一種β諾達病毒基因組全序列及其克隆方法

2023-05-22 19:41:01 3

專利名稱：一種β諾達病毒基因組全序列及其克隆方法
一種β諾達病毒基因組全序列及其克隆方法
本專利申請由天津師範大學生命科學學院/細胞遺傳與分子調控天津市重點實驗室完成，得到國家自然科學基金(30901094)，天津市科技計劃(09JCYBJC15000)，天津市教委基金(20080618)以及國家科技支撐計劃(2011BAD13B07，201IBAD13Β04)的資助。技術領域
本發明屬於應用生物技術領域，涉及β諾達病毒檢測方面的應用。更具體的說是一種β諾達病毒基因組全序列及其克隆方法。
背景技術：
病毒性神經壞死病(Viral nervous necrosis,VNN)又稱病毒性腦病和視網膜病 (Viral encephalopathy and retinopathy)，流行於除美洲和非洲外幾乎世界所有地區的海水魚類，對仔魚和幼魚危害很大，嚴重者在一周內死亡率可達100%，且近年受感染的魚類種類和受危害程度迅速增加。病魚表現厭食，上浮於水面，表現螺旋狀或旋轉遊動，或腹部朝上漂浮於水面，難於下沉，病魚腹部腫大，有的鰾腫大充血，外觀無其它明顯病變。組織學檢查可見中樞神經組織腦細胞和視網膜細胞空泡化。該病的病原屬諾達病毒科。
魚類病毒性神經壞死病是近年來嚴重危害海水魚類，引起暴發性流行的重大病害之一。目前，已知受神經壞死病毒感染的魚類達40多種。該病毒包括4種血清型，即紅鰭東方飩神經壞死病毒、擬鰺神經壞死病毒、條斑星鰈神經壞死病毒、赤點石斑魚神經壞死病毒。患病魚常表現出遊泳異常，身體失去平衡等典型神經性疾病症狀，病理組織學觀察可見中樞神經系統特別是腦和視網膜出現嚴重的壞死、空泡化。病毒可通過垂直和水平兩種途徑傳播。
諾達病毒科只有一個屬。本屬內的諾達病毒首次分離於日本的Nodamura村，因而得名。過去也將其稱為野田村病毒。病毒的基因組由兩分子的ssRNA組成，分子量為 1. IX IOfiDa和0.48 X IOf5Datl兩個分子在5 『端都有一個帽，而;T端無多聚㈧尾。病毒在細胞漿中複製，放線菌素D不影響病毒RNA的合成。感染細胞中有3種病毒RNA，即RNAl (分子量IX I(^Da)、RNA2(分子量0. 5X106Da)和一個亞基因RNA3(分子量0. 15X IO6Da )。RNAl編碼蛋白A(分子量112X IO3Da)，後者可能是病毒RNA聚合酶的成份；RNA2編碼衣殼蛋白的前身即α蛋白；RNA3編碼蛋白B (分子量IOX IO3Da),可能在合成正鏈RNA過程中起作用。用分離的RNAl感染細胞，能合成RNAl和RNA3，但不能合成RNA2。RNAl和RNA2 均是形成病毒粒子所必須的。諾達病毒在細胞中的增殖力很低，但它能在34°C的低溫條件下，通過病毒RNA對細胞的轉染而傳代培養。
此病毒於1989年發現，1990年首次報導。此後，在世界各地相繼有3目8科15種海水養殖魚類發生過此病。幼魚期病魚可出現螺旋式垂直遊動，死亡率較仔魚期低。組織學檢查可見腦細胞和視網膜因細胞壞死和毀壞形成的空胞。電鏡觀察可見細胞質內球形病毒粒子，直徑25 30 nm,病毒基因由兩段單鏈RNA組成，RNAl編碼非結構蛋白，RNA2編碼一種主要的結構蛋白。
目前，對於諾達病毒基因複製和蛋白成熟過程，科學家們已經有了較多的了解，但快速診斷技術尚不完備，常用的診斷方法例如行為體色觀察、組織病理檢查、RT-PCR法檢測病毒衣殼蛋白基因、原位雜交法檢測病毒核酸在組織中的分布、免疫學方法等。

發明內容
一種β諾達病毒全基因組序列，其特徵在於該病毒基因組由兩條不等長RNA組成，RNAl節段全長3104個核苷酸，5，UTR和3，UTR分別由78和77個核苷酸組成，ORF區含有四49個鹼基，編碼病毒自身的RNA依賴的RNA聚合酶，在其編碼區內部嵌套有另一重疊閱讀框(位置27534980 nt)，編碼非結構蛋白B2，序列為SEQ ID No. 1所示；RNA2節段長度為1433個核苷酸，5，UTR和3，UTR分別由沈和390個核苷酸組成，ORF區含有1017 個核苷酸，序列為SEQ ID No. 2所示。本發明所述β諾達病毒基因組全序列，其中β諾達病毒基因組RNAl節段編碼長度為982個胺基酸，其序列如SEQ ID No. 3所示。本發明所述β諾達病毒基因組全序列，其中β諾達病毒全基因組RNAl節段嵌套的Β2蛋白長度為75個胺基酸，其序列如SEQ ID No. 4所示。本發明所述β諾達病毒基因組全序列，其中β諾達病毒基因組RNA2節段編碼長度為338個胺基酸，其序列如SEQ ID No. 5所示。本發明主要完成了如下的內容
1. β諾達病毒基因組全序列的確認
本發明的方法採用長距離逆轉錄酶和長距離高保真聚合酶，依據RT-PCR原理擴增出一種β諾達病毒基因組兩條RNA的全長cDNA，將擴增產物克隆到T載體進行測序比對分析，獲得具有正確鹼基序列的克隆。2. β諾達病毒基因組全序列的製備方法(具體見實施例1) 包括RNA抽提，cDNA合成，基因組擴增，擴增產物測序及比對分析 3. β諾達病毒基因組全序列的用途
β諾達病毒基因組全序列確定後，可根據該基因組的序列進行β諾達病毒的分子檢測(具體見實施例2)。4. β諾達病毒基因組全序列編碼胺基酸序列的用途
β諾達病毒基因組全序列編碼的胺基酸序列確定後，可根據該序列製備β諾達病毒相關蛋白的抗體(具體見實施例3)。


圖1擴增RNAl節段全序列的結果；Μ: DNA分子量標記DL2000 ；1 對照；2 =RNAl擴增產物；
圖2擴增RNA2節段全序列的結果；Μ: DNA分子量標記DL2000 ；1 對照；2 :RNA2擴增產物。
具體實施例方式
下面結合實施例說明本發明，這裡所述實施例的方案，不限制本發明，本領域的專業人員按照本發明的精神可以對其進行改進和變化，所述的這些改進和變化都應視為在本發明的範圍內，本發明的範圍和實質由權利要求來限定。特別加以說明的是，本發明使用的試劑材料均有市售；其中大腸桿菌(DH5ci )購於購自天根生化公司；牙鮃幼苗由天津海發珍品養殖中心提供。
實施例1β諾達病毒基因組全序列的製備 1. RNA抽提I；將牙鮃置於預冷的解剖盤上，用經180°C烘烤8個小時的剪刀和鑷子解剖，將其腦部組織迅速轉移到無RNase的1. 5mL離心管中，加入ImL Trizol於冰浴中充分勻漿，室溫靜置 5min,於 4°C條件下 12000rpm 離心 IOmin ；②取①上清到一支新的1.5mL離心管中，加入200 μ L氯仿振蕩15s，之後靜置^iin ；③將上述②中的液體於4°C下，12000rpm離心15min後取無色上清；④向上述③中上清加入500μ L異丙醇將管中液體輕輕混勻，室溫靜置15min，沉澱RNA ；⑤將上述④溶液於4°C，12000rpm離心lOmin，棄上清；⑥向上述⑤中沉澱加入ImL75%乙醇，輕輕洗滌。之後4°C，7500rpm離心6min，棄上清；⑦將上述⑥中沉澱晾乾，加入適量的H2O溶解(65°C促溶10-15min)，然後置於-80°C保存。
2. cDNA 合成 RNA變性
權利要求
1.一種β諾達病毒基因組全序列，其特徵在於該病毒基因組由兩條不等長RNA組成，RNAl節段全長3104個核苷酸，5，UTR和3，UTR分別由78和77個核苷酸組成，ORF區含有四49個鹼基，編碼病毒自身的RNA依賴的RNA聚合酶，在其編碼區內部嵌套有另一重疊閱讀框，位置2753-^80 nt，編碼非結構蛋白B2，序列為SEQ ID No. 1所示；RNA2節段長度為1433個核苷酸，5，UTR和3，UTR分別由沈和390個核苷酸組成，ORF區含有1017 個核苷酸，序列為SEQ ID No. 2所示。
2.權利要求1所述β諾達病毒基因組全序列，其中β諾達病毒基因組RNAl節段編碼長度為982個胺基酸，其序列如SEQ ID No. 3所示。
3.權利要求1所述β諾達病毒基因組全序列，其中β諾達病毒全基因組RNAl節段嵌套的Β2蛋白長度為75個胺基酸，其序列如SEQ ID No. 4所示。
4.權利要求1所述β諾達病毒基因組全序列，其中β諾達病毒基因組RNA2節段編碼長度為338個胺基酸，其序列如SEQ ID No. 5所示。
5.權利要求1所述的β諾達病毒基因組全序列在製備β諾達病毒蛋白抗體方面的應用。
全文摘要
本發明公開了一種β諾達病毒基因組全序列及其克隆方法，該方法採用長距離逆轉錄酶和長距離高保真聚合酶，依據RT-PCR原理擴增一種β諾達病毒基因組兩條RNA的全長cDNA，將擴增產物克隆到T載體進行測序比對分析，獲得具有正確鹼基序列的克隆。本發明有利於設計病毒檢測方法，了解病毒的分類、致病性及分子流行病學等，也能通過人工改造將其作為基因轉移載體使用。
文檔編號C12N15/40GK102492702SQ20111040775
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月9日 優先權日2011年12月9日
發明者劉逸塵, 孫金生, 張亦陳, 杜宏薇, 耿緒雲, 顧中華 申請人:天津師範大學