包含igf-1蛋白、緩衝劑和張力劑的藥物組合物的製作方法

2023-05-22 16:47:41

專利名稱：包含igf-1蛋白、緩衝劑和張力劑的藥物組合物的製作方法
包含IGF-1蛋白、緩衝劑和張ヵ劑的藥物組合物本發明涉及ー種藥物組合物,其包含作為活性藥物成分(active pharmaceuticalingredient, API)的膜島素樣生長因子 I (Insulin-like growth factor I, IGF-I)蛋白、張カ劑(tonicity agent)和緩衝劑(buffer)。IGF-I蛋白可以進ー步綴合聚こニ醇(poly (ethylene glycol), PEG)。該組合物可以作為注射劑或輸注劑施用，並且特別有效地用於治療、預防下述疾病和/或延緩下述疾病的進展神經變性病症，特別是阿爾茨海默病(Alzheimer，s Disease,AD),運動神經兀病(motor neuron disease,MND),特別是肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)或脊髓性肌萎縮(Spinal MuscularAtrophy, SMA)或肌營養不良症(Muscular Dystrophy, MD),特別是迪謝內肌營養不良(Duchenne Muscular Dystrophy, DMD)或營養不良性肌強直( Myotonic Dystrophy, MMD)。胰島素樣生長因子I(IGF-I)是ー種在結構上與胰島素相關的循環合成代謝激素。傳統上認為IGF-I是生長激素對外周組織作用的主要調控劑。IGF-I由70個胺基酸組成，並且還被命名為生長調節素C並由SwissProt NO.P01343定義。例如，應用、活性和生產在 Ie Bouc，Y.,等，FEBS Lett. (FEBS 通訊)196 (1986) 108-112 ;de Pagter-Holthuizen,P.,等，FEBS Lett. (FEBS 通訊)195(1986) 179-184 ；Sandberg Nordqvist, A. C.,等，Brain Res. Mol. Brain Res.(腦研究與分子腦研究)12 (1992) 275-277 ；Steenbergh, P. H.,等，Biochem. Biophys. Res. Commun.(生物化學、生物物理研究通訊)175 (1991) 507-514 ；Tanner, J. Μ.,等，Acta Endocrinol. (Copenh.)84(1977)681-696 ；Uthne, K.,等，J. Clin.Endocrinol. Metab.(臨床內分泌代謝雜誌)39 (1974) 548-554 ;EP 0123228 ；EP 0128733 ；US5, 861，373 ；US 5，714，460 ；EP 0597033 ；W0 02/32449 ；W0 93/02695 中提及。關於IGF-I結合蛋白(IGFBP)對IGF-I功能的調節以及IGF-I的體內生產和存在的進ー步的信息記述在WO 2006/066891和WO 2009/121759中。這些參考文獻還描述IGF-I在中樞神經系統(CNS)中的吸收、功能以及治療應用。WO 2006/066891中記述了IGF-I用於治療、預防神經變性病症，特別是阿爾茨海默病(AD)和/或延緩其進展的應用。WO 2009/121759中記述了 IGF-I用於治療、預防神經肌肉病症和/或延緩其進展的應用。其中記述IGF-I有效用於治療運動神經元病(MND)，特別是肌萎縮側索硬化(ALS)或脊髄性肌萎縮(SM)或肌營養不良症(MD)，特別是迪謝內肌營養不良症(DMD)或營養不良性肌強直_)。WO 2006/066891公開了由胰島素樣生長因子I (IGF-I)變體和一個或兩個聚こニ醇基團組成的PEG化的IGF-I綴合物。所述的IGF-I變體在野生型IGF-I胺基酸序列的胺基酸位置27，37，65，68中的至多三個位置處具有胺基酸變化，以使所述胺基酸中的ー個或兩個是賴氨酸，並且胺基酸27是除賴氨酸外的極性胺基酸。所述IGF-I變體通過所述賴氨酸的伯氨基基團與PEG綴合，並且所述聚こニ醇基團具有20至IOOkDa的總分子量。WO 2009/121759中公開的PEG化的IGF-I綴合物包含IGF-I變體，所述IGF-I變體特徵在於，其來源於野生型人IGF-I胺基酸序列，並且帶有在胺基酸位置27，65和68處的一個或兩個胺基酸改變，以使在位置27，65和68處的ー個或兩個胺基酸是除賴氨酸外的極性胺基酸，並且PEG連接在至少ー個賴氨酸殘基上。
除非另外指明，列出下述定義來示例和定義在本文中用於描述本發明的各個術語的意思和範圍。術語「IGF-I蛋白」用在本文中是指作為野生型的胰島素樣生長因子I、任意種類的變體及其PEG化的IGF-I綴合物。術語「 IGF-I變體」用在本文中是指IGF-I蛋白，其特徵在於具有在野生型IGF-I胺基酸序列(SEQ ID NO 1)的胺基酸位置27，65和/或68處的胺基酸改變。所述IGF-I變體有效地作為中間體用於生產PEG化的IGF-I變體。IGF-I變體指定如下K27意指胺基酸27是賴氨酸，Κ65意指胺基酸65是賴氨酸，Κ68意指胺基酸68是賴氨酸，R27意指胺基酸27是精氨酸，R65意指胺基酸65是精氨酸，、R68意指胺基酸68是精氨酸，K27R意指SEQ ID NO : I胺基酸位置27的賴氨酸改變為精氨酸，K65R意指SEQ IDNO 1胺基酸位置65的賴氨酸改變為精氨酸，K68R意指SEQ ID NO : I胺基酸位置28的賴氨酸改變為精氨酸，等等。「極性胺基酸」用在本文中是指選自由下列各項組成的組的胺基酸半胱氨酸(C)，天冬氨酸(D)，穀氨酸(E)，組氨酸(H)，天冬醯胺(N)，穀氨醯胺(Q)，精氨酸(R)，絲氨酸
(S)，和蘇氨酸(T)。賴氨酸也是極性胺基酸，但是因為根據本發明賴氨酸被替換而將其排除在外。精氨酸優選地作為極性胺基酸使用。術語「聚こニ醇」(或「PEG」)用在本文中表示包含聚こニ醇作為主要部分的殘基。所述PEG可以包含結合反應必需的其它化學基團；其由分子的化學合成產生；或者其是用於分子各部分距離另ー個的最佳距離的間隔臂。另外，所述PEG可以由連接在一起的ー個或多個PEG側鏈組成。具有多於一條PEG鏈的所述PEG稱為分支的。優選地，PEG具有至少20kDa的總分子量，更優選約20至IOOkDa,並且特別優選20至80kDa的總分子量。PEG優選是分支的。「PEG化的IGF-I變體」用在本文中意指IGF-I變體通過IGF-I變體分子的ー個或兩個賴氨酸的氨基反應性偶聯而共價結合一個或兩個聚こニ醇基團。PEG基團共價連接在IGF-I變體分子的賴氨酸側鏈的伯ε-氨基位點處。進ー步可能的是，PEG化另外發生在N端α -氨基上。由於合成的方法和所用的變體，PEG化的IGF-I變體可以由在Κ65，Κ68和/或Κ27處PEG化，有或無N端PEG化的IGF-I變體的混合物組成，由此在不同分子中PEG化的位點可能不同，或關於每分子聚こニ醇側鏈的量和/或分子中PEG化的位點可以是基本上均質的。優選地，IGF-I變體是單PEG化的。優選的PEG化的IGF-I變體是重組人IGF-I變體的PEG化形式，其特徵在於野生型IGF-I胺基酸序列(SEQ ID NO 1)的下述胺基酸變化K27R 和 K65R(SEQ ID NO 2)；K27R 和 K68R(SEQ ID NO :3)。特別優選具有胺基酸變化K27R和K65R的重組人IGF-I變體(SEQ ID NO 2)的PEG化形式，其特徵在於在K68的單PEG化。還優選上述賴氨酸-PEG化的IGF-I變體和N端PEG化的IGF-I變體的組合物，其中所述IGF-I變體在一級胺基酸序列上相同，並且由於它們帶有在野生型人IGF-I胺基酸序列(SEQ ID NO 1)的胺基酸位置27，65和68處的ー個或兩個胺基酸變化，因此使在位置27，65和68的一個或兩個胺基酸是除賴氨酸外的極性胺基酸。優選地，分子比例為9 I至I : 9 (比例意指賴氨酸-PEG化的IGF-I變體/N端PEG化的IGF-I變體)。更優選的是這樣的組合物，其中摩爾比例是至少I : I (至少ー份賴氨酸-PEG化的IGF-I變體/ ー份N端PEG化的IGF-I變體)，優選至少6 : 4 (至少六份賴氨酸-PEG化的IGF-I變體/四份N端PEG化的IGF-I變體)。優選地，賴氨酸-PEG化的IGF-I變體和N端PEG化的IGF-I變體都是單PEG化的。優選地，在該組合物中，在賴氨酸-PEG化的IGF-I變體和N端PEG化的IGF-I變體中，所述變體是相同的。當按照WO 2008/025528所述的用於生產賴氨酸-PEG化的IGF-I或賴氨酸-PEG化的IGF-I變體(所述變體包含獨立地被另ー種極性胺基酸取代的選自由賴氨酸27，65和/ 或68組成的組的ー個或兩個胺基酸)的步驟時，可獲得SEQ ID NO. 2和3的重組人IGF-I變體的優選的PEG化形式。WO 2008/025528中所述的方法允許製備不帶有N端PEG化的SEQ ID NO. 2和3的重組人IGF-I變體。進ー步優選地，所述PEG化的IGF-I變體是其中至多三個(優選所有三個)N端胺基酸被截短的變體。代表性的野生型突變體命名為Des (1-3) -IGF-I並且缺少N端胺基酸殘基甘氨酸、脯氨酸和穀氨酸(Kummer7A.,等，Int. J. Exp. Diabesity Res. 4(2003)45-57)。術語「PEG化的IGF-I綴合物」用在本文中是指共價結合一個或兩個PEG的IGF-I變體，如關於PEG化的IGF-I變體所述。「單PEG化」用在本文中意指每個IGF-I變體分子僅在ー個賴氨酸處將IGF-I變體PEG化，由此在該位點僅共價連接ー個PEG基團。純的單PEG化的IGF-I變體(無N端PEG化)是至少80%的製劑、優選90%的製劑，最優選地，92%以上的製劑是單PEG化的IGF-I變體，其餘的是，例如，未反應的(未PEG化的)IGF-I和/或N端PEG化的IGF-I變體。因此，本發明的單PEG化的IGF-I變體製劑是足夠均質的，足以表現出均質製劑的優點(例如在製藥應用中)。這同樣適用於ニ PEG化的種類。「基本上均質的」用在本文中意指所生產的、包含的或使用的PEG化的IGF-I變體僅是連接ー個或兩個PEG基團的那些。製劑可以包含少量的未反應的(即，缺少PEG基團)蛋白。如通過肽繪圖(peptide mapping)和N端測序所確定的,ー個下述實例提供這樣的製劑，其是至少90% PEG化的IGF-I綴合物和至多5%未反應的蛋白。所述PEG化的IGF-I變體的均質製劑的分離和純化可以通過常用的純化方法，優選大小排阻層析法進行。當用在本文中時，術語「藥物組合物」(或「組合物」)意指，例如，施用給哺乳動物、例如需要其的人的包含治療有效量的活性藥物成分和藥用賦形劑的混合物或溶液。術語「凍幹的組合物」(或「凍幹組合物」)是指通過將液體組合物凍幹的方法獲得或可通過將液體組合物凍幹的方法獲得的組合物。典型地且優選地，其是具有小於5%、優選小於3%的含水量的固體組合物。用在本文中時，術語「凍幹」是指冷凍物質然後通過升華和/或蒸發將水分濃度減少至不支持生物學或化學反應的水平的過程。用在本文中時，術語「凍乾物」或「凍幹形式」是指通過凍幹法獲得的含水量小於5 %的固體形式的物質或組合物。術語「重建的組合物」在本文中與本發明的組合物聯繫使用時表示通過加入重建介質而重新溶解的凍幹的組合物。所述重建介質包括但不限於，注射用水(WFI)、抑菌注射用水(BWFI)、氯化鈉溶液(例如O. 9% (w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%葡萄糖)、含有表面活性劑的溶液(例如O. 01%聚山梨酯20)、或pH-緩衝溶液(例如，磷酸鹽緩衝溶液)。「活性藥物成分」(或「API 」 )是藥物組合物中生物學活性的物質。術語「藥用賦形劑」是指在配製藥物產品中所用的沒有治療活性且無毒的任意成分，如崩解劑、粘合劑、填充劑、緩衝劑、張カ劑、穩定劑、抗氧化劑、表面活性劑或潤滑劑。按照建立的政府標準，包括美國食品藥物管理局公布的那些標準，對於施用給人，它們通常是安全的。術語「緩衝劑」用在本文中是指穩定藥物製劑的pH的藥用賦形劑。適當的緩衝劑在本領域中是公知的，並且可以在文獻中找到。優選的藥用緩衝劑包括但不限於，組氨酸緩衝劑、檸檬酸鹽緩衝劑、琥珀酸鹽緩衝劑、こ酸鹽緩衝劑和磷酸鹽緩衝劑。最優選的緩衝劑包括檸檬酸鹽、L-組氨酸或L-組氨酸和L-組氨酸鹽酸鹽的混合物。其它優選的緩衝劑是こ酸鹽緩衝劑。不依賴於所用的緩衝劑，PH可以用本領域已知的酸或鹼來調節，例如，用鹽 酸、こ酸、磷酸、硫酸和檸檬酸、氫氧化鈉和氫氧化鉀來調節。術語「張カ劑」用在本文中表示用於調節組合物的張カ的藥用賦形劑。一般地，張カ涉及通常與人血清的滲透壓相關的溶液滲透壓。組合物可以是低滲的、等滲的或高滲的。組合物優選是等滲的。等滲組合物是液體或由固體形式例如由凍幹形式重建的液體，並且表示張カ與其所比較的某種其它溶液(如生理鹽溶液和血清)相同的溶液。適當的張カ劑包括但不限於，胺基酸和糖。優選的張カ劑是海藻糖、蔗糖或精氨酸。「張力」是通過半透膜分離的兩種溶液的滲透壓的量度。滲透壓是為防止水穿過半透膜向內流動而必須向溶液施加的壓力。滲透壓和張カ僅受不能穿過膜的溶質影響，原因在於只有這些表現出滲透壓。能夠自由穿過膜的溶質不影響張力，原因在於它們總是以相同的濃度存在於膜的兩側。在使用張カ劑或穩定劑的情形中，術語「胺基酸」表示具有位於羧酸基團的α -位置的氨基結構部分的藥用有機分子。胺基酸的實例包括精氨酸、甘氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、組氨酸、穀氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、甲硫氨酸、絲氨酸、脯氨酸。在使用張カ劑或穩定劑的情形中，優選的胺基酸是精氨酸。術語「糖」用在本文中表示單糖或寡糖。單糖是不被酸水解的單體碳水化合物，包括單糖及其衍生物，例如，氨基糖。單糖的實例包括葡萄糖、果糖、半乳糖、甘露糖、山梨糖、核糖、脫氧核糖、神經氨酸。寡糖是由通過糖苷鍵連接的多於ー個単體糖單位組成的分支的或一條鏈的碳水化合物。寡糖中的單體糖單位可以是相同的或不同的。取決於單體糖單位的數目，寡糖是ニ糖、三糖、四糖、五糖等的糖。與多糖相反，單糖和寡糖是水溶性的。寡糖的實例包括蔗糖、海藻糖、乳糖、麥芽糖和棉子糖。優選的糖是蔗糖和海藻糖，最優選是海藻糖。術語「表面活性剤」用在本文中表示用來保護蛋白組合物抵抗機械壓カ如攪拌和剪切的藥用賦形劑。藥用表面活性劑的實例包括泊洛沙姆(poloxamers)、聚山梨酷、聚氧こ烯烷基醚(Brij)、烷基苯基聚氧こ烯醚(Triton-X)或十二烷基硫酸鈉(SDS)。優選的表面活性劑是聚山梨酯和泊洛沙姆。當用在本文中時，術語「聚山梨酷」是指典型地與環氧こ烷共聚的山梨醇的油酸酷及其酐。優選的聚山梨酯是聚山梨酯20 (聚(環氧こ烷)(20)失水山梨醇單月桂酸酷，吐溫20)或聚山梨酯80(聚(環氧こ烷)(80)失水山梨醇單月桂酸酷，吐溫80)。
術語「泊洛沙姆」用在本文中是指包含側翼連接兩條聚環氧こ烷(polyethyleneoxide), PE0)親水鏈的一條中心聚環氧丙燒(poly (propylene oxide), PP0)疏水鏈的非離子三嵌段共聚物，每個PPO或PEO鏈可以是不同的分子量。泊洛沙姆還已知為商標名Pluronics。優選的泊洛沙姆是泊洛沙姆188，其是ー種PPO鏈分子量為1800g/mol和PEO含量為80% (w/w)的泊洛沙姆。
術語「抗氧化劑」表示防止活性藥物成分氧化的藥用賦形劑。抗氧化劑包括但不限於，抗壞血酸、穀胱甘肽、半胱氨酸、甲硫氨酸、檸檬酸、EDTA。優選的抗氧化劑是甲硫氨酸。當用在本文中吋，「神經變性病症」意指已經引起或可能引起受試者神經系統的一部分變性的身體狀況，並且包括但不限於，阿爾茨海默病、帕金森病(Parkinson' sdisease)、亨廷頓病(Huntington, s disease)和其它相似的疾病。術語「神經肌肉病症」包括直接(通過內在的肌肉發病機理)或間接的(通過神經發病機理)損壞肌肉功能的疾病。神經肌肉病症的實例包括但不限幹運動神經元病(MND)，如肌萎縮側索硬化ALS(還稱為盧·蓋裡格病(LouGehrig ' s Disease)),脊髓性肌萎縮(SMA), I型脊髓性肌萎縮(SMA1,,德尼西-霍夫曼病(Werdnig-Hoffmann Disease)), 2型脊髓性肌萎縮(SMA2), 3型脊髓性肌萎縮(SMA3,庫-,病(Kugelberg-Welander Disease)),脊髓延髓性肌萎縮(Spinal BulbarMuscular Atrophy, SBMA,還稱為甘迺迪病(Kennedy Disease)和 X-連鎖的 SBMA);或肌肉營養不良症(Muscular Dystrophies, MD)，如迪謝內肌營養不良症(DMD，還稱為假性肥大(Pseudohypertrophic)),貝克爾肌萎縮(Becker Muscular Dystrophy, BMD),埃-德肌營養不良(Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy, EDMD),肢帶肌營養不良(Limb-GirdleMuscular Dystrophy, LGMD),面肩胛肱型肌營養不良(Facioscapulohumeral MuscularDystrophy,FSH或FSHD,還稱為Landouzy-Dejerine),營養不良性肌強直(MMD,還稱為斯坦內特病(Steinert Disease)),眼咽肌營養不良(Oculopharyngeal Muscular Dystrophy,0PMD),遠端肌營養不良(Distal Muscular Dystrophy,DD,Miyoshi),先天性肌營養不良症(Congenital Muscular Dystropny, CMD)。與IGF-I組合物製成藥物產品相聯繫所認識到的一個問題是不合乎需要的多肽聚集並且因此降低穩定性。此外，現有的PEG-IGF-I組合物受損於低溶解性以及增加的粘度，這二者均是用於注射或輸注的藥物組合物高度不需要的作用。因此，這樣獲得的組合物僅產生低濃度的活性藥物成分。因此，存在對於導致提高的分子穩定性、減少的聚集並且甚至在提高的PEG-IGF-I濃度下提供良好的溶解性和可接受的粘度的PEG-IGF-I藥物組合物的需求。按照本發明，該問題通過提供包含IGF-I蛋白、張カ劑和緩衝劑的藥物組合物而解決。已經令人驚訝地發現，將IGF-I蛋白配製在該組合物中在高於冰箱溫度(2-8°C )的溫度下、尤其在室溫(即，低於25°C )和甚至在更高的溫度下(例如40°C )提高其穩定性。這意指該組合物可以不經冷卻而保存延長的時間期間，而不會失去顯著量的活性，且沒有顯著的降解。此外，令人驚訝地，在生理pH下以及在冷凍溫度下，IGF-I蛋白在該組合物中的溶解度可以提高相當多。
另ー個出人意料的作用是減小組合物的總粘度，這允許相當多地増加IGF-I蛋白的濃度。在優選的實施方案中， 緩衝劑是組氨酸、檸檬酸鹽、こ酸鹽或琥珀酸鹽。最優選的緩衝劑是組氨酸或檸檬酸鹽。其它優選的緩衝劑是こ酸鹽緩衝劑。在優選的實施方案中，所述緩衝劑具有5-100mM的濃度。在優選的實施方案中，所述緩衝劑是5-100mM的組氨酸緩衝劑。在優選的實施方案中，所述緩衝劑是5-100mM的檸檬酸鹽緩衝劑。在優選的實施方案中，pH為4. 5-6. 5。甚至更優選的，pH為5. 0-6. O。在優選的實施方案中，所述張カ劑是胺基酸、糖或其組合。在甚至更優選的實施方案中，所述張カ劑是海藻糖、蔗糖或精氨酸或其組合，優選濃度為10-1000mM。最優選地,所述張カ劑是蔗糖、海藻糖或精氨酸。最優選地，所述張カ劑的濃度為50-300mM。在優選的實施方案中，所述藥物組合物還包含表面活性剤。在甚至更優選的實施方案中，所述表面活性劑是聚山梨酯或泊洛沙姆或其組合。優選地，所述表面活性劑濃度為O.001-1 % (w/w)ο在更優選的實施方案中，所述表面活性劑是聚山梨酯20，聚山梨酯80或泊洛沙姆188，優選濃度為 0.001-1% (w/w) ο在更優選的實施方案中，所述表面活性劑是聚山梨酯20，優選濃度為O. 001-0. I % (w/w)，更優選為 O. 01-0. I % (w/w)。在更優選的實施方案中，所述表面活性劑是聚山梨酯80，優選濃度為O. 001-0. I % (w/w)，更優選為 O. 01-0. I % (w/w)。在更優選的實施方案中，所述表面活性劑是泊洛沙姆188，優選濃度為
O.001-0. I % (w/w)，更優選為 O. 01-0. I % (w/w)。在優選的實施方案中，所述藥物組合物進ー步包含抗氧化劑。在甚至更優選的實施方案中，所述抗氧化劑是甲硫氨酸。在優選的實施方案中，所述抗氧化劑濃度為2-50mM。在優選的實施方案中，所述IGF-I蛋白是IGF-I變體，其特徵在於其來源於野生型人IGF-I胺基酸序列(SEQ ID NO 1)並且帶有在胺基酸位置27，65和68處的ー個或兩個胺基酸變化，以使在位置27，65和68的ー個或兩個賴氨酸變為精氨酸。在優選的實施方案中，所述IGF-I蛋白是PEG化的IGF-I綴合物。在甚至更優選的實施方案中，所述PEG化的IGF-I綴合物是在K68處單PEG化的，並且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列(SEQ ID NO 1)的下述胺基酸變化K27R和K65R(SEQ ID NO :2)。在甚至更優選的實施方案中，所述PEG化的IGF-I綴合物是在K65處單PEG化的，並且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列(SEQ ID NO 1)的下述胺基酸變化K27R和K68R(SEQ ID NO 3)。在優選的實施方案中，所述PEG化的IGF-I綴合物的每個PEG具有20_100kDa的
總分子量。在優選的實施方案中，所述PEG化的IGF-I綴合物的每個PEG是分支的PEG。在更優選的實施方案中，所述IGF-I蛋白選自WO 2006/066891或WO 2009/121759中公開的IGF-I分子、變體和PEG化的IGF-I綴合物，WO 2006/066891或WO 2009/121759
通過引用結合在本文中。
在優選的實施方案中，所述IGF-I蛋白以O. l-50mg/ml的濃度存在。甚至更優選的是這樣的實施方案，其中IGF-I蛋白以l-20mg/ml的濃度存在。在優選的實施方案中，所述組合物包含在1-lOOmM、pH 5. 0-6. O的組氨酸緩衝劑中濃度為O. l-10mg/ml的PEG化的IGF-I綴合物，濃度為50_500mM的精氨酸，濃度為O. 001-0. 01 % (w/w)的聚山梨酯20和濃度為5-20mM的甲硫氨酸，所述PEG化的IGF-I綴合物在K68處單PEG化並且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K65R(SEQ ID NO :2)。在另ー個優選的實施方案中，所述組合物包含在5-100mM、pH 5. 0-6. O的組氨酸緩衝劑中濃度為l_20mg/ml的IGF-I蛋白，優選PEG化的IGF-I綴合物，所述綴合物在K68處單PEG化且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K65R (SEQ ID NO:2)，還包含選自下組的張カ劑、任選的表面活性劑和任選的抗氧化劑的組合海藻糖50_500mM ；海藻糖50_500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)；海藻糖50-500mM 和聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. I % (w/w)；海藻糖50-500mM，聚山梨酷80或20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸トIOOmM ；蔗糖50-500mM ；蔗糖50_500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)；蔗糖50-500mM 和聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. I % (w/w)；蔗糖50-500mM，聚山梨酷 80 或 20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸トIOOmM ；精氨酸50_500mM ；精氨酸50-500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)；精氨酸50-500mM 和聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. I % (w/w);和精氨酸50-500mM，聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸 l-lOOmM。在另ー個優選的實施方案中，所述組合物包含在5-100mM、pH 5. 0-6. O的檸檬酸鹽緩衝劑中濃度為l_20mg/ml的IGF-I蛋白，優選PEG化的IGF-I綴合物，所述綴合物在K68處單PEG化且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K65R (SEQ IDNO :2)，還包含選自下組的張カ劑、任選的表面活性劑和任選的抗氧化劑的組合海藻糖50-500mM;海藻糖50_500mM 和泊洛沙姆 188 (O. 001-0. I % (w/w))；海藻糖50-500mM 和聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. I % (w/w)；海藻糖50-500mM，聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸 I-IOOmM ；蔗糖50_500mM ；蔗糖50_500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)；蔗糖50-500mM 和聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. I % (w/w)；蔗糖50-500mM，聚山梨酷 80 或 20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸トIOOmM ； 精氨酸50_500mM ；精氨酸50_500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)；精氨酸50_500mM 和聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. 1% (w/w);和精氨酸50-500mM，聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸 l-lOOmM。
在另ー個優選的實施方案中，所述組合物包含在5-100mM、pH 5. 0-6. O的檸檬酸鹽緩衝劑中濃度為l_20mg/ml的PEG化的IGF-I綴合物，濃度為50_500mM的精氨酸和濃度為O. 001-0. I % (w/w)的泊洛沙姆188，所述PEG化的IGF-I綴合物在K68處單PEG化且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K65R(SEQ ID NO 2)。在另ー個優選的實施方案中，所述組合物包含在10_40mM、pH 5. 0-6. O的由組氨酸或檸檬酸鹽製備的水性緩衝劑中濃度為5-20mg/ml的PEG化的IGF-I綴合物，濃度為100-200mM的海藻糖或蔗糖和濃度為0.01-0.04% (w/w)的聚山梨酯80或20，所述PEG化的IGF-I綴合物在K68處單PEG化且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和 K65R(SEQ ID NO :2)。在優選的實施方案中，所述組合物是液體形式、凍幹形式或由凍幹形式重建的液體形式。在特定的實施方案中，本發明的組合物是凍幹組合物。本發明的凍幹組合物關於更高分子量的顆粒和聚集物的形成具有提高的穩定性的優點，使用相同濃度的液體組合物 通常難以實現這一點。在優選的實施方案中，所述組合物以這樣的方法製備，其中將IGF-I蛋白溶液針對藥物組合物中要用的緩衝劑透析，並且通過濃縮或稀釋調節所需要的蛋白終濃度。在優選的實施方案中，所述組合物用於製備藥物。在更優選的實施法案中，所述組合物用於製備用於治療、預防下述疾病和/或延緩下述疾病的進展的藥物神經變性病症，特別是阿爾茨海默病(AD)，運動神經元病(MND)，特別是肌萎縮側索硬化(ALS)或脊髄性肌萎縮(SM)或肌營養不良症(MD)，特別是迪謝內肌營養不良(DMD)或營養不良性肌強直(MMD)。本發明的組合物特別適用於將IGF-I蛋白儲存在小瓶、預填充的注射器、安瓿、筒
由
寸T O本發明的組合物可以用於在不同溫度下穩定保存IGF-I蛋白，包括冷凍保存、在冷藏條件下或在室溫條件下保存給定的時間期間。本發明的組合物可以腸胃外施用，優選作為靜脈內(i.v.)或皮下(S.C.)推注注射施用，或以任意其他的腸胃外施用方式施用，如以製藥領域已知的那些方式施用。所述組合物可以進一歩通過製藥領域已知的輸注施用。
實施例材料和方法與WO 2006/066891 類似生產 PEG-IGF-I。通過稱重適量可商購獲得的こ酸，隨後用氫氧化鈉調節pH，而製備こ酸鈉緩衝劑。通過稱重適量可商購獲得的檸檬酸，隨後用氫氧化鈉調節pH，而製備檸檬酸鈉緩衝劑。通過稱重適量可商購獲得的琥珀酸，隨後用氫氧化鈉調節pH，而製備琥珀酸鈉緩衝劑。通過稱重適量可商購獲得的L-組氨酸鹽酸-水合物和L-組氨酸鹼，而製備組氨酸緩衝劑。
聚山梨酯20可商購獲得。通過稱重將其稀釋，從而給出高濃度儲液。將該儲液進一步稀釋到藥物組合物中。聚山梨酯80可商購獲得。通過稱重將其稀釋，從而給出高濃度儲液。將該儲液進一步稀釋到藥物組合物中。泊洛沙姆188可商購獲得。通過稱重將其稀釋，從而給出高濃度儲液。將該儲液進ー步稀釋到藥物組合物中。海藻糖ニ水合物可商購獲得。稱重適量的海藻糖ニ水合物，從而給出高濃度儲液。將該儲液進ー步稀釋到藥物組合物中。蔗糖可商購獲得。稱重適量的蔗糖，從而給出高濃度儲液。將該儲液進ー步稀釋到藥物組合物中。 L-精氨酸鹽酸可商購獲得。稱重適量的L-精氨酸鹽酸，從而給出高濃度儲液。將該儲液進ー步稀釋到藥物組合物中。L-甲硫氨酸可商購獲得。稱重適量的L-甲硫氨酸，從而給出高濃度儲液。將該儲液進ー步稀釋到藥物組合物中。壓カ測試的條件通過在水平搖床上以200rpm在2-8°C搖動I周並且通過在25°C搖動I周而使藥物組合物受到機械壓力。通過分別在_20°C和2-8°C或-80°C和2-8°C反覆冷凍和解凍(5個循環)而使藥物組合物受到凍融壓力。通過多種分析技術分析壓迫的樣品，所述分析技術包括可見顆粒、顯微可見顆粒的視覺檢查、濁度、pH、重量克分子滲透壓濃度、通過UV/VIS光譜法測量蛋白濃度、粘度、反相HPLC(RP-HPLC)、大小排阻層析(SEC)、卡爾-費歇爾滴定法(Karl-Fischer titration)(僅是凍乾物)、NMR 波譜法、FT-IR 光譜法和 μ DSC。穩定性檢測通過將藥物組合物在_80°C，-20°C，2_8°C，25°C和40°C儲存至多8個月而檢測其穩定性。在確定的時間點，將樣品從穩定性室中取出，並且通過多種分析技術進行分析，所述分析技術包括視覺檢查可見顆粒、顯微可見顆粒(sub visible particles)、池度、pH、重量克分子滲透壓濃度、通過UV/VIS光譜法測量蛋白濃度、粘度、反相HPLC(RP-HPLC)、大小排阻層析(SEC)、卡爾-費歇爾滴定法(僅是凍乾物)、NMR波譜法、FT-IR光譜法和μ DSC。進行大小排阻層析(SEC)來檢測和定量組合物中的單PEG化的IGF-I綴合物(主峰)、以及可溶的高分子量種類(HMW)和低分子量水解產物(LMW)。HMW種類定義為在主峰之前洗脫下來的峰，而LMW種類在主峰之後洗脫下來。實施例I-製備液體組合物本發明所述的用於靜脈內和皮下施用的液體組合物按下述製備將PEG化的IGF-I綴合物進行緩衝劑交換並且濃縮至適當的蛋白濃度。隨後加入賦形劑作為儲液。將得到的藥物組合物無菌過濾並且在無菌條件下填裝到無菌玻璃小瓶中，將小瓶用橡皮塞和鋁帽封閉。對所有樣品進行視覺檢查並且以倒置方位放置在氣候室中。實施例2-製備凍幹的組合物本發明所述的用於靜脈內和皮下施用的凍幹組合物按下述製備將PEG化的IGF-I綴合物進行緩衝劑交換並且濃縮至適當的蛋白濃度。隨後加入賦形劑作為儲液。將得到的藥物組合物無菌過濾並且在無菌條件下填裝到無菌玻璃小瓶中。凍幹後，將小瓶用鋁帽封閉，並且放置在氣候室中。實施例3-各種緩衝體系的穩定性按照實施例I製備組合物，所述組合物包含lmg/ml PEG化的IGF-I綴合物和20mM不同pH值的緩衝劑，所述PEG化的IGF-I綴合物在K68處單PEG化，並且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K65R(SEQ ID NO :2)。在40°C保存4周(4w)後的穩定性數據顯示在表I中。在儲存過程中，與初始值相比，高分子量種類(HMW)的増加指示PEG化的IGF-I綴合物的聚集，而在儲存過程中，與初始值相比，低分子量種類(LMW)的增加指示PEG化的IGF-I綴合物的降解，例如，通過裂解分支的PEG側鏈降解。 緩衝劑Zi酸鈉檸檬酸鈉組氨酸/組氨酸鹽酸
pH4.5 5.0 5 5 5.05.55.56.0
初始
0.7 0.7 0.7 0.70.70.7O 8
HMW |%|
初始
0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
LMW [%|
/l:40°C4Mj 的
HMW 1%J 5 9 2 3 1 5 1 01 01 01 1
Yi 40-C4L2 O0ο.Ο0.00.0表I.通過SEC確定的依賴於緩衝劑的API濃度為lmg/ml的各種組合物的穩定性。按照實施例I製備其它的組合物，所述組合物包含8mg/ml PEG化的IGF-I綴合物和20mM不同pH值的緩衝劑，所述PEG化的IGF-I綴合物在K68處單PEG化，並且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K65R(SEQ ID NO :2)。在40°C保存7周(7w)後的穩定性數據顯示在表2中。在儲存過程中，與初始值相比，高分子量種類(HMW)的増加指示PEG化的IGF-I綴合物的聚集，而在儲存過程中，與初始值相比，低分子量種類(LMW)的增加指示PEG化的IGF-I綴合物的降解，例如，通過裂解分支的PEG側鏈降解。
權利要求
1.ー種藥物組合物，其包含IGF-I蛋白、張カ劑和緩衝劑。
2.權利要求I的藥物組合物，其中所述緩衝劑是組氨酸、檸檬酸鹽、こ酸鹽或琥珀酸鹽緩衝劑，並且其中PH為4. 5-6. 5。
3.根據權利要求I至2中任一項所述的藥物組合物，其中pH為5.0-6. O。
4.根據權利要求I至3中任一項所述的藥物組合物，其中所述緩衝劑為5-100mM的檸檬酸鹽緩衝劑。
5.根據權利要求I至3中任一項所述的藥物組合物，其中所述緩衝劑為5-100mM的組氨酸緩衝劑。
6.根據權利要求I至5中任一項所述的藥物組合物，其中所述張カ劑是胺基酸、糖或其組合。
7.根據權利要求I至6中任一項所述的藥物組合物，其中所述張カ劑是濃度為IO-IOOOmM的海藻糖、蔗糖或精氨酸或其組合。
8.根據權利要求I至7中任一項所述的藥物組合物，其中所述張カ劑是濃度為50-300mM的精氨酸。
9.根據權利要求I至8中任一項所述的藥物組合物，其還包含表面活性剤。
10.根據權利要求9的藥物組合物，其中所述表面活性劑是聚山梨酯或泊洛沙姆或其組合。
11.根據權利要求9至10中任一項所述的藥物組合物，其中所述表面活性劑是濃度為O. 001-1% (w/w)的聚山梨酯20、聚山梨酯80或泊洛沙姆188。
12.根據權利要求I至11中任一項所述的藥物組合物，其還包含抗氧化劑。
13.權利要求11的藥物組合物，其中所述抗氧化劑是濃度為l_50mM的甲硫氨酸。
14.根據權利要求I至13中任一項所述的藥物組合物，其中所述IGF-I蛋白是IGF-I變體，其特徵在於，其來源於野生型人IGF-I胺基酸序列(SEQ ID NO 1)並且帶有在胺基酸位置27，65和68的ー個或兩個胺基酸變化，以使在位置27，65和68的一個或兩個賴氨酸為精氨酸。
15.根據權利要求I至14中任一項所述的藥物組合物，其中所述IGF-I蛋白是PEG化的IGF-I綴合物。
16.權利要求15的藥物組合物，其中所述PEG化的IGF-I綴合物是在K68處單PEG化的，並且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K65R(SEQ ID NO :2)。
17.權利要求15的藥物組合物，其中所述PEG化的IGF-I綴合物是在K65處單PEG化的，並且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K68R(SEQ ID NO :3)。
18.根據權利要求15至17中任一項所述的藥物組合物，其中所述PEG化的IGF-I綴合物的每個PEG具有20至IOOkDa的總分子量。
19.根據權利要求15至18中任一項所述的藥物組合物，其中所述PEG化的IGF-I綴合物的每個PEG是分支的PEG。
20.根據權利要求I至19中任一項所述的藥物組合物，其中所述IGF-I蛋白以O.I至50mg/ml的濃度存在。
21.根據權利要求I至20中任一項所述的藥物組合物，其中所述IGF-I蛋白以I至20mg/ml的濃度存在。
22.根據權利要求I至21中任一項所述的藥物組合物，其中粘度低於40mPa· S。
23.根據權利要求I至22中任一項所述的藥物組合物，所述組合物包含在5-100mM、pH·5. 0-6. O的組氨酸緩衝劑中濃度為O. l-10mg/ml的PEG化的IGF-I綴合物，濃度為50_500mM的精氨酸、濃度為0.001-0.01% (w/w)的聚山梨酯20和濃度為I-IOOmM的甲硫氨酸，所述PEG化的IGF-I綴合物在K68處單PEG化且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化 K27R 和 K65R(SEQ ID NO :2)。
24.根據權利要求I至22中任一項所述的藥物組合物，所述組合物包含在5-100mM、pH·5. 0-6. O的組氨酸緩衝劑中濃度為l_20mg/ml的PEG化的IGF-I綴合物，所述綴合物在K68處單PEG化且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K65R (SEQ ID NO:2)，還包含選自下組的張カ劑、任選的表面活性劑和任選的抗氧化劑的組合 海藻糖50-500mM ； 海藻糖 50-500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)； 海藻糖 50-500mM 和聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. 1% (w/w)； 海藻糖50-500mM，聚山梨酷80或20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸I-IOOmM ；蔗糖 50-500mM ； 蔗糖 50-500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)； 蔗糖 50-500mM 和聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. 1% (w/w)； 蔗糖50-500mM，聚山梨酷80或20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸I-IOOmM ； 精氨酸50-500mM ； 精氨酸 50-500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)； 精氨酸50-500mM和聚山梨酯80或20 O. 001-0. 1% (w/w);和 精氨酸50-500mM，聚山梨酷80或20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸I-IOOmM0
25.根據權利要求I至22中任一項所述的藥物組合物，所述組合物包含在5-100mM、pH·5. 0-6. O的檸檬酸鹽緩衝劑中濃度為l_20mg/ml的PEG化的IGF-I綴合物，所述PEG化的IGF-I綴合物在K68處單PEG化且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K65R(SEQ ID NO :2)，還包含選自下組的張カ劑、任選的表面活性劑和任選的抗氧化劑的組合 海藻糖50-500mM ； 海藻糖 50-500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)； 海藻糖 50-500mM 和聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. 1% (w/w)； 海藻糖50-500mM，聚山梨酷80或20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸I-IOOmM ；蔗糖 50-500mM ； 蔗糖 50-500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)； 蔗糖 50-500mM 和聚山梨酯 80 或 20 O. 001-0. 1% (w/w)； 蔗糖50-500mM，聚山梨酷80或20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸I-IOOmM ； 精氨酸50-500mM ； 精氨酸 50-500mM 和泊洛沙姆 188 O. 001-0. 1% (w/w)； 精氨酸50-500mM和聚山梨酯80或20 O. 001-0. 1% (w/w);和 精氨酸50-500mM，聚山梨酷80或20 O. 001-0. 1% (w/w)和甲硫氨酸I-IOOmM0
26.根據權利要求I至22中任一項所述的藥物組合物，所述組合物包含在5-100mM、pH5. 0-6. O的檸檬酸鹽緩衝劑中濃度為l_20mg/ml的PEG化的IGF-I綴合物，濃度為50_500mM的精氨酸和濃度為O. 001-0. 1% (w/w)的泊洛沙姆188，所述PEG化的IGF-I綴合物在K68處單PEG化且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和K65R (SEQ ID NO:2)。
27.根據權利要求I至22中任一項所述的藥物組合物，所述組合物包含在10-40mM、pH5. 0-6. O的組氨酸或檸檬酸鹽緩衝劑中濃度為5-20mg/ml的PEG化的IGF-I綴合物，濃度為100-200mM的海藻糖或蔗糖和濃度為O. 01-0. 04% (w/w)的聚山梨酯80或20，所述PEG化的IGF-I綴合物在K68處單PEG化且特徵在於野生型人IGF-I胺基酸序列的胺基酸變化K27R和 K65R(SEQ ID NO :2)。
28.根據權利要求I至27中任一項所述的藥物組合物，其是液體形式，是凍幹的組合物或是重建的組合物。
29.根據權利要求I至28中任一項所述的藥物組合物，其可以腸胃外施用，優選作為靜脈內α·ν·)或皮下(s.c.)推注注射施用。
30.用於製備權利要求I至29中任一項所述的藥物組合物的方法，其中將IGF-I蛋白的溶液針對要在所述藥物組合物中使用的緩衝劑透析，並且通過濃縮或稀釋調整所需要的終蛋白濃度。
31.權利要求I至30中任一項所述的藥物組合物在製備用於治療、預防下述疾病和/或延緩下述疾病的進展的藥物中的應用神經變性病症，特別是阿爾茨海默病(AD)，運動神經元病(MND)，特別是肌萎縮側索硬化(ALS)或脊髄性肌萎縮(SMA)或肌營養不良症(MD)，特別是迪謝內肌營養不良(DMD)或營養不良性肌強直(MMD)。
32.前文所述的發明。
全文摘要
本發明涉及一種包含作為活性藥物成分(API)的胰島素樣生長因子I(IGF-I)蛋白、張力劑和緩衝劑的藥物組合物。該組合物可以作為注射劑或輸注劑施用，並且特別有效地用於治療、預防下述疾病和/或延緩下述疾病的進展神經變性病症，特別是阿爾茨海默病(AD)，運動神經元病(MND)，特別是肌萎縮側索硬化(ALS)或脊髓性肌萎縮(SMA)或肌營養不良症(MD)，特別是迪謝內肌營養不良(DMD)或營養不良性肌強直(MMD)。
文檔編號A61K9/00GK102665682SQ201080058206
公開日2012年9月12日 申請日期2010年12月20日 優先權日2009年12月23日
發明者漢斯-克裡斯蒂·馬勒, 阿斯特麗德·帕彭伯格 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司