造血幹細胞及其治療新生血管性眼疾的方法

2023-05-22 21:27:46

專利名稱：造血幹細胞及其治療新生血管性眼疾的方法
技術領域：
本發明涉及來源於骨髓的分離的、哺乳動物的、譜系陰性的造血幹細胞(Lin-HSC)及其應用。更特別地，本發明涉及含有內皮祖細胞(EPC)的分離的、哺乳動物的、譜系陰性的造血幹細胞(Lin-HSC)群。本發明還涉及通過施用Lin-HSC與轉染的Lin-HSC群至眼部來治療眼血管疾病。
背景技術：
遺傳性視網膜變性影響了多達1/3500的人，其特徵是進行性夜盲、視野缺損、視神經萎縮、小動脈變細、血管透性改變及通常會發展為全盲的視野中心缺損(Heckenlively，J.R.，editor，1988；RetinitisPigmentosa，PhiladelphiaJB Lippincott Co.)。這些疾病的分子遺傳學分析在超過110種不同的基因中識別出突變，但這些基因僅能對已知受疾病困擾的個體中相對較小比例做出解釋(Humphries等.，1992，Science 256804-808；Farrar等.2002，EMBO J.21857-864.)。這些突變中很多都與包括視紫紅質、cGMP磷酸二酯酶、rds外周蛋白及RPE65在內的光轉導系統中的酶與結構組分相聯繫。儘管具有這些觀察資料，但仍沒有減緩或逆轉這些視網膜變性疾病進一步發展的有效治療手段。在將野生型的轉基因傳遞到攜帶特定突變的動物光感受器或視網膜色素上皮(RPE)時，基因治療上的新進展已實現了小鼠中rds(Ali等.2000，Nat.Genet.25306-310)及rd(Takahashi等.1999，J.Virol.737812-7816)表型與狗中RPE65表型(Acland等.2001，Nat.Genet.2892-95)的成功逆轉。
年齡相關性黃斑變性(ARMD)與糖尿病視網膜病變(DR)是工業化國家中視力損害的主要原因，它們由異常的視網膜新生血管導致。由於視網膜由各層結構清晰的神經元、神經膠質與血管這些元件組成，因此諸如血管增生或水腫這樣相對微小的紊亂都會導致視覺功能的顯著喪失。遺傳性視網膜變性，例如色素性視網膜炎(RP)，也與諸如動脈狹窄及血管萎縮之類的血管異常相關。雖然在確定那些促進及抑制血管新生的因子方面已取得了顯著進展，但目前仍沒有專門治療眼血管疾病的有效治療手段。
多年來已知在正常成人循環系統與骨髓中存在一個幹細胞群。這些細胞可按照造血譜系陽性(Lin+)或譜系陰性(Lin-)兩個譜系區分為不同的亞群。此外，近來表明譜系陰性的造血幹細胞(HSC)群體含有能夠在體外和體內形成血管的內皮祖細胞(EPC)(參見Asahara等.1997，Science 275964-7)。這些細胞能夠參與正常的和病理的出生後血管新生(參見Lyden等.2001Nat.Med.7，1194-201；Kalka等.2000，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.973422-7；及Kocher等.2001，Nat.Med.7430-6)並分化成包括肝細胞(參見Lagasse等.2000，Nat.Med.61229-34)、小膠質細胞(參見Priller等.2002Nat.Med.71356-61)、心肌細胞(參見Orlic等.2001，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9810344-9)及上皮細胞(參見Lyden等.2001，Nat.Med.71194-1201)在內的多種非內皮細胞類型。儘管這些細胞已經應用在血管新生的數個實驗模型中，但EPC作用於新生血管的機制仍不清楚，尚無法確定能夠有效增加針對特定血管的細胞數目的策略。
來源於骨髓的造血幹細胞是目前唯一一種普遍用於治療用途的幹細胞。骨髓HSC在移植上已經應用了40多年。目前，正在研究可獲得純化的幹細胞的先進方法以發展出針對白血病、淋巴瘤及遺傳性血液疾病的治療手段。已在有限數目的患者中進行了幹細胞在人體中臨床糖尿病及晚期腎癌治療方面的應用的研究。
發明概述本發明提供了分離的、哺乳動物的、不在細胞表面表達譜系表面抗原(Lin)的造血幹細胞(HSCs)群，即譜系陰性的造血幹細胞(Lin-HSCs)。本發明的Lin-HSC群含有內皮祖細胞(EPC)，也稱內皮前體細胞，可以在經玻璃體內注射至眼中後選擇性地作用於活化的視網膜星形膠質細胞。本發明的Lin-HSCs優選地來源於成體哺乳動物骨髓，更優選地來源於成人骨髓。
在一個優選的實施方案中，本發明的Lin-HSC群通過抽取一隻成體哺乳動物的骨髓、從骨髓中分離多種單核細胞、使用針對一個或多個譜系表面抗原的生物素偶聯的譜系群體抗體標記這些單核細胞，除去譜系表面抗原陽性的單核細胞然後回收含EPCs的Lin-HSCs群的方式，來進行分離。優選地，單核細胞使用針對選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR及CD235a(血型糖蛋白A)的一種或多種譜系表面抗原的生物素偶聯的譜系群體抗體來標記。優選地，本發明分離的Lin-HSC群中至少約20％的細胞表達表面抗原CD31。
本發明Lin-HSC群中的EPC′s廣泛地整合到發育中的視網膜血管中，並持續穩定地整合至眼新生血管。使用本發明分離的Lin-HSC群可在哺乳動物中恢復並穩定變性中的視網膜血管，從而拯救神經元網絡，進而推動缺血組織的修復。
在一個優選的實施方案中，分離的Lin-HSC群中的細胞使用治療上有用的基因進行轉染。例如，細胞可使用能編碼選擇性作用於新生血管並抑制新血管形成、卻不影響已存在血管的神經營養劑或者抗血管新生試劑的多聚核苷酸，通過一種基於細胞的基因治療方式來進行轉染。在一個實施方案中，本發明分離的Lin-HSC群含有一種編碼血管新生抑制肽的基因。血管新生抑制的Lin-HSCs在調節諸如ARMD、DR及與異常血管相關聯的某些視網膜變性疾病中的異常血管生長方面具有功效。在另一個實施方案中，本發明分離的Lin-HSC群含有編碼神經營養肽的基因。神經營養的Lin-HSCs在包括諸如青光眼、視網膜色素變性及其它類似與視神經變性相關的眼疾中的促進神經元修複方面具有功效。
使用本發明分離的Lin-HSC群治療眼疾的一個特殊優點，是在使用Lin-HSCs進行玻璃體內治療的眼中觀察到血管營養與神經營養的修復效果。在使用本發明分離的Lin-HSCs處理過的眼中，視網膜神經元及光感受器得到保護，視覺功能也得以維持。本發明提供了一種包括施用從骨髓中分離的Lin-HSC細胞來治療視網膜變性的方法，該Lin-HSC細胞含有能選擇性作用於活化的視網膜星形膠質細胞的內皮祖細胞，其中至少50％的分離的Lin-HSCs表達表面抗原CD31並且至少50％的分離的Lin-HSCs表達表面抗原CD 117(c-kit)。
本發明還提供一種從成體哺乳動物骨髓中，優選地是從成人骨髓中分離含內皮祖細胞的譜系陰性造血幹細胞群的方法。此外，可以從用於視網膜血管再生或修復性治療以及用於治療或改善視網膜神經組織變性的人Lin-HSCs中獲得遺傳上一致的細胞系(即無性繁殖系)。
附圖的簡要描述

圖1(a與b)描述的是小鼠視網膜發育示意圖。(a)原發叢的發育。(b)視網膜血管形成的第二階段。GCL，節細胞層；IPL，內網層；INL；內核層；OPL，外網層；ONL，外核層；RPE，視網膜色素上皮；ON，視神經；P，外周部。
圖1c描述的是來源於骨髓的Lin+HSC與Lin-HSC分離細胞的流式細胞儀特徵圖。頂行非抗體標記細胞的二維點圖分布，其中R1表示陽性PE-染色可定量的區域；R2表示GFP-陽性；中間行Lin-HSC(C57B/6)與底行Lin+HSC(C57B/6)細胞，每個細胞系使用針對Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-聯接抗體進行標記。Tie-2數據由Tie-2-GFP小鼠中獲得。百分比表示在整個Lin-HSC與Lin+HSC群中陽性標記細胞的百分數。
圖2描述的是Lin-HSCs進入發育中的小鼠視網膜的植入過程。(a)在注射4天後(P6)玻璃體內注射的eGFP+Lin-HSC細胞在視網膜上附著並分化(b)Lin-HSC(B6.129S7-Gtrosa26小鼠，使用β-抗體染色)在使用膠原蛋白IV抗體染色的血管(星號表示血管頂端)前面定植。(c)在注射後4天(P6)絕大多數Lin+HSC細胞(eGFP+)不能分化。(d)注射後4天(P6)腸繫膜eGFP+鼠的EC。(e)注射入成體小鼠眼中的Lin-HSCs(eGFP+)。(f)在GFAP-GFP轉基因小鼠中定位並沿著已存在的星型膠質細胞模板分化的eGFP+Lin-HSCs(箭頭處)的低倍放大。(g)Lin-細胞(eGFP)與其下面的星型膠質細胞(箭頭處)之間聯接的較高倍數放大。(h)沒有注射GFAP-GFP轉基因的對照。(i)注射後4天(P6)，eGFP+Lin-HSCs遷至更深處的神經叢區域並在此進行分化。左圖在一個視網膜全樣載片中記錄到Lin-HSC活性；右圖表示的是視網膜中(頂部是玻璃體一側，底部是鞏膜一側)Lin-細胞(箭頭處)的位置。(j)使用α-CD31-PE及α-GFP-alexa 488抗體進行雙標記。注射後7天，所注射的Lin-HSC(eGFP，紅色)整合到血管中(CD31)。箭頭指明整合區域。(k)eGFP+Lin-HSC細胞在注射後14天(P17)形成血管。(l與m)心內注射羅丹明-葡聚糖表明該血管完整無缺，在原發叢(l)與深處的血管叢(m)中均有功能。
圖3(a與b)表示的是eGFP+Lin-HSC細胞定位在成熟視網膜中由雷射(a)與機械(b)損傷(星號表明損傷位點)所誘導的神經膠質增生部位(由表達GFAP的星型膠質細胞表示，最左圖)。最右圖是一幅較高倍數放大圖，表示的是Lin-HSCs與星型膠質細胞的緊密聯繫。刻度尺＝20μM。
圖4顯示的是Lin-HSC細胞修復視網膜變性小鼠的血管。(a-d)注射後27天(P33)使用膠原蛋白IV染色的視網膜；(a)與(b)，使用Lin+HSC細胞(Balb/c)注射的視網膜與普通FVB小鼠在血管系統沒有表現出差異；(c)與(d)使用Lin-HSCs細胞(Balb/c)注射的視網膜表現出與野生型小鼠同源的豐富的血管網絡；(a)與(c)使用DAPI染色的完整視網膜(頂部是玻璃體一側，底部是鞏膜一側)的冰凍切片；(b)與(d)視網膜所有數量的深層血管叢；(e)以圖例說明在注射了Lin-HSC細胞的視網膜中，形成深層血管叢的血管分布有所增加的條線圖(n＝6)。深層視網膜血管形成的程度通過計算每幅圖像中血管的總長度來定量。比較了Lin-HSC、Lin+HSC或者對照的視網膜中血管平均總長度/高倍視野(以微米為單位)。(f)使用來源於rd/rd小鼠的Lin-HSC細胞(R，右眼)或者Lin+HSC細胞(L，左眼)進行注射後深層血管叢長度的比較。給出了6隻無關係的小鼠的結果(一種顏色代表一種小鼠)。(g)與(h)Lin-HSC細胞(Balb/c)在注射至P15眼中時還修復了rd/rd血管。給出了注射至視網膜的Lin-HSC細胞(G)或者Lin+HSC細胞(H)的中間及深層血管叢。
圖5描述的是小鼠視網膜組織的顯微照片。(a)視網膜全樣載片(rd/rd小鼠)的深層，使用eGFP+Lin-HSCs注射後五天(P11)可見(灰色部分)。(b)與(c)於P6時接受Balb/c Lin-細胞(b)或者Lin+HSC細胞(c)注射的Tie-2-GFP(rd/rd)小鼠的P60時刻視網膜血管。在(b)和(c)的左圖中只有內源內皮細胞(GFP-染色)是可見的。(b)和(c)的中圖是使用CD31抗體進行染色的，箭頭表明使用CD31而不用GFP染色的血管，(b)和(c)的右圖顯示的是同時使用GFP與CD31染色。(d)注射Lin-HSC(左圖)與對照視網膜(右圖)的α-SMA染色。
圖6顯示的是T2-TrpRS-轉染的Lin-HSCs抑制小鼠視網膜血管的發育。(a)人TrpRS、T2-TrpRS以及在氨基末端帶有Igk信號序列的T2-TrpRS的示意圖。(b)注射了使用T2-TrpRS轉染的Lin-HSC的視網膜，在體內表達T2-TrpRS蛋白。(1)在大腸桿菌中產生的重組T2-TrpRS；(2)在大腸桿菌中產生的重組T2-TrpRS；(3)在大腸桿菌中產生的重組T2-TrpRS；(4)對照視網膜；(5)注射Lin-HSC+pSecTag2A(只是載體)的視網膜；(6)注射Lin-HSC+pKLel35(在pSecTag中有Igk-T2-TrpRS)的視網膜。(a)內源TrpRS。(b)重組T2-TrpRS。(c)注射入視網膜中的Lin-HSC的T2-TrpRS。(c-f)注射後7天，接受注射的視網膜中具有代表性的原發(表層的)與次級(深層的)血管叢；(c)與(d)使用空質粒轉染的Lin-HSC進行注射的眼發育正常；(e)與(f)使用T2-TrpRS-轉染的Lin-HSC進行注射的眼，多數表現出深層血管叢受到抑制；(c)與(e)原發(表層的)血管叢；(d)與(f)次級(深層的)血管叢。在(f)中觀察到的較弱的血管輪廓是(e)中原發網絡血管的「相互滲透」圖像。
圖7顯示的是編碼His6-標記的T2-TrpRS的DNA序列，SEQ IDNO1。
圖8顯示的是His6-標記的T2-TrpRS的胺基酸序列，SEQ ID NO2。
圖9所示的是使用本發明中Lin-HSC以及Lin+HSC(對照)進行眼內注射的小鼠視網膜顯微照片與視網膜電圖(ERG)。
圖10描述的統計圖表明使用Lin-HSC進行治療的rd/rd小鼠眼中中間(Int.)及深層血管層的神經元修復(y-軸)與血管修復(x-軸)之間存在相關關係。
圖11描述的統計圖表明使用Lin+HSC進行治療的rd/rd小鼠眼中神經元修復(y-軸)與血管修復(x-軸)之間沒有相關關係。
圖12是一幅在注射後1個月(1M)、2個月(2M)以及6個月(6M)的時間點上，使用Lin-HSC對rd/rd小鼠眼進行治療(暗條)以及未對rd/rd小鼠眼進行治療(亮條)且以任意相對的單位給出的血管長度(y-軸)的條線圖。
圖13包括3個在注射後1個月(1M)、2個月(2M)及6個月(6M)的rd/rd小鼠外核層(ONR)中核數目的條線圖，並表明相對於使用Lin+HSC進行治療的對照眼(亮條)，使用Lin-HSC進行治療的眼(暗條)中核的數目有顯著增長。
圖14描述的是在單個rd/rd小鼠中，在1個月(1M)、2個月(2M)及6個月(6M)的時間點(注射後)上，右眼(R，使用Lin-HSC治療)與左眼(L，使用Lin+HSC治療的對照眼)相比較，表示其中外核層中核數目的點；在給定點上的每條線比較的是同一個小鼠的左右眼。
圖15描述的是在rd1/rd1小鼠(C3H/HeJ，左圖)或野生型小鼠(C57BL/6，右圖)中視網膜血管及神經細胞的變化。給出了同一個視網膜的視網膜全樣載片(紅色膠原蛋白IV，綠色CD31)及切片(紅色DAPI，綠色CD31，下圖)中，中間(上圖)或者深層(中圖)血管叢的視網膜血管(P出生後天數)(GCL節細胞層；INL內核層；ONL外核層)。
圖16表示的是注射Lin-HSC修復rd/rd小鼠中神經細胞的變性。A、B與C，在P30(A)、P60(B)及P180(C)時，中間(int.)或者深層血管叢的視網膜血管以及注射Lin-HSC的眼(右圖)與對側的注射對照細胞(CD31-)的眼(左圖)的切片，D，在P30(左圖，n＝10)、P60(中圖，n＝10)及P180(右圖，n＝6)時使用Lin-HSC注射或者使用對照細胞(CD31-)注射的視網膜中血管的平均總長度(+或者-平均值的標準差)。分別給出中間(Int.)與深層血管叢的數據(Y軸血管的相對長度)。E，在使用對照細胞(CD31-)進行注射或者使用Lin-HSC進行注射的視網膜中，在P30(左圖，n＝10)、P60(中圖，n＝10)及P180(右圖，n＝6)時ONL中細胞核的平均數(Y軸ONL中細胞核的相對數目)。F，在P30(左圖)、P60(中圖)及P180(右圖)時使用Lin-HSC注射或者使用對照細胞(CD31-)注射的視網膜中，血管長度(X軸)與ONL中細胞核數目(Y軸)之間的線性相關。
圖17表示的是通過注射Lin-HSC修復了視網膜的功能。使用視網膜電圖(ERG)記錄來測量注射到視網膜中的Lin-HSC或對照細胞(CD31-)的功能。A與B，注射後2個月得到恢復的與未恢復的視網膜的典型例子。給出了同一隻動物中，注射了Lin-HSC的右眼(A)與注射了CD31-對照細胞的左眼(B)的視網膜切片(綠色使用CD31染色的血管，紅色使用DAPI染色的核)。C，A與B中所示的同一隻動物的EPG結果。
圖18所示的是人骨髓細胞群能夠在rd1小鼠中修復變性的視網膜(A-C)。在rd10--小鼠另一個視網膜變性模型中，也觀察到這種修復(D-K)。A，使用綠色染料標記的人Lin-HSCs(hLin-HSCs)能夠在玻璃體內注射到C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠後分化為視網膜血管細胞。B與C，注射後1.5個月時，在使用Lin-HSC注射的眼(B)或對側的對照眼(C)中的視網膜血管(左圖上中間血管叢，下深層血管叢)與神經細胞(右圖)。D-K，使用Lin-HSCs對rd10小鼠的修復(在P6時注射)。給出了在P21(DLin-HSCs，H對照細胞)、P30(ELin-HSCs，I對照細胞)、P60(FLin-HSCs，J對照細胞)及P105(GLin-HSCs，K對照細胞)時具代表性的視網膜(在每個時間點上，獲得治療的眼與對照眼均來自同一隻動物)。視網膜血管(每幅圖的上圖為中間血管叢；每幅圖的中圖為深層血管叢)使用CD31(綠色)與膠原蛋白IV(紅色)染色。每幅圖的下圖顯示的是同一個視網膜的橫切面(紅色DAPI，綠色CD31)。
圖19顯示的是在使用Lin-HSCs治療後，晶體蛋白αA在修復的外核層細胞中表現出正調節，而在使用對照細胞處理的對側眼中沒有這種現象。左圖修復的視網膜中的IgG對照，中圖修復的視網膜中的晶體蛋白αA，右圖在未修復的視網膜中的晶體蛋白αA。
圖20包含在使用本發明Lin-HSCs進行治療的鼠類視網膜中表現出正調節的基因的表格。(A)在使用鼠Lin-HSCs進行治療的鼠視網膜中表達量增加3倍的基因。(B)在使用鼠Lin-HSCs進行治療的鼠視網膜中表現出正調節的晶體蛋白基因。(C)在使用人Lin-HSCs進行治療的鼠視網膜中表達量增加2倍的基因。(D)在使用人Lin-HSCs進行治療的鼠視網膜中表現出正調節的神經營養因子或者生長因子的基因。
圖21所示的是在本發明的CD133陽性(DC133+)以及CD133陰性(CD133-)的人Lin-HSC群中，CD31與整聯蛋白α6的分布圖。
圖22所示的是在出生後的P0直至P30期間，於常規氧水平(含氧量正常)進行飼養的野生型C57/B16小鼠出生後視網膜的發育。
圖23所示的是於P7至P12期間在高氧水平(含氧量高；75％氧)進行飼養，隨後於P12至P17在含氧量正常情況下進行飼養的野生型C57/B16小鼠中氧誘導的視網膜病變模型。
圖24所示的是在氧誘導的視網膜病變模型中通過使用本發明的Lin-HSC群來進行治療的血管修復。
優選實施例的詳細描述幹細胞可通過細胞表面抗原的分布來明確識別(詳細的討論參見《幹細胞科學進展與未來趨勢》，National Institutes of Health，Officeof Science Policy於2001年六月制定的報告，附錄E幹細胞標記，引入本文作為參考。
造血幹細胞是能夠發育成多種血細胞類型的幹細胞，例如B細胞、T細胞、粒細胞、血小板及紅細胞。譜系表面抗原是一組作為成熟血細胞譜系標記的細胞表面蛋白，包括CD2、CD3、CD11、CD11a、Mac-l(CD11bCD18)、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、CD45RA、鼠Ly-6G、鼠TER-119、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白細胞抗原DR(HLA-DR)以及CD235a(血型糖蛋白A)。不在顯著水平上表達這些抗原的造血幹細胞一般稱為譜系陰性(Lin-)。人造血幹細胞一般表達其它諸如CD31、CD34、CD117(c-kit)和/或CD133這樣的表面抗原。鼠造血幹細胞一般表達其它諸如CD34、CD117(c-kit)、Thy-1和/或Sca-1這樣的表面抗原。
本發明提供細胞表面不顯著表達「譜系表面抗原」(Lin)的分離的造血幹細胞。這種細胞在本文中用來指「譜系陰性」或者「Lin-」造血幹細胞。特別地，本發明提供了含有內皮祖細胞(EPCs)的Lin-造血幹細胞群(Lin-HSCs)，它能夠整合到發育中的血管然後分化形成血管內皮細胞。優選地，分離的Lin-HSC群置於譬如磷酸緩衝鹽溶液(PBS)這樣的培養基中。
在本文以及附加的權利要求中，用語「成熟的」骨髓，包括出生後分離的骨髓，也就是與胚胎相對，從幼年及成體個體中分離的骨髓。術語「成體哺乳動物」既指幼年的也指完全成熟的哺乳動物。
本發明提供含內皮祖細胞(EPCs)的分離的、哺乳動物的、譜系陰性的造血幹細胞(Lin-HSC)群。本發明分離的Lin-HSC群優選地由其中至少約20％的細胞能夠表達表面抗原CD31，通常存在於內皮細胞上的哺乳動物細胞所組成。在另一個實施方案中，至少約50％，更優選的是約65％，最優選的是至少75％的細胞表達CD31。優選地，本發明Lin-HSC群中至少約50％的細胞表達整聯蛋白α6抗原。
在一個優選的鼠Lin-HSC群的實施例中，至少約50％的細胞表達CD31抗原，至少約50％的細胞表達CD117(c-kit)抗原。優選地，至少約75％，更優選約81％的Lin-HSC細胞表達表面抗原CD31。在另一個優選的鼠的實施例中，至少約65％，更優選約70％的細胞表達表面抗原CD117。本發明的一個特別優選的實施例是一個其中約50％至85％的細胞表達表面抗原CD31並且約70％至75％的細胞表達表面抗原CD117的鼠Lin-HSCs群。
另一個優選的實施方案是其中細胞為CD133陰性、至少約50％的細胞表達CD31表面抗原並且至少約50％的細胞表達整聯蛋白α6抗原的人Lin-HSC群。而另一個優選的實施方案是其中細胞為CD133陽性、少於約30％的細胞表達CD31表面抗原並且少於約30％的細胞表達整聯蛋白α6抗原的人Lin-HSC群。
本發明中分離的Lin-HSC群在玻璃體內注射到諸如小鼠或人這樣的哺乳動物物種的眼中時，可選擇性地作用於星型膠質細胞並且整合到視網膜新生血管中，從其中分離細胞。
本發明中分離的Lin-HSC群含有能夠分化為內皮細胞並在視網膜內形成血管結構的內皮祖細胞。特別地，本發明的Lin-HSC群在治療視網膜新生血管與視網膜血管變性疾病方面具有用處，並能修復視網膜血管損傷。本發明的Lin-HSC細胞促進視網膜中神經元的修復並促進抗細胞凋亡基因的正調節。一個不可思議的發現是本發明中的成熟Lin-HSC細胞甚至能夠在患有視網膜變性的惡性複合免疫缺陷(SCID)小鼠中抑制視網膜變性。此外，Lin-HSC群能夠在諸如由氧誘導的視網膜病變或者早熟性視網膜病變傷害的初生哺乳動物眼中用來治療視網膜缺陷。
本發明還提供了一種在哺乳動物中治療眼疾的方法，其包括由從哺乳動物骨髓中分離含有內皮祖細胞的譜系陰性的造血幹細胞群、以及將分離到的幹細胞以足以抑制疾病的量玻璃體內注射到哺乳動物眼中。本發明可以在初生的、幼年的或者完全成體的哺乳動物中用來治療諸如視網膜變性疾病、視網膜血管變性疾病、局部缺血性視網膜病變、血管出血、血管滲漏及脈絡膜病變這樣的眼疾。這些疾病的實施例包括年齡相關性黃斑變性(ARMD)、糖尿病視網膜病變(DR)、擬眼組織胞漿菌病(POHS)、早產兒視網膜病(ROP)、鐮狀細胞貧血與色素性視網膜炎，以及視網膜損傷。
注射到眼中的幹細胞的數目應該足以抑制眼睛的疾病狀態。例如，細胞的數目能夠有效修複眼視網膜損傷、穩定視網膜新生血管、成熟視網膜新生血管並防止或者修復血管滲漏與血管出血。
可以使用諸如編碼基於細胞進行基因治療的、用於眼中的抗血管新生蛋白的基因、以及編碼增強神經元修復效果的神經營養劑的基因這樣的治療上有用的基因來轉染本發明中Lin-HSC群的細胞。
轉染的細胞可以包括任何能用於治療視網膜障礙的治療上有用的基因。在一個優選的實施方案中，本發明中轉染的Lin-HSCs含有可操作地編碼抗血管新生肽的基因，該肽包括蛋白、或者諸如TrpRS或其抗血管新生的片段，例如在共同未決的美國專利申請No.10/080,839中所詳細描述的TrpRS的T1與T2片段，其公開所公開的內容引入本申請作為參考。本發明中編碼抗血管新生肽的轉染的Lin-HSCs在治療諸如糖尿病視網膜病變及其它類似疾病這樣的與異常血管發育相關的視網膜疾病方面是有益的。Lin-HSCs優選地是人細胞。
在另一個優選的實施方案中，本發明中轉染的Lin-HSCs含有可操作地編碼諸如神經生長因子、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、神經營養蛋白-5、睫狀神經營養因子、視網膜色素上皮衍生的神經營養因子、胰島素樣生長因子、神經膠質細胞系衍生的神經營養因子、腦衍生神經營養因子以及其它類似的神經營養劑的基因。這類神經營養的Lin-HSCs在促進諸如青光眼與色素性視網膜炎、治療視網膜神經損傷等視網膜神經變性疾病中的神經元修複方面是有益的。已有報導植入睫狀神經營養因子可作為色素性視網膜炎的有效治療手段(參見Kirby等.2001，Mol Ther.3(2)241-8；Farrar等.2002，EMBO Journal21857-864)。據報導腦衍生神經營養因子可在受損的視網膜神經節中調節與基因相關的生長(參見Fournier，等.，1997，J.Neurosci.Res.47561-572)。據報導神經膠質細胞系衍生的神經營養因子在色素性視網膜炎中能延緩光感受器的變性(參見McGee等.2001，Mol Ther.4(6)622-9)。
本發明還提供了一種從哺乳動物骨髓中分離含有內皮祖細胞的譜系陰性的造血幹細胞的方法。該方法包括以下步驟(a)從成體哺乳動物中抽取骨髓；(b)從骨髓中分離多種類型單核細胞；(c)使用針對一個或多個譜系表面抗原的生物素偶聯的譜系群體抗體來標記單核細胞，優選地譜系表面抗原選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G(鼠的)、TER-119(鼠的)、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86(B7.2)、CD66b、人白細胞抗原DR(HLA-DR)及CD235a(血型糖蛋白A)；(d)從多種類型單核細胞中除去上述一種或多種表面抗原為陽性的單核細胞，並回收含有內皮祖細胞的譜系陰性的造血幹細胞群，優選地其中至少20％的細胞表達CD31。
當從成人骨髓中分離Lin-HSC時，優選地，使用針對譜系表面抗原CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86(B7.2)和CD235a的生物素偶聯的譜系群體抗體來標記單核細胞。當從成體小鼠骨髓中分離Lin-HSC時，優選地，使用針對譜系表面抗原CD3、CD11、CD45、Ly-6G和TER-119的生物素偶聯的譜系群體抗體來標記單核細胞。
在一個優選的方法中，從成人骨髓中分離細胞並通過CD133譜系進一步分離。一個優選的分離人Lin-HSCs的方法包括使用生物素偶聯的CD133抗體來標記單核細胞及回收CD133陽性的Lin-HSC群的額外步驟。典型地，少於約30％的此類細胞表達CD31並且少於約30％的此類細胞表達整聯蛋白α6。本發明中CD133陽性的人Lin-HSC群在注射到未發生血管新生的眼中時能夠作用於外周局部缺血所引發的新生血管的位點。
分離人Lin-HSC的另一個優選方法包括使用生物素偶聯的CD133抗體來標記單核細胞、除去CD133陽性的細胞並回收CD133陰性的Lin-HSC群的額外步驟。典型地，至少約50％的此類細胞表達CD31並且至少約50％的此類細胞表達整聯蛋白α6。本發明中CD133陰性的人Lin-HSC群在注射到發生血管新生的眼中時能夠整合到發育中的血管中。
本發明還提供通過施用本發明中轉染的Lin-HSC細胞、並將這些細胞玻璃體內注射至眼中來治療眼血管新生疾病的方法。這些轉染的Lin-HSC細胞包括能夠編碼抗血管新生或神經營養基因產物的治療上有用的基因轉染的Lin-HSC。優選地，轉染的Lin-HSC細胞是人細胞。
優選地，至少約1×105個Lin-HSC細胞或者轉染的Lin-HSC細胞通過玻璃體內注射至患有視網膜變性疾病的哺乳動物眼中的方式來施用。所注射細胞的數目可依據視網膜變性的嚴重程度、哺乳動物的年齡以及在治療視網膜變性領域的普通技術人員已知的其它因素。在一個時期內，Lin-HSC可以以單劑量或多劑量施用的方式施用，這由負責治療的臨床醫生決定。
本發明的Lin-HSCs在治療與傳導阻滯相關視網膜損傷與視網膜缺陷、或者視網膜血管變性或視網膜神經變性這些方面是有益的。人Lin-HSC也能夠用來產生遺傳上相同的細胞系，即無性繁殖系，可以用在視網膜血管的再生性或修復性治療中，也可用於視網膜神經變性的改善治療。
方法實施例1.細胞分離與富集鼠Lin-HSC群A與B的製備常規步驟.所有體內評估均依照《NIH實驗動物看護與使用指南》執行，並且所有評估程序均獲得Scripps研究所(TSRI，La Jolla，CA)動物看護與使用委員會的認可。從B6.129S7-Gtrosa26、Tie-2GFP、ACTbEGFP、FVB/NJ(rd/rd小鼠)或者Balb/cBYJ成體小鼠(TheJackson Laboratory，ME)中提取骨髓細胞。
通過使用HISTOPAQUE蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)的密度梯度離心來分離單核細胞，並使用在小鼠中用於Lin-選擇的生物素偶聯的譜系群體抗體(CD45、CD3、Ly-6G、CD 11、TER-119，Pharmingen，San Diego，CA)來標記這些單核細胞。使用磁分離設備(AUTOMACSTMsorter，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)從Lin-HSC中分離譜系陽性(Lin+)細胞並除去。所獲得的含內皮祖細胞的Lin-HSC群使用下述抗體，PE-聯接的-Sca-1、c-kit、KDR及CD31(Pharmingen，San Diego，CA)利用FACS Calibur流式細胞儀(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)來進一步鑑定。Tie-2-GFP骨髓細胞被用來鑑定Tie-2。
為了獲得成體小鼠內皮細胞，通過外科手術從ACTbEGFP小鼠中分離腸繫膜組織並置於膠原酶(Worthington，Lakewood，NJ)中以消化組織，然後使用45μm過濾器過濾。收集流通濾液並用內皮生長培養基(Clonetics，San Diego，CA)溫育。通過觀察形態上鵝卵石樣外觀、使用CD31 mAb(Pharmingen)染色以及檢查培養物在MATRIGELTMmatrix(Beckton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)中形成管腔樣結構，來確認內皮的性狀。
鼠Lin-HSC群A.通過上述的常規步驟從ACTbEGFP小鼠中提取骨髓細胞。Lin-HSC細胞通過FACS流式細胞儀來鑑定CD31、c-kit、Sca-1、Flk-1與Tie-2細胞表面抗原標記。結果如圖1c所示。約81％的Lin-HSC顯示出CD31標記，約70.5％的Lin-HSC顯示出c-kit標記，約4％的Lin-HSC顯示出Sca-1標記，約2.2％的Lin-HSC顯示出Flk-1標記，約0.91％的Lin-HSC顯示出Tie-2標記。相反，從這些骨髓細胞中分離的Lin+HSC具有顯著不同的細胞標記圖譜(即，CD3137.4％；c-kit20％；Sca-12.8％；Flk-0.05％)。
鼠Lin-HSC群B.通過上述的常規步驟從Balb/C、ACTbEGFP及C3H小鼠中提取骨髓細胞。分析Lin-HSC細胞中存在的細胞表面抗原(Sca-1、KDR、c-kit、CD34、CD31及多種整聯蛋白α1、α2、α3、α4、α5、α6、αM、αV、αX、αIIb，，β1、β4、β3、β4、β5及β7)結果如表1所示。
表1.Lin-HSC群B的特徵描述


實施例2.在鼠模型中玻璃體內施用細胞使用鋒利的刀片在小鼠的眼瞼中割去一份眼瞼組織使得P2至P6期間眼球暴露在外。然後使用33號(Hamilton，Reno，NV)針頭注射器玻璃體內注射本發明的譜系陰性的HSC群A(在約0.5μl至約1μl細胞培養基中大約有105個細胞)。
實施例3.EPC轉染根據廠商的實驗手冊，利用FuGENETM6轉染試劑(Roche，Indianapolis，IN)，使用編碼TrpRS的T2片段且含有His6標籤(SEQID NO1，圖7)的DNA轉染鼠Lin-HSC(群A)。Lin-HSC細胞(大約每ml 106細胞)懸浮在含有幹細胞因子(PeproTech，Rocky Hill，NJ)的opti-MEM培養基中(Invitrogen，Carlsbad，CA)。然後加入DNA(約1μg)與FuGENE試劑(約3μl)，混合物於約37℃溫育約18小時。溫育後，清洗並收集細胞。經FACS分析確認該系統的轉染率大約為17％。T2產物利用Western印跡確認。帶有His6標籤的T2-TrpRS的胺基酸序列如圖8中SEQ ID NO2所示。
實施例4.免疫組織化學及共聚焦分析在多個不同的時間點收集小鼠視網膜，用來製備全樣載片或者冰凍切片。若製備全樣載片，視網膜使用4％的低聚甲醛固定，在50％胎牛血清蛋白(FBS)及20％普通羊血清中於室溫下封閉一小時。視網膜經一抗處理後用二抗檢測。使用的一抗有抗膠原蛋白IV(Chemicon，Temecula，CA)、抗β-gal(Promega，Madison，WI)、抗GFAP(Dako Cytomation，Carpenteria，CA)，抗α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA，Dako Cytomation)。使用的二抗聯接了Alexa 488或者594螢光標記(Molecular Probes，Eugene，OR)。利用MRC 1024共聚焦顯微鏡(Bio-Rad，Hercules，CA)獲取圖像。利用LASERSHARP軟體(Bio-Rad)創建三維圖像以檢查在視網膜全樣載片中三個不同血管層的發育。由共聚焦顯微鏡所辨別出的增強GFP(eGFP)小鼠與GFAP/wtGFP小鼠間GFP點密度的差異用來創建3D圖像。
實施例5.小鼠中體內視網膜血管新生的定量檢驗為了分析T2-TrpRS，從小鼠視網膜三維圖像重建了原發與深層血管叢。原發叢分為兩類正常發育，或者中斷的血管形成。深度血管發育抑制的分類是依據血管抑制的百分比建立的，包括以下標準深層血管叢形成受到完全抑制標記為「完全」，正常血管發育(含少於25％的抑制)標記為「正常」，其餘的標記為「部分」。對於rd/rd小鼠的修複數據，使用10×透鏡記錄每個視網膜全樣載片中更深層血管叢的四個分開的區域。計算每幅圖像中血管的總長，完成後在組間進行比較。為了獲得精確的信息，將Lin-HSC注射到小鼠的一隻眼中而將Lin+HSC注射到同一隻小鼠的另一隻眼中。未進行注射用作對照的視網膜取自同一窩幼仔。
實施例6.成體視網膜損傷小鼠模型使用二極體雷射(150mW，1秒，50mm)或者用27號針機械刺破小鼠視網膜建立雷射及創傷模型。傷後5天，利用玻璃體內方法注射細胞。5天後從小鼠中收集眼睛。
實施例7.視網膜變性的神經營養修復由成體鼠骨髓獲得的譜系陰性的造血幹細胞(Lin-HSC)在小鼠視網膜變性模型中具有血管營養及神經營養修復效果。玻璃體內注射約0.5毫升含有約105個本發明的Lin-HSC至10天齡小鼠的右眼中，2個月後估算視網膜血管與神經層核數目。同一隻小鼠的左眼使用大約相同數目的Lin+HSC注射作為對照，並進行類似估算。如圖9所示，在使用Lin-HSC進行治療的眼中，視網膜血管幾乎正常，內核層基本正常，外核層(ONL)有約3至4層核。相反，對側使用Lin+HSC處理的眼其中視網膜血管層明顯萎縮，外視網膜血管層完全萎縮；內核層明顯萎縮且外核層完全消失。在小鼠3與小鼠5的圖例中這種情況尤為明顯。在小鼠1中，未見修復效果，這種情況存在於大約15％接受注射的小鼠中。
使用視網膜電流圖(ERG)評定視覺功能時，當觀測到血管與神經修復(小鼠3與5)時可觀察到陽性ERG的恢復。當沒有血管與神經修復(小鼠1)時，觀察不到陽性ERG。施用本發明的Lin-HSC的rd/rd小鼠眼中血管與神經營養修復的關係通過回歸作圖形式在圖10中給出。在中間血管類型(r＝0.45)及深層血管(r＝0.67)中觀察到神經元(y-軸)與血管(x-軸)之間的相關關係。
圖11所示的是施用Lin+HSC在血管與神經元修復之間沒有任何統計學上顯著的相關關係。對血管修復進行量化，數據在圖12中給出。圖12中所示的注射後1個月(1M)、2個月(2M)及6個月(6M)的小鼠的數據，表明使用本發明的Lin-HSC進行治療的眼中血管長度(暗條)，與同一隻小鼠未治療的眼中的血管長度(亮條)相比，有了顯著增加，特別是在注射後1個月與2個月時更明顯。在注射Lin-HSC或者Lin+HSC約兩個月後通過計算內外核層中神經核的數目可以對神經營養修復效果進行定量。結果如圖13與14所示。
實施例8.人Lin-HSC群通過上述常規步驟從健康成人志願者中提取骨髓細胞。然後單核細胞通過使用HISTOPAQUE蔗糖梯度(Sigma，St.Louis，MO)的密度梯度離心進行分離。為了從人骨髓單核細胞中分離Lin-HSC群，將下述生物素偶聯的譜系群體抗體用於磁分離體系(AUTOMACSTMsorter，Miltenyi Biotech，Auburn，CA)CD2、CD3、CD4、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD33、CD38、CD45RA、CD64、CD68、CD86、CD235a(Pharmingen)。
基於CD133表達將人Lin-HSC群進一步分為兩個亞群。細胞使用生物素偶聯的CD133抗體標記並分為CD133陽性與CD133陰性亞群。
實施例9在視網膜變性鼠模型中玻璃體內施用人與鼠細胞C3H/HeJ、C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID與rd10小鼠品系用作視網膜變性模型。C3H/HeJ與C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠(TheJackson Laboratory，Maine)在導致早期發生嚴重的視網膜變性的視網膜變性1(rd1)突變上是同型的。該突變位於編碼杆狀光感受器cGMP磷酸二酯酶β亞基的Pde6b基因的外顯子7部分。已經在常染色體隱性的色素性視網膜炎(RP)的人患者中發現了該基因的這個突變。C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠在惡性複合免疫缺陷自發突變(Prkdc SCID)上也是同型的，且被用在人細胞轉移實驗中。rd10小鼠中視網膜變性是由Pde6b基因的外顯子13中的突變導致的。這也是後期發作的與臨床有關的RP模型，而且是比rd1/rd1更輕微的視網膜變性。所有評估均依照《NIH實驗動物看護與使用指南》來執行，並且所有的評估過程均獲得Scripps研究所(TSRI，La Jolla，CA)動物看護與使用委員會的認可。
使用鋒利的刀片在小鼠的眼瞼中割去一份眼瞼組織使得P2至P6期間眼球暴露在外。然後使用33-號(Hamilton，Reno，NV)針頭注射器玻璃體內注射鼠群A或者人群C的譜系陰性的HSC細胞(在約0.5μl至約1μl細胞培養基中大約有105個細胞)至小鼠眼中。為了使所注射的人細胞可見，在注射前使用染料(Cell tracker green CMFDA，Molecular Probes)標記細胞。
在多個不同的時間點收集視網膜並用4％的低聚甲醛(PFA)與甲醇固定，接著在50％FBS/20％NGS中於室溫封閉一小時。為了給視網膜血管染色，使用抗CD31(Pharmingen)及抗膠原蛋白IV(Chemicon)之後接著用Alexa 488或594聯接的二抗(MolecularProbes，Eugene，Oregon)溫育視網膜。按四個徑向上減緩切口的方式平放視網膜以獲得全樣載片標本。中間或深層血管叢(參見Dorrell等.2002 Invest Ophthalmol.Vis.Sci.433500-3510)中的血管圖像利用MP2100共聚焦顯微鏡及LASERSHARP軟體(Biorad，Hercules，California)獲得。為了量化血管，從中間或深層血管層的中間部分隨機選擇四個獨立的區域(900μm×900μm)，使用LASERPIX分析軟體(Biorad)測量血管的總長。同一個血管叢中這四個區域的總長度被用來做進一步的分析。
重新包埋壓片的視網膜用於冰凍切片。視網膜置於4％PFA中過夜然後用20％的蔗糖溫育。視網膜包埋在最佳切割溫度化合物(OCTTissue-Tek；Sakura FineTech，Torrance，CA)中。冰凍切片(10μm)在含有核染料DAPI(Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri)的PBS中再次水合。通過共聚焦顯微鏡獲得含有視神經頭部及整個周邊視網膜的單個切片中三個不同區域(280μm寬，無偏採樣)的DAPI標記的核圖像。對位於一個切片三個獨立區域ONL中的核的數目進行計算並求和以進行分析。執行簡單的線性回歸分析以檢測在深層血管叢中血管長度與ONL中細胞核數目之間的關係。
經過整夜的暗適應後，通過腹膜內注射15μg/gm克氯胺酮與7μg/gm甲苯噻嗪來麻痺小鼠。使用金箔角膜電極，並將參考電極放置口中，接地電極與尾相連，在瞳孔擴大(散瞳)後(1％硫酸阿託品)從每隻眼的角膜表面記錄視網膜電流圖(ERGs)。使用固定在高反射空視野拱頂外面的Grass Photic Stimulator(PS33Plus，GrassInstruments，Quincy，MA)產生刺激。根據直至光刺激器(0.668cd-s/m2)所允許的最大亮度的範圍內短波長(Wratten 47A；λmax＝470nm)閃光來記錄視杆細胞反應。反應信號被放大(CP511 ACamplifier，Grass Instruments)、數位化處理(PCI-1200，NationalInstruments，Austin，TX)、然後用計算機進行分析。對於來自治療的及未治療的眼中的ERGs記錄，每隻小鼠均可作為自己的內標。將多達100次的掃描進行平均用作最弱信號。從治療眼的應答中減去未治療眼的平均應答，信號中的這個差值可用作功能性恢復指數。
使用微陣列分析來評估Lin-HSC中視網膜基因表達。使用Lin-或者CD31-HSCs注射P6時的rd/rd小鼠。注射後40天(在注射後的這個時間點上，明顯可見視網膜血管及光感受器層的修復)將這些小鼠的視網膜剝離到沒有Rnase的培養基中。通過全樣載片分析每個視網膜的一個扇型部分，以確保正常的HSC作用以及血管與神經保護均已經實現。取自注射成功的視網膜中的RNA通過TRIzol(LifeTechnologies，Rockville，MD)、酚/氯仿RNA分離方案進行純化。RNA雜交到Affymetrix Mu74Av2晶片上，使用GENESPRING軟體(SiliconGenetics，Redwood City，CA)分析基因表達。純化的人或小鼠HSCs玻璃體內注射至P6小鼠。在P45時剝離視網膜並收集1)注射了人HSC、並修復了的小鼠視網膜，2)注射了人HSC、未修復的小鼠視網膜，及3)注射了小鼠HSC、並修復了的小鼠視網膜的片段，用來純化RNA並雜交到人特異性的U133A Affymetrix晶片上。使用GENESPRING軟體鑑定表達水平在背景值以上並且在使用人HSC修復的視網膜中具有更高表達量基因。然後單獨分析這些基因中每個基因的探針對表達圖譜，並與使用dChip的正常人U133A微晶片實驗模型進行比較，以確認人的特異性雜交並消除由於跨物種雜交造成的假陽性。
當CD133陽性與CD133陰性的亞群通過玻璃體內注射到初生SCID小鼠的眼中時，在表達CD31及整聯蛋白α6表面抗原的CD133陰性亞群(參見圖21，下圖)中觀察到其與發育中血管的最大程度整合。不表達CD31及整聯蛋白α6的CD133陽性亞群(圖21，上圖)看上去作用於外周局部缺血所導致的新生血管靶位點，不過在注射到處於血管新生的眼中時並非如此。
實施例10.在氧誘導的視網膜變性鼠模型中玻璃體內施用鼠細胞在氧誘導的視網膜變性(OIR)模型中，將出生後P7至P12期間的新生野生型小鼠C57B16小鼠暴露於高氧環境(75％氧)中。圖22所示的是從P0至P30期間C57B16小鼠中正常的初生後血管發育。在P0時只在視神經盤周圍觀察到剛開始發育的表層血管。接下來幾天後，原發的表層網絡擴展至外圍，在P10時到達遠處外圍。在P7與P12期間，次級(深層)血管叢開始發育。至P17時，已呈現出一個廣泛的表層與深層血管網絡(圖22，插圖)。在隨後的時間，同血管的第三(中間)層一起進行重塑，直至在約P21時形成成熟結構為止。
相反，在OIR模型中，在於P7-P12暴露於75％氧之後，事件的正常順序被劇烈打斷(圖23)。本發明的成體鼠Lin-HSC群於P3時注射到隨後會經歷OIR的小鼠的一隻眼中，另一隻眼注射PBS或者CD31陰性細胞用作對照。圖24所示的是本發明的Lin-HSC群能夠在處於發育中的小鼠視網膜中逆轉高氧水平的變性效果，在P17經處理的眼中可觀察到完全發育的表面及深層視網膜血管結構而在對照眼中表現出的是在大血管區域實際上沒有沒有深層血管(圖24)。在OIR模型中觀察了約100隻小鼠眼睛。在58％使用本發明Lin-HSC治療的眼中觀察到正常血管形成，比較而言，12％使用CD31-細胞處理的對照眼及3％使用PBS處理的對照眼也有此現象。
結果鼠視網膜血管發育眼血管新生模型小鼠眼睛為諸如人視網膜血管發育這樣的哺乳動物視網膜血管發育提供了一種公認的模型。在鼠視網膜血管發育期間，局部缺血誘導的視網膜血管與以星型膠質細胞緊密聯接的方式發育。這些神經膠質元件從視神經盤沿節細胞層移至人胎兒或者新生嚙齒類動物妊娠末三個月時的視網膜上，並呈放射狀伸展。當鼠視網膜血管發育時，內皮細胞利用這個已經存在的星型膠質細胞模板來確定視網膜血管的模式(參見圖1a與b)。圖1(a與b)描述的是小鼠視網膜發育示意圖。圖1a描述的是疊加在星型膠質細胞模板(淺線)上原發叢(圖中上左的暗線)的發育，圖1b描述的是視網膜血管形成的第二階段。在圖中，GCL代表神經節細胞層；IPL代表內網層；INL代表內核層；OPL代表外網層；ONL代表外核層，RPE代表視網膜色素上皮；ON代表視神經；P代表外周部。
在出生時，視網膜血管實際上不存在。至出生後14天(P14)，視網膜已經發育成同視覺形成相符的複雜的視網膜血管原發(表層的)與次級(深處的)層。最初，輻條狀的外周乳突血管在已存在的星型膠質細胞網絡上向外周快速生長，通過形成毛細血管叢使其連接日益增多。這些血管於直至P10期間在神經纖維內部作為一個單層生長(圖1a)。在P7-P8期間側枝開始由原發叢長出，並刺入視網膜至外網層在那裡形成次級或深層視網膜血管叢。至P21時，整個網絡一進行了廣泛重塑，第三個或中間血管叢在內核層內表面形成(圖1b)。
從多個理由可以認為初生小鼠視網膜血管新生模型在研究眼血管新生期間HSC的作用是非常有用的。在這個與生理學有關的模型中，在內源血管出現之前已經存在一個大的星型膠質細胞模板，這可以用來評估新血管形成過程期間細胞-細胞相互作用的功用。此外，已知這個一貫的且可重複的初生視網膜血管形成過程是低氧引發的，在這個方面它與許多已知的由局部缺血在其中起作用的視網膜疾病具有相似性。
從骨髓中富集內皮祖細胞(EPC)儘管細胞表面標記表達已經廣泛用於評估所製備HSC中的EPC群，但專一識別EPC的標記仍然未確定。為了富集EPC，造血譜系標記陽性的細胞(Lin+)，即B淋巴細胞(CD45)、T淋巴細胞(CD3)、粒細胞(Ly-6G)、單核細胞(CD11)和紅細胞(TER-119)，從小鼠骨髓單核的細胞中除去。用Sca-1抗原來進一步富集EPC。玻璃體內注射等量的Lin-Sca-1-細胞或者Lin-細胞的結果進行比較，在兩個組中沒有發現差異。實際上，當注射Lin-Sca-1-細胞時，觀察到與發育中血管在更大程度上的整合。
根據功能測定，本發明的Lin-HSC群同EPCs一起富集。進一步地，Lin+HSC群與Lin-HSC群功能表現完全不同。對通常用於鑑定EPC各組分(基於先前報導的體外特徵研究)的抗原決定簇也進行了評估。然而這些標記沒有哪個是與Lin-組分專一聯繫的，同Lin+HSC組合物相比，所有標記在Lin-HSC中增加約70至約1800％(圖1c)。圖1c描述的是來源於骨髓的Lin+HSC與Lin-HSC分離細胞的流式細胞儀特徵圖。圖1c的頂行所示的是造血幹細胞中非抗體標記細胞的二維點圖分布，R1表示陽性PE-染色的可定量區域；R2表示GFP-陽性；在中間行給出了Lin-HSC的二維點圖，在底行給出了Lin+HSC的二維點圖。C57B/6細胞使用針對Sca-1、c-kit、Flk-1/KDR、CD31的PE-聯接抗體進行標記。Tie-2數據由Tie-2-GFP小鼠中獲得。在二維點圖角上的百分比表示在整個Lin-HSC或Lin+HSC群中陽性標記細胞的百分數。有趣的是，公認的EPC標記，譬如Flk-1/KDR、Tie-2及Sca-1都是弱表達，因此沒有用於進一步的分離。
玻璃體內注射的HSC Lin-細胞含有作用於星型膠質細胞的EPC並整合到發育中的視網膜血管為了判定是否玻璃體內注射Lin-HSC能夠作用於視網膜的特定細胞類型、利用星型膠質細胞模板並參與視網膜血管新生，取自本發明Lin-HSC組合物的約105個細胞或者取自成體小鼠(GFP或者LacZ轉基因)骨髓的的Lin+HSC細胞(對照，約105個細胞)注射到出生後2天(P2)的小鼠眼中。注射後四天(P6)，來源於GFP或者LacZ轉基因小鼠的本發明Lin-HSC組合物中的很多細胞，粘著在視網膜上並具有內皮細胞典型伸長的外觀(圖2a)。圖2描述的是Lin-HSCs進入發育中的小鼠視網膜的植入過程。如圖2a所示，注射後四天(P6)玻璃體內注射的eGFP+Lin-HSC在視網膜上附著並分化。
在視網膜的很多區域，GFP表達細胞以一種能與下面星型膠質細胞相一致的方式排列，類似於血管。這些螢光細胞在內源的、發育中的血管網絡之前被觀察到(圖2b)。相反，只有少數Lin+HSC(圖2c)或者成體小鼠腸繫膜內源細胞(圖2d)附著在視網膜表面。為了確認是否來自所注射Lin-HSC群的細胞也能夠附著在已經形成血管的視網膜上，我們注射Lin-HSC組合物到成熟的眼中。有趣的是，沒有觀察到細胞附著在視網膜上或整合到已形成的、正常的視網膜血管中(圖2e)。這表明本發明的Lin-HSC組合物不破壞已正常發育完成的血管，不會在正常發育完成的視網膜中引發異常的血管形成。
為了判定本發明中所注射的Lin-HSC組合物與視網膜星型膠質細胞之間的關係，使用了能夠表達膠質細胞原纖維酸性蛋白(GFAP，星型膠質細胞的一種標記)與由啟動子促發的綠色螢光蛋白(GFP)的轉基因小鼠。對使用來自eGFP轉基因小鼠的Lin-HSC進行注射的這些GFAP-GFP轉基因小鼠的視網膜進行檢查，表明所注射的eGFPEPC與已存在的星型膠質細胞共同定位(圖2f-h，箭頭處)。觀察到eGFP+Lin-HSC的突起與下面的星型膠質細胞網絡一致(箭頭，圖2g)。對這些眼的檢查表明所注射的標記了的細胞僅附著於星型膠質細胞上；在視網膜外周仍沒有內源血管的P6小鼠視網膜中，觀察到所注射的細胞附著在位於那些仍未血管化區域的星型膠質細胞上。有趣的是，在視網膜更深層處正常視網膜血管將隨後發育的精確位點上觀察到所注射的標記了的細胞(圖2i，箭頭)。
為了判定所注射的本發明中的Lin-HSC是否能穩定整合到發育中的視網膜血管，在幾個稍後的時間點上檢查視網膜血管。早在P9時(注射後七天)，Lin-HSC已整合至CD31+結構(圖2j)。到P16(注射後14天)時，細胞已經廣泛整合至視網膜中類血管的結構中(圖2k)。在處死動物之前心內注射羅丹明-葡聚糖(以鑑定具有功能的視網膜血管)，多數Lin-HSC與未閉合的血管排在一起(圖2l)。觀察到標記細胞分布的兩種模式(1)在一個模式中，細胞在未標記的內皮細胞間沿血管散布；以及(2)另一個模式顯示血管完全由所標記的細胞組成。所注射的細胞也整合到深層血管叢的血管中(圖2m)。雖然以前曾報導過來源於Lin-HSC的EPC零散結合到新生血管中，但本文是首次報導血管網絡完全由這些細胞組成。這表明本發明中玻璃體內注射的來源於骨髓的Lin-HSC群中的細胞能夠有效整合到形成中的視網膜血管叢的任何一層。
玻璃體內注射後對非視網膜組織(例如，腦、肝臟、心臟、肺、骨髓)進行5或10天的組織學檢查，沒有發現存在任何GFP陽性細胞。這表明Lin-HSC組合物中某個亞群的細胞選擇性地作用於視網膜星型膠質細胞並穩定整合到發育中的視網膜血管中。由於這些細胞具有許多內皮細胞的特徵(同視網膜星型膠質細胞相關聯、細長的形態、穩定整合到未閉合的血管並且在沒有血管的部位不存在)，這些細胞表明在Lin-HSC群中存在EPC。所作用的星型膠質細胞與在許多缺氧性視網膜病變中觀察到的是相同類型。現已充分了解神經膠質細胞是DR與其它類型的視網膜損傷中所觀察到的新血管葉(neovascularfronds)的主要組分。在活性神經膠質增生及局部缺血引發的血管新生的條件下，活性星型膠質細胞增生、產生細胞因子並上調GFAP，與包括人在內的許多哺乳動物物種在初生視網膜血管模板形成階段所觀察到的現象相仿。
本發明的Lin-HSC群會象在初生眼中那樣作用於成體小鼠眼中的活性星型膠質細胞，將Lin-HSC細胞注射到由於光致凝結(圖3a)或針尖(圖3b)導致視網膜損傷的成熟的眼中。在兩個模型中，只是在損傷位點周圍觀察到顯著的GFAP染色的細胞群(圖3a與b)。來自所注射Lin-HSC組合物的細胞位於損傷位點並與GFAP陽性的星型膠質細胞保持特異聯繫。在這些位點上，還觀察到Lin-HSC細胞以與深層視網膜血管初生形成階段相似的水平移至視網膜的更深層。視網膜未損傷的部分不含有Lin-HSC細胞，這與當Lin-HSC注射到正常的、未受傷的成熟視網膜中時所觀察到的相一致(圖2e)。這些數據表明Lin-HSC組合物能夠選擇性地與神經膠質增生作用於受傷的成熟視網膜中的活性神經膠質細胞以及正在形成血管的初生視網膜。
玻璃體內注射的Lin-HSC能夠修復並穩定變性的血管由於玻璃體內注射的Lin-HSC組合物作用於星型膠質細胞並整合到正常的視網膜血管中，這些細胞也可以穩定由於局部缺血或者與神經膠質增生及血管變性相聯繫的變性視網膜疾病中的變性血管。出生後一個月內的rd/rd小鼠是用於顯示光感受器深度變性及視網膜血管層的視網膜變性的模型。這些小鼠中視網膜血管正常發育至P16，此時較深的血管叢退化；到P30時絕大多數小鼠中深層與中間的血管叢幾乎完全變性。
為了判定是否HSC能夠修復退化的血管，將Lin+或Lin-HSC(來自Balb/c小鼠)於P6時玻璃體內注射到rd/rd小鼠。至P33時，使用Lin+HSC注射後，視網膜最深層的血管幾乎完全消失(圖4c和b)。相反，至P33時絕大多數注射了Lin-HSC的視網膜具有幾乎正常的具有3個平行的、良好成型的血管層的視網膜血管結構(圖4c和d)。該效應的量化結果表明注射了Lin-的rd/rd眼中深層血管叢的平均長度幾乎比未處理或注射Lin+細胞處理的眼高3倍(圖4e)。令人驚訝的是，注射來源於rd/rd成體小鼠(FVB/N)骨髓的Lin-HSC組合物也能夠修復變性的rd/rd初生小鼠的視網膜血管(圖4f)。早在出生後2-3周便觀察到rd/rd小鼠眼中血管的變性。遲至P15時注射Lin-HSC也可使rd/rd小鼠中變性的血管能在至少一個月的時間裡維持部分穩定(圖4g和4h)。
注射至較年幼(譬如，P2)的rd/rd小鼠中的Lin-HSC組合物也整合到發育中的表層血管中。至P11時，觀察到這些細胞移至深層血管叢的層面並形成與在野生型外部視網膜血管層中所觀察到的一致的模式(圖5a)。為了更清晰描述所注射的Lin-HSC組合物中細胞整合至並且穩定rd/rd小鼠中變性的視網膜血管的方式，將來源於Balb/c小鼠的Lin-HSC組合物注射到Tie-2-GFP FVB小鼠眼中。FVB具有rd/rd基因型，並且由於他它們表達融合蛋白Tie-2-GFP，所有的內源血管都是螢光顯色的。
當來自Lin-HSC組合物的未標記細胞注射到初生的Tie-2-GFPFVB眼中並隨後整合到發育中的血管時，在內源的、Tie-2-GFP標記的血管中應該存在未標記的間斷(gap)，Tie-2-GFP標記的對應於所注射的已整合的、未標記的Lin-HSC。隨後使用另一種血管標記(譬如，CD-31)進行的染色可以顯示出整個血管，可以用來判定非內源的內皮細胞是否是血管的一部分。注射後兩個月，在使用Lin-HSC組合物注射的眼視網膜中觀察到CD-31陽性、Tie-2-GFP陰性的血管(圖5b)。有趣的是，多數修復的血管含有Tie-2-GFP陽性細胞(圖5c)。如同平滑肌肌動蛋白染色所測定的那樣，不管是否有血管修復，周細胞的分布並沒有因為注射Lin-HSC而發生改變(圖5d)。這些數據清晰的表明了玻璃體內所注射的本發明的Lin-HSC組合物可移至視網膜，參與正常視網膜血管的形成，並在遺傳缺陷的小鼠中穩定內源的變性血管。
通過注射來自Lin-HSC的轉染細胞抑制視網膜血管新生多數視網膜血管疾病涉及異常的血管增生而不是變性。可以使用作用於星型膠質細胞的轉基因細胞釋放一種抗血管新生蛋白並抑制血管新生。使用T2色氨醯-轉移核糖核酸合成酶(T2-TrpRS)轉染來自Lin-HSC組合物的細胞。T2-TrpRS是可有效抑制視網膜血管新生的TrpRS的一個43kD的片段(圖6a)。在P12時，於P2時刻使用作為對照的質粒轉染的Lin-HSC組合物進行注射的眼視網膜具有正常的原發(圖6c)與次級(圖6d)視網膜血管叢。使用本發明的T2-TrpRS轉染的Lin-HSC組合物注射到P2時的眼中並在10天後進行評估，原發網絡明顯異常(圖6e)並且深層視網膜血管的形成幾乎完全被抑制(圖6f)。在這些眼中觀察到的很少量的血管明顯被血管間的大段間隔所削弱。分泌T2-TrpRS的Lin-HSC的抑制範圍在表2中詳述。
在體外Lin-HSC組合物中的細胞產生並分泌T2-TrpRS，將這些轉染細胞注射到玻璃體後，在視網膜中觀察到一條30kD的T2-TrpRS片段(圖6b)。僅在使用本發明中轉染的Lin-HSC注射的視網膜中可特異觀察到這條30kD的片段，而且相對於重組或體外合成蛋白，這種表觀分子量的降低可能是由於T2-TrpRS在體內進行了加工或降解。這些數據表明Lin-HSC組合物可以通過作用於活性星型膠質細胞將表達血管抑制分子的基因這樣的在功能上有作用的基因遞送至視網膜血管。雖然所觀察到的血管抑制效果可能是由於細胞介導的活性所致，不過由於使用同樣的、只是沒有T2轉染的Lin-HSC組合物進行治療的眼具有正常的視網膜血管，因此這種可能性極低。
表2分泌T2-TrpRS的Lin-HSCs對血管的抑制


玻璃體內注射的Lin-HSC群定位於視網膜星型膠質細胞，整合至血管中，並能用於治療多種視網膜疾病。當絕大多數注射的HSC組合物附著於星型膠質細胞模板時，少量細胞移至視網膜深層，定植於深層血管網絡隨後將發育的區域。即使在出生後42天之前沒有在這一區域觀察到GFAP陽性的星型膠質細胞，也不能排除GFAP陰性的神經膠質細胞已經存在並提供Lin-HSC定位信號的可能性。以前的研究已經表明許多疾病同活化的神經膠質增生相關聯。特別地，在DR中，神經膠質細胞及其胞外基質同病理性血管新生有關聯。
由於所注射的Lin-HSC組合物中的細胞特異性地附著於表達GFAP的神經膠質細胞，因此不管什麼類型的損傷，均可使用本發明的Lin-HSC組合物作用於視網膜中將發生血管新生的病灶。例如，在諸如糖尿病這樣的局部缺血的視網膜病變中，新血管的形成是對缺氧的一種應答。通過用Lin-HSC組合物作用於病理性新生血管位點，可以穩定發育中的新生血管從而防止諸如出血或水腫(同DR相關的視覺喪失的原因)這樣的新生血管異常並能潛在地緩解最初刺激新生血管形成的缺氧症。異常血管能夠回復到正常狀態。此外，可以通過使用轉染的Lin-HSC組合物以及雷射誘導的星型膠質細胞的活化將諸如T2-TrpRS這樣的血管抑制蛋白傳遞到病理性血管新生的位點。由於雷射凝固普遍應用在臨床眼科學上，該方法在許多視網膜疾病上都有應用。這些基於細胞的方法已經用於癌症治療的研究，由於眼內注射使得將大量細胞直接注入發病位點成為可能，這些方法在眼疾上的用途更為有利。
Lin-HSC的神經營養與血管營養修復MACS用於分離來自上述的增強綠色螢光蛋白(eGFP)、C3H(rd/rd)、FVB(rd/rd)小鼠骨髓中的Lin-HSC。取自這些小鼠的含EPC的Lin-HSC通過玻璃體內注射至P6時的C3H或FVB小鼠眼中。在注射後的多個時間點上(1個月、2個月及6個月)收集視網膜。通過使用針對CD31的抗體染色後利用掃描雷射共聚焦顯微鏡、以及使用DAPI進行核染色後的視網膜組織學，來對血管進行分析。還使用取自不同時間點上的視網膜中的mRNA的微陣列基因表達分析來鑑定潛在地同這種效應相關的那些基因。
至P21時rd/rd小鼠的眼睛患有神經感覺細胞及視網膜血管深度變性。於P6時使用Lin-HSC進行治療的rd/rd小鼠的眼睛維持正常的視網膜血管結構達6個月之久；在所有時間點上(1M、2M與6M)與對照相比較，深層與中間層都有顯著改善(參見圖12)。此外，我們觀察到使用Lin-HSC治療的視網膜要更厚一些(1M；1.2倍，2M；1.3倍，6M；1.4倍)，而且與作為對照的使用Lin+HSC進行處理的眼相比，在外核層具有更多數目的細胞(1M；2.2倍，2M；3.7倍，6M；5.7倍)。同對照(未處理或者未用Lin-處理)rd/rd視網膜相比，對「修復的」視網膜(例如，Lin-HSC)所進行的大規模基因組分析表明編碼sHSPs(小熱激蛋白)的基因，以及包括編碼圖20中插圖A與B中蛋白的基因在內的、同血管與神經修復相關的特異的生長因子的基因，都有明顯上調。
本發明中來源於骨髓的Lin-HSC群明顯且可重複地促使正常血管的維持，並顯著增加rd/rd小鼠中光感受器及其它神經細胞層。這種同小熱激蛋白的顯著上調相關的神經營養修復效果提供了探索目前無法治癒的視網膜變性病症的治療方法。
Rd1/rd1小鼠視網膜表現出深度血管及神經變性小鼠中正常的出生後視網膜血管與神經發育已有詳細描述，與在末三個月時的人類胎兒中所觀察到的類似(Dorrell等.，2002，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.433500-3510)。Rd1基因為純合子的小鼠具有很多人視網膜變性的特徵(Frasson等.，1999，Nat.Med.51183-1187)，並表現出同由於編碼PR cGMP磷酸二酯酶的基因突變所導致的與急性血管萎縮並發的快速光感受器(PR)喪失(Bowes等.1990，Nature347677-680)。為了檢查視網膜發育中的血管及其隨後的變性，使用作為成熟血管的胞外基質(ECM)蛋白的抗膠原蛋白IV(CIV)的抗體，以及內皮細胞的標記物CD31(PECAM-1)(圖15)。直至大概出生後8天，含光感受器的外核層(ONL)開始變性時，rd1/rd1(C3H/HeJ)的視網膜一直正常發育。ONL快速變性，細胞通過細胞凋亡而死亡，至P20時僅餘下一個單個的核層。使用抗體CIV及CD31對視網膜全樣載片進行雙染色，顯示了rd1/rd1小鼠中血管變性的細節同其他人所描述的相似(Blanks等.，1986，J.Comp.Neurol.254543-553)。儘管在P12之後沒有CD31著色證明了內皮細胞快速損失，但原發和深層視網膜血管層看起來仍發育正常。CD31陽性的內皮細胞在直至P12期間一直以正常分布狀態存在，但在此之後快速消失，CIV陽性染色在所檢查的時間點始終存在，說明血管及相關的ECM正常形成，但在P13--至這個時間沒有CD31陽性細胞被觀察到--之後僅有基質。(圖15，中圖)。中間血管叢在P21之後也變性，但進度要慢於在深層中所觀察到的(圖15，上圖)。給出了正常小鼠的視網膜血管與神經細胞層以同rd1/rd1小鼠進行比較(右圖，圖15)。
來源於骨髓的Lin-HSC在rd1/rd1小鼠中的神經保護效應玻璃體內注射的Lin-HSC整合到內源視網膜血管全部三層血管叢中，防止血管變性。有趣的是，所注射的細胞實際上在外核層中從未觀察到過。這些細胞或整合到形成中的視網膜血管，或在這些血管附近被觀察到。小鼠Lin-HSCs(來自C3H/HeJ)於變性剛要開始前的P6時刻玻璃體內注射到C3H/HeJ(rd1/rd1)小鼠眼中。至P30時，使用對照細胞(CD31-)注射的眼表現出典型的rd1/rd1表型，也就是說，在每一個檢查的視網膜中均觀察到深層血管叢及ONL幾乎完全變性。使用Lin-HSCs注射的眼則維持了看上去正常的中間及深層血管叢。令人驚訝的是，在使用Lin-HSC注射的眼的內核層(INL)與ONL中，同作為對照的注射了細胞的眼(圖16A)相比，明顯觀察到更多的細胞。Lin-HSCs的這種修復效應可以在注射後2個月時觀察到(圖16B)，並持續長達6個月(圖16C)。當修復的與未修復的眼進行比較時，在所有進行測量的時間點上都發現注射了Lin-HSC的眼中中間與深層血管叢中的血管、以及含有神經細胞的INL與ONL，其中差異非常明顯(圖16B與C)。通過測量血管的總長度(圖16D)並對ONL中觀察到的DAPI陽性細胞核進行計數(圖16E)來對這種效應進行量化。利用所有時間點上的數據進行簡單的線性回歸分析。
在注射Lin-HSC的眼中(圖16F)，P30(p＜0.024)及P60(p＜0.034)時的血管修復與神經(例如，ONL厚度)修復之間觀察到統計學上顯著的相關。當P180時比較注射Lin-HSC的視網膜與作為對照的注射了細胞的視網膜，儘管不具有統計學上的顯著性(p＜0.14)，其相關性還是很高的。相反，作為對照的注射了細胞的視網膜在任何時間點上的血管與ONL維持之間沒有表現出顯著的相關(圖16F)。這些數據表明玻璃體內注射Lin-HSC導致rd1/rd1小鼠視網膜中伴發的視網膜血管及神經修復。在ONL中或者其它位於視網膜血管內部或臨近視網膜血管的任何地方，都沒有觀察到注射的細胞。
注射Lin-HSC的rd/rd視網膜的功能性修復對注射對照細胞或者鼠Lin-HSCs(圖17)兩個月後的小鼠做視網膜電流圖(ERGs)。ERG記錄後對每隻眼進行免疫組織化學與顯微分析，以確認已發生血管及神經修復。來自治療的、修復的以及對照的、未修復的眼中的具代表性的ERG記錄顯示，在修復的眼中，數字基底信號(治療的減去未治療的眼)產生一個8-10微伏幅度的可清晰檢測的信號(圖17)。毫無疑問，來自兩個眼睛的信號是非常不同的。然而，從使用Lin-HSC治療的眼中可記錄到一致的可檢測的ERGs。在所有例子中，來自對照眼的ERG是無法檢測的。雖然修複眼中的信號幅度遠低於正常眼，但無論何時只要是組織修復就可以始終觀察到信號，而且信號與其他人報導的基於基因修復的研究中的幅度是一類的。所有的這些結果證實了使用本發明Lin-HSCs進行治療的眼中在某種程度上的功能性修復。
來自人骨髓(hBM)的Lin-HSCs也可以修復變性的視網膜從人骨髓中分離的Lin-HSCs與鼠Lin-HSCs具有相似的作用。從捐贈人那裡收集骨髓，除去Lin+HSCs，從而產生人Lin-HSCs(hLin-HSCs)群。
這些細胞使用先體內後體外地用螢光染料進行標記，然後注射至C3SnSmn.CB17-Prkdc SCID小鼠眼中。注射的Lin-HSCs以與注射鼠Lin-HSCs時相同的方式移至並作用於視網膜血管新生的位點(圖18A)。除了所作用的血管外，人Lin-HSCs對rd/rd小鼠的血管及神經細胞層也提供了一種有力的修復效果(圖18B與C)。這個觀察證實了在人骨髓中存在能夠作用於視網膜血管並防止視網膜變性的細胞。
Lin-HSCs在rd10/rd10小鼠中具有血管及神經營養效果雖然rd1/rd1小鼠是應用最為廣泛的、描述最詳盡的用於視網膜變性的模型(Chang等.2002，Vision Res.42517-525)，但變性非常迅速，在這點上與通常在人疾病中觀察到的更慢時間過程不同。在這個品系中，光感受器細胞在視網膜血管仍在快速延伸的P8時刻左右開始變性(圖15)。與在絕大多數患有這種疾病的人中所觀察到的不同，即便在中間血管叢還在形成時仍發生後續的深層視網膜血管變性，這樣，rd1/rd1小鼠的視網膜永遠無法徹底發育。一個具有更慢時間的變性過程以及更類似人視網膜變性狀態的rd10小鼠模型，被用來研究Lin-HSC介導的血管修復。在rd10小鼠中，光感受器細胞於P21左右開始變性，其後不久便開始血管變性。
在正常感覺神經的視網膜發育至P21大體完成之後，觀察到變性在視網膜徹底分化後便開始發生，而且以這種方式進行的變性比rd1/rd1小鼠模型更接近人視網膜變性。將來自rd10小鼠的Lin-HSCs或對照細胞注射至P6眼中，在不同時間點上對視網膜進行評估。在P21時，來自注射了Lin-HSC及對照細胞的眼的視網膜都表現正常，所有的血管層都完全發育，INL與ONL也正常發育(圖18D與18H)。在約P21時視網膜變性開始發生並隨時間加劇。至P30時，注射對照細胞的視網膜表現出嚴重的血管及神經變性(圖18I)，而注射Lin-HSC的視網膜保持幾乎正常的血管層與光感受器細胞(圖18E)。修復的與未修復的眼之間的不同在後面的時間點上更加顯著(對比一下圖18F及18G與18J及18K)。在對照處理的眼中，通過CD31與膠原蛋白IV的免疫組織化學染色可以十分清楚地觀察到血管變性的發展(圖18I-K)。對照處理的眼幾乎完全是CD31陰性，但膠原蛋白陽性血管的「軌跡」仍然明顯，表明發生的是血管退化，而不是未完成的血管形成。相反，Lin-HSC治療的眼同時具有與正常的、野生型的眼非常相似的CD31及膠原蛋白IV陽性血管(對比一下圖18F與18I)。
使用Lin-HSC治療後rd/rd小鼠視網膜的基因表達分析使用大量基因組(微陣列分析)分析修復的與未修復的視網膜，以識別神經營養修復中可能的介質。使用Lin-HSCs治療的rd1/rd1小鼠視網膜中的基因表達與未注射的視網膜以及使用對照細胞(CD31-)進行注射的視網膜進行比較。這些比較每個都是一式三份。在所有三份樣品中，要求基因的表達水平至少要比背景水平高出2倍，才可認定其存在。Lin-HSC保護的視網膜同對照中注射了細胞的及未注射的rd/rd小鼠視網膜相比，其中上調了3倍的基因如圖20中插圖A與B所示。許多顯著上調的基因，包括MAD及Ying Yang-1(YY-1)，編碼功能與保護細胞避免細胞凋亡相關的蛋白。使用Lin-HSC治療的視網膜中，與已知參與應激時保護細胞的熱激蛋白具有序列同源性和相似功能的許多晶體蛋白基因也被上調。α晶體蛋白的表達通過免疫組織化學分析定位在ONL(圖19)。
將使用人Lin-HSCs修復的來自rd1/rd1小鼠視網膜的信使RNA雜交到人特異性的Affymetrix U133A微陣列晶片上。經嚴緊分析後，發現了許多基因，其mRNA的表達是人特異性的、高於背景、而且與鼠Lin-HSC修復的視網膜及人對照的注射了細胞但未修復的視網膜相比，在人Lin-HSC修復的視網膜中明顯更高(圖20，插圖C)。一種表達在原生的及最新分化的CD34+造血幹細胞表面的細胞粘連分子CD6，與另一個由造血幹細胞表達的基因幹擾素α13，是通過微陣列生物信息學技術發現的，驗證了評估方案的有效性。此外，人Lin-HSC修復的小鼠視網膜樣品中幾個生長因子及神經營養因子的表達高於背景(圖20，插圖D)。
討論使用譜系定型的造血細胞標記來負選擇來源於骨髓的含EPC的Lin-HSC群。雖然可用作EPC的來源於骨髓的Lin-HSC亞群未被經常用的細胞表面標記所表徵，但這些細胞在發育中或受損視網膜血管中的行為與在Lin+或成熟內皮細胞群中觀察到的完全不同。這些細胞選擇性地作用於視網膜血管新生的位點並參與新血管的形成。
遺傳性視網膜變性疾病通常伴發視網膜血管損傷。對這類疾病進行有效治療要求功能恢復以及維持複雜組織構造。最近幾項研究已經發現，使用營養因子或者幹細胞本身，或二者的組合這樣的基於細胞的傳遞可能是必須的。例如，使用生長因子療法去治療視網膜變性疾病，會導致血管發生當正常視網膜組織構造受到嚴重破壞時才出現的血管不受控制的過渡生長。使用神經或視網膜幹細胞治療視網膜變性疾病可能會重建神經功能，但具有功能的血管也是維持視網膜功能完整性所必需的。整合到rd/rd小鼠視網膜血管的來自本發明中Lin-HSCs的細胞在不破壞視網膜結構的情況下可穩定變性的血管。當細胞注射到P15時的rd/rd小鼠時也觀察到這種修復效果。自從rd/rd小鼠中於P16時開始發生血管變性後，這個觀察結果開啟了使用Lin-HSC進行有效治療的窗口。在注射了本發明的Lin-HSC的眼中視網膜神經元與光感受器得以保存，視覺功能得以維持。
來源於成熟骨髓的Lin-HSCs在玻璃體內注射至患有視網膜變性疾病的小鼠中時，會導致複雜的血管及神經營養效應。在完全的視網膜變性之前(指在通常至出生後30天便表現出完全的視網膜變性的小鼠中，從出生至出生後16天的這段時間)注射Lin-HSCs，修復效應在治療後能持續多達6個月而且大多數都有效。在兩個視網膜變性的小鼠模型中觀察到這種修復，而且不尋常的是，當受體是免疫缺陷且患有視網膜變性的嚙齒類動物時(譬如，SCID小鼠)，或者供體是患有視網膜變性的小鼠時，來源於成人骨髓的HSCs能夠完成這種修復。雖然最近幾個報導描述了利用野生型基因的基於病毒的基因修復在患有視網膜變性的小鼠中或狗中的部分表型修復(Ali等2000，Nat Genet25306-310；Takahashi等.1999，J.Virol.737812-7816；Acland等.2001，Nat.Genet.2892-95.)，但本發明仍是第一個通過血管修復而獲得的基於細胞的基因治療的效應。因此，這樣一個能夠治療具共有超過100個已知相關突變的一組疾病的方法，其潛在應用要比創建針對每個已知突變的單個基因療法更具實用價值。
神經營養修復效應的確切的分子基礎還不清楚，但只有當存在伴發的血管穩定/修復時才觀察得到。存在注射的幹細胞本身並不足以產生神經營養修復，在外核層中明顯不存在來源於幹細胞的神經元排除了所注射的細胞轉變為光感受器的可能性。由微陣列基因表達分析獲得的數據表明已知具有抗細胞凋亡效應的基因明顯上調。由於在視網膜中觀察到的絕大多數神經死亡是通過細胞凋亡的方式進行的，這種保護也許在延長光感受器以及其它在這些疾病中威脅到視覺功能的神經元的壽命方面具有重大療效。C-myc是一種通過上調多種下遊細胞凋亡誘導的因子來參與細胞凋亡的轉錄因子。C-myc的表達在rd/rd小鼠中超過野生型，增加了4.5倍，表明它可能參與在rd/rd小鼠中觀察到的光感受器變性。已知兩個在Lin-HSC保護的視網膜中顯著上調的基因Madl與YY-1(圖20，插圖A)，可以抑制c-myc的活性，從而抑制c-myc誘導的凋亡。
Madl的過量表達也表現出抑制Fas誘導的另一種細胞凋亡途徑的危險組分caspase-8的活性。這兩種分子的上調可以通過防止rd/rd小鼠中通常會導致變性的細胞凋亡的引發，從而在保護視網膜不發生血管及神經變性方面發揮作用。
另一組在Lin-HSC保護的視網膜中被大量上調的基因包括晶體蛋白家族的成員(圖20，插圖B)。與熱激蛋白及其它應激誘導的蛋白相似，晶體蛋白可以被視網膜應激激活，並提供防止細胞凋亡的保護效應。在視網膜營養失調的鼠模型中，αA-晶體蛋白的異常低表達同光感受器損傷相關，最近一個rd/rd小鼠視網膜的蛋白質組學分析表明晶體蛋白上調的誘導是對視網膜變性的應答。根據我們的EPC修復的rd/rd小鼠視網膜的微陣列數據，晶體蛋白的上調看起來在EPC介導的視網膜神經保護方面起重要作用。
諸如c-my、Madl、Yx-1及晶體蛋白這樣的基因，可能是神經修復的下遊介質。神經營養試劑能夠調節抗細胞凋亡基因的表達，儘管我們的使用小鼠幹細胞來進行修復的視網膜的微陣列分析並未表明已知的神經營養因子在增強水平上的誘導。在另一方面，使用人特異性晶片對來源於人骨髓的幹細胞所介導的修復進行分析，表明多個生長因子基因的表達雖然低，但仍有顯著增加。
上調的基因包括成纖維細胞生長因子家族的幾個成員與otoferlin。在otoferlin基因中的突變與遺傳紊亂相關，會導致由於聽覺神經疾病的耳聾。可能是由於注射了Lin-HSCs，otoferlin的產量也有助於視網膜神經疾病的預防。在歷史上，很長時間都認為在視網膜變性的病人及動物中觀察到的血管變化，是由於光感受器死亡所導致新陳代謝需求減少的間接結果。本文數據表明，至少對於患有遺傳性視網膜變性的小鼠，保持正常的血管也可以幫助維持外核層的組分。近來文獻報導支持組織特異性血管具有比預想的簡單為血管提供「養份」更強的營養效應這種觀念。例如，在VEGFR1激活後，肝內皮細胞能夠被誘導產生在面臨肝損傷時緊急應對肝細胞再生與維持的生長因子(LeCouter等.2003，Science 299890-893)。
已報導在功能性血管形成之前，血管內皮細胞與鄰近的肝實質細胞之間的相似指示作用與肝器官形成有關。在發生視網膜變性的個體中內源視網膜血管可能不會促進如此劇烈的修復，但如果該含有來源於骨髓幹細胞群的內皮祖先的血管是板狀的，它們會使血管對變性具有更強抗性，同時會促進視網膜神經以及血管的存活。在患有視網膜變性的人中，推遲完全視網膜變性的起始時間，可提供超出預期多年的視覺能力。使用本發明Lin-HSCs治療的動物明顯維持了足以支撐其視力的ERG。
在臨床上，光感受器與其它神經元受到真正損傷而視覺功能卻仍能保持將會受到廣泛重視。在某些狀況下，關鍵的閾值交織在一起，從而喪失視覺。由於幾乎所有的人遺傳性視網膜變性發病早，但過程緩慢，因此通過鑑定視網膜變性的個體、使用玻璃體內注射自體的骨髓幹細胞移植物來治療變性、進而延遲與視覺損傷伴發的視網膜變性，是非常可能的。為了增強這些幹細胞的尋靶與整合，需要存在有活性的星型膠質細胞。這在存在相關的神經膠質增生時可通過早期治療來實現，或者通過使用雷射刺激活性星型膠質細胞局部增殖來實現。
本發明的Lin-HSC群含有能夠通過作用於活性星型膠質細胞來促進血管新生並在沒有破壞視網膜結構的情形下整合到已存在模板中的EPC群。本發明的Lin-HSC群在患有視網膜變性的眼中還提供了一種不尋常的長期神經營養修復效應。此外，遺傳上改進的、自體含EPC的Lin-HSC組合物能夠接種至局部缺血或者發生異常血管形成的眼中，並能穩定整合到新血管中，並且在很長時間周期內局部持續釋放治療分子。這些局部釋放的基因，能以生理學上有意義的劑量來表達藥理學的物質，它們為治療目前無法治癒的眼疾提供了一個新的範例。
上述實施例中的眾多變化及修飾在不背離本發明新特徵的精神與範圍時是有效的。關於本文給出的特殊實施例，不是，也不應推斷為對本發明的限制。
序列表110The Scripps Research InstituteFriedlander，MartinOtani，AtsushiDaSilva，KarenMoreno，Stacey(Hanekamp)120造血幹細胞及其治療新生血管性眼疾的方法130TSRI-988.115010/628,7831512003-07-2515060/467,0511512003-05-0215060/398,5221512002-07-251602170FastSEQ for Windows Version 4.021012114742212DNA213人工序列220
223編碼His-標記的人T2-TrpRS的DNA4001tggcgaatgg gacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg 60cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc 120ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg 180gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc 240acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt 300ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc 360ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta 420acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaatttcag gtggcacttt 480
tcggggaaat gtgcgcggaa cccctatttg tttatttttc taaatacatt caaatatgta 540tccgctcatg agacaataac cctgataaat gcttcaataa tattgaaaaa ggaagagtat 600gagtattcaa catttccgtg tcgcccttat tccctttttt gcggcatttt gccttcctgt 660ttttgctcac ccagaaacgc tggtgaaagt aaaagatgct gaagatcagt tgggtgcacg 720agtgggttac atcgaactgg atctcaacag cggtaagatc cttgagagtt ttcgccccga 780agaacgtttt ccaatgatga gcacttttaa agttctgcta tgtggcgcgg tattatcccg 840tattgacgcc gggcaagagc aactcggtcg ccgcatacac tattctcaga atgacttggt 900tgagtactca ccagtcacag aaaagcatct tacggatggc atgacagtaa gagaattatg 960cagtgctgcc ataaccatga gtgataacac tgcggccaac ttacttctga caacgatcgg 1020aggaccgaag gagctaaccg cttttttgca caacatgggg gatcatgtaa ctcgccttga 1080tcgttgggaa ccggagctga atgaagccat accaaacgac gagcgtgaca ccacgatgcc 1140tgcagcaatg gcaacaacgt tgcgcaaact attaactggc gaactactta ctctagcttc 1200ccggcaacaa ttaatagact ggatggaggc ggataaagtt gcaggaccac ttctgcgctc 1260ggcccttccg gctggctggt ttattgctga taaatctgga gccggtgagc gtgggtctcg 1320cggtatcatt gcagcactgg ggccagatgg taagccctcc cgtatcgtag ttatctacac 1380gacggggagt caggcaacta tggatgaacg aaatagacag atcgctgaga taggtgcctc 1440actgattaag cattggtaac tgtcagacca agtttactca tatatacttt agattgattt 1500aaaacttcat ttttaattta aaaggatcta ggtgaagatc ctttttgata atctcatgac 1560caaaatccct taacgtgagt tttcgttcca ctgagcgtca gaccccgtag aaaagatcaa 1620aggatcttct tgagatcctt tttttctgcg cgtaatctgc tgcttgcaaa caaaaaaacc 1680accgctacca gcggtggttt gtttgccgga tcaagagcta ccaactcttt ttccgaaggt 1740aactggcttc agcagagcgc agataccaaa tactgtcctt ctagtgtagc cgtagttagg 1800ccaccacttc aagaactctg tagcaccgcc tacatacctc gctctgctaa tcctgttacc 1860agtggctgct gccagtggcg ataagtcgtg tcttaccggg ttggactcaa gacgatagtt 1920accggataag gcgcagcggt cgggctgaac ggggggttcg tgcacacagc ccagcttgga 1980gcgaacgacc tacaccgaac tgagatacct acagcgtgag ctatgagaaa gcgccacgct 2040tcccgaaggg agaaaggcgg acaggtatcc ggtaagcggc agggtcggaa caggagagcg 2100cacgagggag cttccagggg gaaacgcctg gtatctttat agtcctgtcg ggtttcgcca 2160cctctgactt gagcgtcgat ttttgtgatg ctcgtcaggg gggcggagcc tatggaaaaa 2220cgccagcaac gcggcctttt tacggttcct ggccttttgc tggccttttg ctcacatgtt 2280ctttcctgcg ttatcccctg attctgtgga taaccgtatt accgcctttg agtgagctga 2340taccgctcgc cgcagccgaa cgaccgagcg cagcgagtca gtgagcgagg aagcggaaga 2400gcgcctgatg cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatatatgg 2460tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa gccagtatac actccgctat 2520cgctacgtga ctgggtcatg gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 2580gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 2640gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctg cggtaaagct 2700catcagcgtg gtcgtgaagc gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt 2760tgagtttctc cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg 2820ttttttcctg tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa 2880tgataccgat gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc 2940ggttactgga acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa 3000aaatcactca gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta 3060gccagcagca tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg 3120
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223His-標記的人T2-TrpRS4002Met Ser Ala Lys Gly Ile Asp Tyr Asp Lys Leu Ile Val Arg Phe Gly1 5 10 15Ser Ser Lys Ile Asp Lys Glu Leu Ile Asn Arg Ile Glu Arg Ala Thr20 25 30Gly Gln Arg Pro His His Phe Leu Arg Arg Gly Ile Phe Phe Ser His35 40 45
Arg Asp Met Asn Gln Val Leu Asp Ala Tyr Glu Asn Lys Lys Pro Phe50 55 60Tyr Leu Tyr Thr Gly Arg Gly Pro Ser Ser Glu Ala Met His Val Gly65 70 75 80His Leu Ile Pro Phe Ile Phe Thr Lys Trp Leu Gln Asp Val Phe Asn85 90 95Val Pro Leu Val Ile Gln Met Thr Asp Asp Glu Lys Tyr Leu Trp Lys100 105 110Asp Leu Thr Leu Asp Gln Ala Tyr Gly Asp Ala Val Glu Asn Ala Lys115 120 125Asp Ile Ile Ala Cys Gly Phe Asp Ile Asn Lys Thr Phe Ile Phe Ser130 135 140Asp Leu Asp Tyr Met Gly Met Ser Ser Gly Phe Tyr Lys Asn Val Val145 150 155 160Lys Ile Gln Lys His Val Thr Phe Asn Gln Val Lys Gly Ile Phe Gly165 170 175Phe Thr Asp Ser Asp Cys Ile Gly Lys Ile Ser Phe Pro Ala Ile Gln180 185 190Ala Ala Pro Ser Phe Ser Asn Ser Phe Pro Gln Ile Phe Arg Asp Arg195 200 205Thr Asp Ile Gln Cys Leu Ile Pro Cys Ala Ile Asp Gln Asp Pro Tyr210 215 220Phe Arg Met Thr Arg Asp Val Ala Pro Arg Ile Gly Tyr Pro Lys Pro225 230 235 240Ala Leu Leu His Ser Thr Phe Phe Pro Ala Leu Gln Gly Ala Gln Thr245 250 255Lys Met Ser Ala Ser Asp Pro Asn Ser Ser Ile Phe Leu Thr Asp Thr260 265 270Ala Lys Gln Ile Lys Thr Lys Val Asn Lys His Ala Phe Ser Gly Gly275 280 285Arg Asp Thr Ile Glu Glu His Arg Gln Phe Gly Gly Asn Cys Asp Val290 295 300Asp Val Ser Phe Met Tyr Leu Thr Phe Phe Leu Glu Asp Asp Asp Lys305 310 315 320Leu Glu Gln Ile Arg Lys Asp Tyr Thr Ser Gly Ala Met Leu Thr Gly325 330 335Glu Leu Lys Lys Ala Leu Ile Glu Val Leu Gln Pro Leu Ile Ala Glu340 345 350His Gln Ala Arg Arg Lys Glu Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Glu Phe355 360 365Met Thr Pro Arg Lys Leu Ser Phe Asp Phe Gln Lys Leu Ala Ala Ala370 375 380Leu Glu His His His His His His385 390
權利要求
1.轉染的譜系陰性的造血幹細胞群，包含造血幹細胞的幹細胞群與內皮祖細胞，其中來源於幹細胞群的細胞表達治療上有用的人色氨醯-tRNA合成酶(TrpRS)的抗血管新生蛋白片段。
2.權利要求1的轉染的幹細胞群，其中TrpRS片段選自T2-TrpRS(SEQ ID NO3)及T2TrpRS-GD(SEQ ID NO4)。
3.權利要求1的轉染的幹細胞群，其中至少約20％的細胞表達表面抗原CD31。
4.權利要求1的轉染的幹細胞群，其中至少約50％的細胞表達表面抗原CD31。
5.權利要求1的轉染的幹細胞群，其中至少約75％的細胞表達表面抗原CD31。
6.權利要求1的轉染的幹細胞群，其中至少約50％的細胞表達表面抗原整聯蛋白α6。
7.權利要求1的轉染的幹細胞群，其中細胞來源於成熟骨髓。
8.權利要求1的轉染的幹細胞群，其中細胞是鼠的細胞。
9.權利要求8的轉染的幹細胞群，其中至少約50％的細胞表達表面抗原CD31，並且至少約50％的細胞表達表面抗原CD117。
10.權利要求8的轉染的幹細胞群，其中至少約65％的細胞表達表面抗原CD117。
11.權利要求8的轉染的幹細胞群，其中至少約80％的細胞表達表面抗原CD31，並且至少約70％的細胞表達表面抗原CD117。
12.權利要求1的轉染的幹細胞群，其中所述細胞是人類細胞。
13.權利要求12的轉染的幹細胞群，其中所述細胞為CD133陰性，至少約50％的細胞表達表面抗原整聯蛋白α6，並且至少約50％的細胞表達表面抗原CD31。
14.權利要求12的轉染的幹細胞群，其中細胞為CD133陽性，少於約30％的細胞表達表面抗原整聯蛋白α6，並且少於約30％的細胞表達表面抗原CD31。
15.權利要求1的轉染的幹細胞群，其進一步包括一種細胞培養基。
16.權利要求1的轉染的幹細胞群，其中所述細胞群使用可操作地編碼神經營養劑的DNA進一步轉染。
17.權利要求16的轉染的幹細胞群，其中所述神經營養劑選自神經生長因子、神經營養蛋白-3、神經營養蛋白-4、神經營養蛋白-5、睫狀神經營養因子、視網膜色素上皮衍生的神經營養因子、胰島素樣生長因子、神經膠質細胞系衍生的神經營養因子、腦衍生神經營養因子。
18.一種在哺乳動物中治療眼疾的方法，包括通過以下步驟從哺乳動物骨髓中分離含內皮祖細胞的譜系陰性的造血幹細胞群(a)從患有眼疾的哺乳動物中抽取骨髓；(b)從骨髓中分離多種類型單核細胞；(c)使用針對一個或多個譜系表面抗原的生物素聯接的譜系群體抗體來標記單核細胞，譜系表面抗原選自CD2、CD3、CD4、CD11、CD11a、Mac-1、CD14、CD16、CD19、CD24、CD33、CD36、CD38、CD45、Ly-6G、TER-119、CD45RA、CD56、CD64、CD68、CD86、CD66b、HLA-DR及CD235a；(d)從多種類型單核細胞中除去上述一種或多種譜系表面抗原為陽性的單核細胞，並回收含有內皮祖細胞的譜系陰性的造血幹細胞群；(e)使用可操作地編碼人色氨醯-tRNA合成酶(TrpRS)的抗血管新生蛋白片段的基因轉染步驟(d)中收集到的譜系陰性的造血幹細胞；並且(f)隨後將來自經轉染的細胞群中的細胞以足以抑制疾病效果的量玻璃體內注射到哺乳動物眼中。
19.權利要求18的方法，其中TrpRS片段選自T2-TrpRS(SEQ IDNO3)及T2-TrpRS-GD(SEQ ID NO4)。
20.權利要求18的方法，其中疾病選自視網膜變性疾病、視網膜血管變性疾病、局部缺血性視網膜病變、血管出血、血管滲漏、脈絡膜病變、年齡相關性黃斑變性、糖尿病視網膜病變、擬眼組織胞漿菌病、早產兒視網膜病、鐮狀細胞貧血及色素性視網膜炎。
21.一種將轉基因傳遞到哺乳動物視網膜血管的方法，包括將權利要求1的經轉染的譜系陰性的造血幹細胞群玻璃體內注射至哺乳動物眼中。
22.權利要求21的方法，其中經轉染的幹細胞群表達選自T2-TrpRS(SEQ ID NO3)及T2-TrpRS-GD(SEQ ID NO4)的TrpRS片段。
23.一種修復哺乳動物眼中神經網絡的方法，包括將權利要求1的經轉染的譜系陰性的造血幹細胞群玻璃體內注射至哺乳動物眼中。
24.權利要求23的方法，其中經轉染的幹細胞群表達選自T2-TrpRS(SEQ ID NO3)及T2-TrpRS-GD(SEQ ID NO4)的TrpRS片段。
25.一種修復哺乳動物眼中血管的方法，包括將權利要求1中轉染的譜系陰性的造血幹細胞群玻璃體內注射至哺乳動物眼中。
26.權利要求25的方法，其中轉染的幹細胞群表達選自T2-TrpRS(SEQ ID NO3)、T2-TrpRS-GD(SEQ ID NO4)、mini-TrpRS(SEQ ID NO5)及T1-TrpRS(SEQ ID NO6)的TrpRS片段。
27.一種在哺乳動物眼中刺激抗血管凋亡基因上調的方法，包括將權利要求1中譜系陰性的造血幹細胞群玻璃體內注射至哺乳動物眼中。
28.權利要求27的方法，其中經轉染的幹細胞群表達選自T2-TrpRS(SEQ ID NO3)及T2-TrpRS-GD(SEQ ID NO4)的TrpRS片段。
29.一種使TrpRS的抗血管新生蛋白片段定向傳遞到哺乳動物眼中星型膠質細胞的方法，包括將權利要求1中譜系陰性的造血幹細胞群玻璃體內注射至哺乳動物眼中。
30.權利要求29的方法，其中經轉染的幹細胞群表達選自T2-TrpRS(SEQ ID NO3)及T2-TrpRS-GD(SEQ ID NO4)的TrpRS片段。
全文摘要
分離的、哺乳動物的、來源於成熟骨髓的、含有內皮祖細胞(EPCs)的譜系陰性的造血幹細胞群(Lin
文檔編號C12N5/10GK1831119SQ200610067679
公開日2006年9月13日 申請日期2004年4月28日 優先權日2003年5月2日
發明者M·弗裡德蘭德, A·奧塔尼, K·達西爾瓦, 哈內坎普 申請人:斯克裡普斯研究學院