一種分泌效率和熱穩定性提高的普魯蘭酶突變體及其製備方法

2023-05-23 01:50:36

一種分泌效率和熱穩定性提高的普魯蘭酶突變體及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有高分泌效率和高熱穩定性普魯蘭酶突變體及其製備方法，屬於基因工程和酶工程領域。本發明通過結構域刪除突變提高了普魯蘭酶的分泌效率和熱穩定性，刪除的結構域為CBM41、X45、X25結構域或其組合，提供了一種能提高普魯蘭酶分泌效率及熱穩定性都得到提高的突變方案。本發明得到的普魯蘭酶結構域刪除突變體，至少以下性質之一發生改變：1）重組菌發酵後的胞外分泌效率提高；2）在pH4.0-5.0和60℃條件下的熱穩定性提高。這些結構域刪除突變體比天然普魯蘭酶更適用於普魯蘭酶的生產製備及應用。
【專利說明】一種分泌效率和熱穩定性提高的普魯蘭酶突變體及其製備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種普魯蘭酶的突變體及其製備方法，特別是利用蛋白質工程的結構域刪除方法來提高普魯蘭酶的分泌效率和熱穩定性的技術，屬於基因工程和酶工程領域。
【背景技術】
[0002]普魯蘭酶(EC3.2.1.41)是一種具有重要應用價值的澱粉脫支酶，它能夠水解普魯蘭多糖、支鏈澱粉、α-極限糊精等分子中的α_1，6葡萄糖苷鍵。普魯蘭酶適宜作用較低分子量糊精，其最小作用單位為麥芽糖基麥芽糖，主要用於和糖化酶復配製備葡萄糖。普魯蘭酶可以切斷澱粉中的分支點，加速後續酶的反應，縮短反應時間，提高澱粉的轉化率，降低其它糖化用酶製劑的使用量，從而達到增加產量、提高設備利用率、降低生產成本的目的。
[0003]發明人前期對來源於脫支芽孢桿菌(Bacillus deramifican)的普魯蘭酶進行了異源表達和定點突變改造，獲得了多個熱穩定性和催化性能得到提高的普魯蘭酶突變體(一種普魯蘭酶突變體及其製備方法.201210256804.9)。並通過發酵過程條件控制結合添加TwenSO和甜菜鹼的方式，優化了重組菌株發酵生產普魯蘭酶的發酵工藝(吳敬，陳晟，段緒果，陳堅.一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高澱粉脫支酶產量的方法，201210035298.0 ;吳敬，段緒果，陳晟，陳堅.一種重組澱粉脫支酶的發酵生產工藝，201210519218.9)。然而，發明人對重組普魯蘭酶在發酵上清及細胞組分中的比例進行分析發現重組菌胞外上清、胞內上清和胞內沉澱中的普魯蘭酶活力分別佔總酶活力的15.4%,47.1%和37.5%。可見重組普魯蘭酶的胞外分泌效率很低，大部分重組酶存在於細胞內部，並且其中還有很大一部分以不可溶的聚集體形式存在於細胞中。發酵後續處理過程中需要對菌體進行破碎等處理,來回收細胞內部的酶蛋白。然而大規模生產中細胞破碎的成本一般較高，而且細胞破碎過·程中條件往往比較劇烈，酶蛋白容易失活。如果酶蛋白在發酵過程中能夠主要分泌到胞外(培養基中)，後續分離純化過程就只需要經過簡單的菌體分離和濃縮，酶製劑的生產成本就可以顯著降低。
[0004]重組普魯蘭酶胞外分泌效率低的現象可能是由該酶自身胺基酸序列及空間結構決定的。研究表明，蛋白質分子量和結構複雜程度對其的可溶性表達及分泌效率都有很大的影響，分子量越大、結構越複雜的蛋白越容易形成不可溶的蛋白聚集體，而且胞外分泌效率更低。B.deramificans普魯蘭酶由928個胺基酸組成,分子量約為lOlkDa。對其蛋白結構模型分析發現，它具有6個結構域，分別為結構域CBM41、X25、X45、CBM48、A和C。CBM41和CBM48結構域分別屬於碳水化合物結合結構域41家族和48家族，都具有與澱粉底物結合功能，而X25和X45結構域功能未知。CBM48、A和C三個結構域聯繫緊密結合在一起形成一個整體，可能是保持普魯蘭酶蛋白結構及活性所必須的結構域；而CBM41和X25結構域之間通過柔性linker連接，具有較強的擺動性，對其進行切除後的普魯蘭酶蛋白截短突變體可能仍然可以保留脫支活性。發明人在B.deramificans普魯蘭酶蛋白模擬結構分析的基礎上，通過對其N端的CBM41、X25和X45結構域分別進行切除來提高普魯蘭酶的胞外分泌效率。

【發明內容】

[0005]本發明要解決的一個技術問題是提供一種天然普魯蘭酶N端結構域刪除的突變體，包括N端一個結構域(CBM41)、兩個結構域(CBM41和X25，CBM41和X45)刪除或者三個結構域(CBM41、X25和X45)刪除的突變體，突變體與親本普魯蘭酶相比有更高胞外分泌效率和熱穩定性。
[0006]所述親本基因與脫支芽孢桿菌普魯蘭酶一致，所述作為突變用的質粒模板為攜帶天然普魯蘭酶編碼基因的載體pulA/pET20b(+)(—種普魯蘭酶突變體及其製備方法.201210256804.9)。
[0007]本發明要解決的另一個技術問題是提供一種普魯蘭酶定點突變體(D437H/D503Y)的N端結構域刪除的的疊加突變體，包括N端一個結構域(CBM41)或者兩個結構域(CBM41和X25，CBM41和X45)刪除或三個結構域(CBM41、X25和X45)刪除的疊加突變體，疊加突變體與親本普魯蘭酶相比有更高胞外分泌效率和熱穩定性。
[0008]所述普魯蘭酶定點突變體(D437H/D503Y)的編碼基因與中國專利201210256804.9中的普魯蘭酶突變體D437H/D503Y的序列一致，所述作為突變的質粒模板為攜帶天然普魯蘭酶編碼基因的載體D437H/D503Y/pET-20b (+)(一種普魯蘭酶突變體及其製備方法.201210256804.9)。
[0009]本發明所要解決的的第三個技術問題是提供胞外分泌效率和熱穩定性都得到提高的N端結構域刪除的普魯蘭酶突變體的製備方法，本發明以普魯蘭酶定點突變體(D437H/D503Y)為例進行說明，保護範圍不限於此，包括如下步驟: [0010]I)在脫支芽孢桿菌普魯蘭酶胺基酸序列的基礎上確定要刪除的結構域及其對應的胺基酸序列；
[0011]2)設計N端結構域刪除突變的突變引物，以攜帶天然普魯蘭酶編碼基因的載體為模板進行基因擴增並構建含結構域刪除突變體的質粒載體；
[0012]3)將含有截短突變體編碼基因的質粒和含有疊加突變編碼基因的質粒轉化進宿主細胞；
[0013]4)挑選陽性克隆進行發酵培養，並純化普魯蘭酶突變體Puldl、Puld2、D437H/D503Y/dl 及 D437H/D503Y/d2。
[0014]將普魯蘭酶N端的CBM41—個結構域刪除，命名為Puldl ;將普魯蘭酶N端的CBM41和X25兩個結構域刪除，命名為Puld2 ;將普魯蘭酶N端的CBM41、X25和X45三個結構域刪除，命名為Puld3。
[0015]所述質粒載體為pET系列，pGEX系列，或或pUB系列中的任意一種。
[0016]所述的宿主細胞包括:細菌、酵母和真菌細胞，其也為本發明要求保護的範圍。
[0017]本發明構建了四個有意義的突變體，實現了普魯蘭酶胞外分泌效率和熱穩定性的提高。普魯蘭酶截短突變體的胞外分泌效率均有所提高，其中Puldl、Puld2、D437H/D503Y/dl和D437H/D503Y/d2的胞外酶佔總酶活力的比例分別為48.5%,58.7%,57.3%和60.8%,分別是相應親本普魯蘭酶的3.1,3.8,5.3和5.6倍。在pH4.5，60度的水浴中天然普魯蘭酶的半衰期為20h，N端結構域刪除突變體Puldl、Puld2的半衰期分別為57h和34h左右；D437H/D503Y的半衰期為120h，疊加突變體D437H/D503Y/dl和D437H/D503Y/d2的半衰期分別為203h和160h。其中D437H/D503Y/dl和D437H/D503Y/d2熱穩定性最好。結構域刪
除突變體和疊加突變體比親本普魯蘭酶更適合普魯蘭酶的胞外分泌生產和在澱粉糖化過程中的應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1天然普魯蘭酶及其截短突變體截短方式
[0019]圖2天然普魯蘭酶及其截短突變體發酵上清SDS-PAGE凝膠電泳
[0020]M，蛋白分子量標準；1，天然普魯蘭酶;2，Puldl ;3，Puld2 ;4，Puld3
[0021]圖3D437H/D503Y及疊加突變體發酵上清SDS-PAGE凝膠電泳
[0022]M，蛋白分子量標準；1，D437H/D503Y ;2，D437H/D503Y/dl ;3，D437H/D503Y/d2
[0023]圖4普魯蘭酶截短突變體的最適溫度
[0024]圖5普魯蘭酶截短突變體的熱穩定性
【具體實施方式】
[0025]實施例1:天然普魯蘭酶N端截短突變體的製備
[0026]( I)天然普魯蘭酶N端截短突變體的構建
[0027]來源於B.deramificans的普魯蘭酶的2種N端結構域刪除突變體Puldl和Puld2:
[0028]在不同來源普魯蘭酶序列比對分析的基礎上，對脫支芽孢桿菌普魯蘭酶蛋白結構進行模擬及分析，發現脫支芽孢桿菌普魯蘭酶具有6個結構域:CBM41、X25、X45、CBM48、A和C。其中蛋白N末端的CBM41、X25和X45結構域之間通過柔性linker連接，具有較強的擺動性；CBM41屬於碳水化合物結合結構域41家族，具有與澱粉底物結合功能，而X25和X45結構域功能未知。而CBM48、A和C三個結構域以非常緊密的方式聯繫在一起形成一個完整的整體，該結構具有底物結合及催化活性所必須功能。對N末端結構域進行刪除後的普魯蘭酶突變體可能仍然可以保留脫支活性。
[0029]將普魯蘭酶N端的CBM41—個結構域刪除，命名為Puldl ;將普魯蘭酶N端的CBM41和X25兩個結構域刪除，命名為Puld2 ;將普魯蘭酶N端的CBM41、X25和X45三個結構域刪除，命名為Puld3 (圖1)。
[0030]3種N端結構域刪除突變體Puldl，Puld2及Puld3的製備方法，根據B.deramificans普魯蘭酶的編碼基因序列，分別設計併合成引入Puldl,Puld2及Puld3結構域刪除突變的引物，對普魯蘭酶編碼基因進行刪除突變，測定DNA編碼序列，分別測序確認普魯蘭酶突變體Puldl的編碼基因(第I到第270位鹼基刪除);普魯蘭酶突變體Puld2的編碼基因(第I到第270位鹼基和第480到783位的鹼基刪除)和普魯蘭酶突變體Puld3的編碼基因(第I到第939位鹼基刪除)。將突變體基因連接到適當的表達載體中並導入大腸桿菌、枯草芽孢桿菌或地衣芽胞桿菌中進行表達，得到N端結構域刪除的普魯蘭酶突變體。
[0031]突變體Puldl及Puld3編碼基因的PCR擴增:利用快速PCR技術，以表達載體pulA/pET-20b (+)為模板，[0032]引入Puldl突變的突變引物為:
[0033]Pu1-d1-F: 5 』 -CATGCCATGGGTAACAGCCAGATCTTC-3，
[0034]Pu1-R: 5，-CCCAAGCTTACTTTTTACCGTGGTCCGGG-3，
[0035]引入Puld3突變的突變引物為:
[0036]Pul-d3-F:5』 -CATGCCATGGACGATCTGGGTAATAACTAC-3』
[0037]Pu1-R: 5，-CCCAAGCTTACTTTTTACCGTGGTCCGGG-3，
[0038]PCR擴增程序設定為:首先，94°C預變性4min ;然後進入30個循環:98°C變性10s，58°〇退火5~721:延伸3min ;最後72°C延伸10min，4°C保溫。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
[0039]PCR產物純化後，連接pMD18T-simple並轉化E.coli JM109，挑取陽性克隆，雙酶切鑑定後，測序。測序正確的突變體質粒經過雙酶切後、膠回收，連接表達載體pET20b(+)，轉化E.coli JM109，提取質粒，雙酶切鑑定陽性克隆，得到pET20b (+) /dl和pET20b (+) /d3。分別將質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，得到能夠表達突變體Puldl和Puld3的兩種重組菌株。
[0040]引入Puld2突變的突變引物為:
[0041]Pul-dl-F:5』 -CATGCCATGGGTAACAGCCAGATCTTC-3』
[0042]Pul-d2-overlap -R:5』 -CACACCGCTTTCTACCTGGCCCAGAGA-3』
[0043]Pul-d2-overlap-F:5』 -GCGTCTCTGGGCCAGGTAGAAAGCGGTGTGAAAACGG』
[0044]Pu1-R: 5，-CCCAAGCTTACTTTTTACCGTGGTCCGGG-3，
[0045]分別以Pul-dl-F/Pul-d2-overIap-R 以及 Pul-d2-overlap-F/Pul-R 為引物，擴增出目的片段A和B。片段A和B的PCR產物作為第二次重疊PCR的模板。向PCR反應體系中加入等摩爾量的片段A和B，不加入引物，交錯延伸10個循環，PCR擴增條件為:94°C 4min ；98°C 10s, 58°C 5s, 72°C 3min，10 個循環後 72°C再延伸 IOmin0 然後加入引物 Pul-dl-F 和Pul-R，擴增 30 個循環，94 °C 預變性 4min ；98°C 10s, 58 °C 5s, 72 °C 2.5min，共 30 個循環；72°C延伸 lOmin。
[0046]PCR產物純化後，連接pMD18T-simple並轉化E.coli JM109，挑取陽性克隆，雙酶切鑑定後，測序。測序正確的突變體質粒經過雙酶切後、膠回收，連接表達載體pET20b(+)，RKE.coli JM109，提取質粒，雙酶切鑑定陽性克隆，得到pET20b(+)/d2。將質粒轉化表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，得到能夠表達突變體Puld2的重組菌株。
[0047](2)天然普魯蘭酶N端截短突變體的表達與純化:
[0048]挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21(DE3)的陽性單克隆於LB液體培養基(含100 μ g/mL氨苄青黴素)生長8~10h，按5%接種量將種子發酵液接到TB液體培養基(含100 μ g/mL氨苄青黴素);大腸桿菌在30°C搖床培養至0D_=0.6，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導胞外表達，並在25°C搖床繼續培養發酵50小時後，將發酵液於4°C、1000Og離心IOmin除菌體，收集離心發酵上清液，並對發酵上清液進行SDS-PAGE蛋白電泳分析。如圖2所示，與天然酶相比，Puldl和Puld2蛋白條帶明顯變多，說明Puldl和Puld2胞外蛋白分泌量得到了明顯提高。而Puld3在發酵上清液中的含量很少，進一步分析發現Puld3表達過程中主要以包含體形式存在，可溶性蛋白極低。因此，天然酶截短突變體中只選擇Puldl和Puld2兩種突變體進行純化和後續的分析。[0049]調節普魯蘭酶突變體的發酵上清液pH到4.5，置於水浴鍋中55°C熱處理I小時，40C UOOOOg離心20min，收集上清液。往上清液中緩慢加入70%的(NH4) 2S04，4°C放置鹽析過夜。4°C、1000Og離心20min,收集沉澱。用20mmol/L磷酸緩衝液復溶沉澱後,在20mmol/L磷酸緩衝液中透析過夜，期間更換2-3次透析緩衝液，通過0.22 μ m膜過濾後製成上樣樣品。採用AKTA蛋白純化儀進行重組蛋白的純化，整個純化過程在層析櫃中進行，控制溫度為4°C。陰離子交換色譜純化步驟:⑴平衡:用5倍體積的20mmol/L磷酸緩衝液平衡DEAE陰離子交換色譜柱；(2)上樣:預先處理好的樣品以lmL/min的流速上樣；(4)洗脫，流速1.0mL/min，進行梯度洗脫，檢測波長為280nm，分部收集含普魯蘭酶酶活的洗脫液；活力組分在50mM pH4.5醋酸緩衝液中透析過夜後，分別得到純化突變體Puldl和Puld2。
[0050]實施例2:疊加突變體的製備。
[0051](I)疊加突變體的構建
[0052]來源於B.deramificans的普魯蘭酶雙突變體D437H/D503Y的2種N端結構域刪除突變體 D437H/D503Y/dl 和 D437H/D503Y/d2:
[0053]將普魯蘭酶雙突變體D437H/D503Y N端的CBM41 —個結構域刪除，命名為D437H/D503Y/dl ;將普魯蘭酶雙突變體D437H/D503Y N端的CBM41和X25兩個結構域刪除，命名為D437H/D503Y/d2。
[0054]2種N端結構域刪除突變體D437H/D503Y/dl和D437H/D503Y/d2的製備方法，以普魯蘭酶雙突變體D437H/D503Y的編碼基因替代B.deramificans的天然普魯蘭酶編碼基因，其它方法與天然普魯蘭酶N端截短突變體的方法相同。
[0055]突變體D437H/D503Y/dl和D437H/D503Y/d2編碼基因的製備:利用快速PCR技術，以表達載體D437H/D503Y/pET-20b (+)為模板，
[0056]引入D437H/D503Y/dl突變的突變 引物為: [0057]Pul-dl-F:5』 -CATGCCATGGGTAACAGCCAGATCTTC-3』
[0058]Pu1-R: 5 』 -CCCAAGCTTACTTTTTACCGTGGTCCGGG-3，
[0059]PCR擴增程序、表達載體及產突變體的重組菌構建方法與突變體Puldl的方法相同。
[0060]引入D437H/D503Y/d2突變的定點突變引物為:
[0061]Pu1-d1-F: 5 』 -CATGCCATGGGTAACAGCCAGATCTTC-3，
[0062]Pul-d2-overlap-R:5，-CACACCGCTTTCTACCTGGCCCAGAGA-3』
[0063]Pul-d2-overlap-F:5』 -GCGTCTCTGGGCCAGGTAGAAAGCGGTGTGAAAACGG』
[0064]Pu1-R: 5，-CCCAAGCTTACTTTTTACCGTGGTCCGGG-3，
[0065]PCR擴增程序、表達載體及產突變體的重組菌構建方法與突變體Puld2的方法相同。
[0066](2)疊加突變體的表達與純化:
[0067]產疊加突變體重組菌株的發酵及純化條件與天然普魯蘭酶N端截短突變體的方法相同。
[0068]重組菌株經過搖瓶發酵並對發酵上清液進行SDS-PAGE蛋白電泳分析。如圖3所示，與D437H/D503Y相比，D437H/D503Y/dl和D437H/D503Y/d2蛋白條帶明顯變多，說明D437H/D503Y/dl和D437H/D503Y/d2胞外蛋白分泌量得到了明顯提高。[0069]普魯蘭酶經過分離純化後，分別得到純化的疊加突變體D437H/D503Y/dl和D437H/D503Y/d2。
[0070]實施例3:本實施例說明酶活分析。
[0071]I)酶活測定方法
[0072]普魯蘭酶酶活性的測定採用3，5_ 二硝基水楊酸發(DNS法)。普魯蘭酶在一定條件下，催化水解普魯蘭糖生成還原糖，3，5- 二硝基水楊酸與還原糖溶液共熱後被還原為顯棕紅色的氨基絡合物，在一定範圍內其顏色的深淺與還原糖的量成正比，故可以在540nm的波長下進行比色，計算酶活。酶活單位定義:在上述條件下，每分鐘催化產生Iymol葡萄糖的酶量作為一個活力單位。
[0073]酶活力測定步驟:
[0074]A.預熱:取2ml的1.5%普魯蘭溶液(50mM pH4.5醋酸bufffer)於試管中，置於60°C水浴鍋預熱IOmin左右，
[0075]B.反應:加入0.1ml樣品酶液,振蕩混勻,準確計時IOmin,加入3ml DNS混勻,放入冰水中終止反應,沸水浴7min,冷卻。
[0076]C.測量:向上述反應體系中加入蒸懼水並定容至15ml的,混勻。在540nm下測量其吸光值並計算酶活力。
[0077]2)發酵液上清及不同細胞組分中酶活力分布比較:
[0078]重組菌株經過搖瓶發酵，發酵液在1000Og離心20min，收集發酵上清液和菌體。菌體用20mmol/L pH4.5醋酸緩衝·液懸浮後，用超聲波破碎儀進行破碎。細胞破碎液在1000Og離心20min，收集上清液為胞內上清，沉澱用緩衝液懸浮並振蕩混勻為胞內沉澱懸液。對胞外發酵上清、胞內上清和細胞沉澱懸液中的普魯蘭酶活力進行測定。
[0079]實驗結果列於表1,天然酶的胞外酶活力僅佔總酶活力的15.4%，突變體Puldl和Puld2胞外酶所佔比例明顯提高，達到52.9%和58.7%，分別是天然酶的3.4和3.8倍(表
5-2)。截短突變體在胞內上清和胞內沉澱中的酶活力佔總酶活力的比例都有所降低，其中胞內上清所佔比例下降最為明顯。
[0080]此外，突變體D437H/D503Y/dl和D437H/D503Y/d2胞外上清酶所佔比例分別為57.3%和60.8%，分別是對照D437H/D503Y的5.3和5.6倍(表1 )。分析發現，兩個突變體的可溶性酶活力(胞外上清和胞內上清)佔總酶活力的80%左右，只有20%左右的酶活力以活性蛋白聚集體的形式存在。而對照酶D437H/D503Y的可溶性酶和活性蛋白聚集體分別佔總酶活力的42.4%和57.6%。由此可見,疊加突變體相對於對照具有更好的可溶性表達的能力，具有更好的應用於發酵生產的潛力。
[0081]表1天然及截短普魯蘭酶突變體的酶活力分布
[0082]
【權利要求】
1.一種普魯蘭酶突變體，其特徵在於對普魯蘭酶或改造後普魯蘭酶N端結構域進行刪除，所述結構域與普魯蘭酶的分泌效率或熱穩定性相關。
2.權利要求1所述的突變體，其特徵在於所述結構域為CBM41、X45、X25結構域或其組合。
3.根據權利要求2所述的突變體，其特徵在於所述結構域為CBM41。
4.根據權利要求2所述的突變體，其特徵在於所述結構域為X45。
5.根據權利要求2所述的突變體，其特徵在於所述結構域為CBM41和X45或CBM41和X25。
6.根據權利要求2所述的突變體，其特徵在於所述結構域為CBM41、X45和X25的組合。
7.根據權利要求1-6任一所述的突變體，其特徵在於所述改造後普魯蘭酶為脫支芽孢桿菌普魯蘭酶雙突變體D437H/D503Y。
8.獲得權利要求1-6任一所述突變體的方法，包括如下步驟: 1)對普魯蘭酶進行分析，確定要刪除的結構域； 2)設計結構域刪除用引物，以攜帶普魯蘭酶編碼基因的載體為模板進行突變並構建含結構域刪除突變體的質粒載體； 3)將突變質粒轉化進宿主細胞； 4)挑選陽性克隆進行發酵培養，純化獲得普魯蘭酶突變體。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述質粒載體為pET系列，pGEX系列，或PUB中的任--種。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於所述宿主細胞為細菌、酵母和真菌細胞。
【文檔編號】C12N15/63GK103571812SQ201310610426
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年11月26日 優先權日:2013年11月26日
【發明者】吳敬, 段緒果, 陳堅 申請人:江南大學