滌液、終止液和濃縮復溶液。
3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於所述氯黴素特異性抗體為氯黴素單克隆抗體或氯黴素多克隆抗體。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於所述氯黴素特異性抗體是用氯黴素與載體蛋白的偶聯物作為免疫原得到的。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於所述載體蛋白為牛血清白蛋白、人血清白蛋白、卵清蛋白或血蘭蛋白。
6.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特徵在於所述標記酶為辣根過氧化物酶或鹼性磷酸酯酶。
7.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於所述濃縮洗滌液為含有0.8-1.2％吐溫的磷酸鹽緩衝液。
8.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於所述顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，所述顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯苯胺。
9.根據權利要求2所述的試劑盒，其特徵在於所述濃縮復溶液為0.8-1.2％吐溫的檸檬酸鹽緩衝液。
全文摘要
本發明公開了一種檢測氯黴素的試劑盒。本發明所提供的檢測氯黴素的試劑盒，包括酶標氯黴素及包被的氯黴素特異性抗體。本發明的檢測氯黴素的試劑盒能同時快速檢測大批樣品；主要試劑均以工作液形式提供，使用方便；具有高特異性、高靈敏度、高精確度、高準確度等特點，可在動物性食品氯黴素殘留檢測中發揮重要作用。
文檔編號G01N33/547GK1690707SQ20041003725
公開日2005年11月2日 申請日期2004年4月30日 優先權日2004年4月30日
發明者沈建忠, 史為民, 魏書林, 張素霞, 丁雙陽, 江海洋, 劉金鳳 申請人:中國農業大學